Fibröz Proteinler gerin ve Tedbir Roman Yerçekimi Kuvveti Spektrometresi kullanır gösterilmesi

Özet

Bu amaç, işletme ve roman yerçekimi kuvveti spektrometresi temsilcisi sonuçları gösteren bir adım adım kılavuz.

Özet

Makromoleküler yapısının çalışmada, moleküler mekanizmaları ve fonksiyon aydınlatılması için kritik hale gelmiştir. Proteinlerin yapısal özellikleri kuvvet bağımlılığı test etme yeteneğine sahip, sınırlı, ama önemli birkaç bioinstruments vardır. Ölçeği araştırmacılar, nükleik asitler, enzimler ve yaşam sürdürme çalışma yapan motor protein molekülleri, nanomechanical dünyaya eş ne ​​kadar doğru bir sınırlama parametre olmuştur. Atomik kuvvet mikroskobu (AFM), elektron mikroskobu ile eşit bir mesafe çözünürlüğü ile lifli proteinler doğal yapıları belirlemek için ayarlanmıştır. Ancak, AFM kuvvet çalışmaları, güçleri genellikle tek bir molekülün daha yüksek ^{1, 2} yaşayabilirsiniz. Optik tuzakları (OT), tuzağa boncuk arasındaki göreceli mesafeyi belirleyen çok iyi ve çok küçük ^kuvvetlerle 3 aktarabilir . Ancak, bu çalışma kapsamında moleküllerin doğru mutlak uzunluk vermeyecektir. Moleküler simülasyonlar, bu tür deneylere destekleyici bilgileri sağlar, ama aynı büyük moleküler boyutlarda, uzun zaman dilimlerini, sap ve destekleyen ^{diğer kanıtlar 2,} 4 yokluğunda bazı araştırmacılar, ikna yeteneği sınırlıdır.

Yerçekimi kuvveti spektrometresi (GDS) yeteneklerinin benzersiz bir kombinasyonu sunarak bir araştırmacının cephanelik kritik bir boşluğu doldurmaktadır. Bu cihaz genellikle% 98 veya daha yüksek doğruluk femtonewton aralığı nanonewton aralığı ile güçlerini üretme yeteneğine sahiptir. Mesafe ölçümleri şu anda aşağı beş nanometre ve hassas optik yakalamak için benzer bir göreceli boncuk çifti ayırma mesafeleri mutlak moleküler uzunluğu çözme yeteneğine sahiptir. Ayrıca, GFS germe veya kuvvet denge yakın olduğu uncoiling belirlemek veya ölçülen herhangi bir yapısal değişikliklere karşı yan yana getirmek kademeli güç sağlamak. Bu fizyolojik kuvvet yükleri ^{2 maddesi} uyarınca olayları uncoiling kaç amino asit kalıntıları yer belirlemek için bile mümkün. GFS aksine, herhangi bir tahlil önce kapsamlı bir gücü kalibrasyon var, diğer yöntemler ^gibi kuvvet kalibrasyonu 5 gerektirir. Güçlü diğer yöntemleri tamamlayıcı olarak, GDS hayati proteinlerin ve diğer makromoleküllerin nanomekanik anlayış boşlukları arasında köprü olacak.

Protokol

Roman GFS Yapılandırma Giriş

Düzenli bir ışık mikroskobu, bir ekvatoral montaj, kamera ve bilgisayar [Şekil 1]: GFS birkaç temel bileşenleri içerir. Örnek tutan kapalı bir akış hücre odası GFS tasarımına göre vazgeçilmezdir. Işık mikroskobu kapsamında uzayda farklı yönlerde döndürülebilir, böylece ekvatoryel kundak üzerine monte edilir. Bu yetenek, statik ağırlık vektör yerçekimi kuvveti örnekleri piconewton menzilli kuvvet yükleri aktarabilir örnekleri, vektör ile ilgili dinamik odaklı böylece istismar olanak sağlar. Kamera, ışık mikroskobu oküler lens yerine, bu yönde örnek değişiklikleri kaydedebilirsiniz. Bu ham veri sayısallaştırılmış ve gerçek gücü ve mesafe ölçümleri içine verileri yorumlamak için bilgisayar tarafından manipüle. Kapalı akış odacıklı örnek kaybı olmadan uzayda özgürlüğü tüm dereceler izin verecek şekilde tasarlanmıştır. Odasında odasının yüzeyine yapıştırılmış bir "demirlemiş" boncuk bir ucuna yakın gergin örnek molekülü bulunur. Ters terminus odasının yüzeyinden bir "cep" boncuk bağlı. Bu, yerçekimi kuvveti, böylece bu kadar düşük kuvvet yükleri gergin bir molekül uzanan üzerine hareket olabilir tahlil tampon ücretsiz mobil boncuk [Şekil 2]. Iki boncuk akış odasının yüzey üzerinde oturan çiftleri bir molekül bağlılığını birleştiğinde iyi kullanılabilir çiftleri ayırt etmek biraz tecrübe sürer rağmen basit örnek, mikroskop altında mikroküreler bir çift gibi görünüyor. Sisteme bir değişiklik GFS tutan ve yaylar tarafından askıya alınır bir yüzer platform ektir. Bu yapılandırmada, bir zamanlar örnek yerçekimi kuvveti örnek üzerinde hareket edebilir bir konuma döndürülmüş, platform ve tüm bileşenler sabit bahar karşı düşmüş olabilir. Serbest düşüş civarında, mobil boncuk üzerine etki eden kuvvet sıfıra yakındır ve yaylar maksimum uzantısı, iki kez olduğunca yerçekimi kuvveti ile çarpılır. Bu şekilde, kademeli bir kuvvet / mesafe yanıt farklı kuvvet yükleri tek bir molekülün davranışlarını ölçmek için grafikle gösterilebilir.

1. Microsphere Hazırlık

1. 0.04% 3-iki dakika Aminopropyltriethoxysilane (aseton ile kesilen) cam veya silika boncuk yaklaşık 10 mg Submerge.
2. Iki değişiklik çift distile su ile yıkayın ve 5 dakika boyunca 2000 XG pelet için santrifüj. Süpernatant atın.
3. Kaplin tamponu (0.01 M piridin çift distile su ile kesim ve pH 6,0 'a ayarlayın) 5 ml ekleyin ve bu karışımı kuvvetlice sallayın. Yukarıda açıklandığı gibi santrifüjleyin. Bu adımı üç kez tekrarlayın.
4. Boncuk ıslak kek için, (kaplin tampon gluteraldehid kesmek) 2 ml% 5 gluteraldehid çözüm ekleyin. Çalkalanır.
5. Kaputun altında, oda sıcaklığında 3 saat / gluteraldehid karışımı boncuk döndürün.
6. Yukarıdaki gibi Santrifüj ve süpernatant aspire.
7. Şiddetle sallayarak kaplin tampon 5 ml boncuk yıkayın ve süpernatant santrifüj ve aspire. Bu üç kez daha tekrarlayın.
8. Boncuklar istenilen antikor yaklaşık 15 mcL ekleyin ve şiddetle çalkalanır. Boncuk 16-24 saat boyunca rotasyona tabi tutulmalıdır.
9. Kaputun altında, 1 M glisin su verme solüsyonu 5 ml (glisin çift distile su ile kesme ve pH 7.0 'ye ayarlamak) ekleyin. Bu karışımı kuvvetlice çalkalayın ve 30 dakika çevirin.
10. Santrifüj ve süpernatantı aspirat.
11. Yıkama tamponu (% 0,1 sodyum azid;% 0,1 BSA, 0.15 M NaCl ve 0.001 M EDTA 0,01 M Tris, pH 7.0) 5 ml ekleyin. Şiddetle bu çalkalayınız, santrifüj ve süpernatantı aspirat. Bu adımı üç kez tekrarlayın.
12. Düşük tuz tamponu (0.02 M imidazol; 5 mM MgCl _2; pH 7.0 'ye uyum 0,1 M KCl) tamponu değiştirin. Üç kez tekrarlayın.

2. Örnek Eklenti için Mikroküreler

1. Hazırlanan boncuklar küçük bir miktar alın ve bunları eklemek (partiler arasında çapı büyük bir tutarsızlık varsa, ancak yaklaşık 2 mcL boncuklar her pasta, büyük ve küçük boncuklar 8:1 oranı etrafında kullanımı avantajlıdır.) tahlil tamponu ile mikrosantrifüj tüp. Tahlil tampon kullanarak, yaklaşık 5 mcM protein konsantrasyonu azaltın. Tampon, protein ve boncuklar dahil olmak üzere en az 400 mcL toplam hacmi hazırlayın.
2. (Protein, çok ajite ise, agrega ve işe yaramaz hale), 3 saat boyunca yaklaşık 1 RPM bu karışımın döndürün.

3. Slayt Odası Hazırlık

1. % 0.01 nitroselüloz (amil asetat) ile kalın bir mikroskop lamı ceket. Bu slayt yaklaşık 10 dakika kurumasını bekleyin.
2. Keskin bir cam kesici ile bir oda yapmak için slayt kapsayacak şekilde kesti. Bu dört cam strip gerektirir.
3. Aslında kullanın.kenarının her iki tarafında vakum gres bir karalama karşısında cam ve komisyon bu ORY kenarı.
4. Basın yağ kaplı şeritler kuru nitroselüloz üzerine slayt yüzeyinde bir kutusu oluşturmak için slayt kaplı.
5. Kutu içinde cam yüzeye pipetter dokunarak boncuk / protein karışımı Pipet 2 hakkında mcL.
6. Yaklaşık 20-400 mcL, odanın ne kadar büyük bağlı olarak düşük tuz tampon ekleyin.
7. Zaten kapalı ve tamponlu odasına bitirmek için vakum yağ ile kaplı kutunun üstüne bir kapak kayma basın.
8. Boncuk nitroselüloz kendilerini demirlemek için yeterli zamanımız var, böylece slayt düzeyde bir yere oturup edelim.

4. GFS Veri Toplama

1. GFS sahneye Dağı slayt
2. GFS kamera küçük Microsphere büyük Microsphere ekvatora yakın bağlı olduğu ", boncuk çiftleri" kayıt ve meşru araştırın ne olduğunu izleyin.
3. Potansiyel bir boncuk çifti bulunduğunda, "cep" boncuk slayt yüzey üzerine oturtulmuş olup olmadığını belirlemek için, odak derinliği üzerinden gitmek.
4. Bir kere uygun bir çifti tanımlanır, not açısı mobil boncuk d _max uzak (d _max = birleştiğinde mikroküreler sentroidler arasındaki maksimum mesafe). Kapsamı video satın almak için pozisyon içine taşıyın.
5. GFS seyahat açı d _min, d _max, molekülünün uzunluğuna bağlı olarak 25-90 derece diyebilirsiniz d _dakika kayıt için yeterli olmalıdır.
6. Çifti olarak RECORD d d _{min max} ve geri d _dk gitti.
7. Bu analiz için daha sonra çıkarılmalıdır, böylece arka planda da bir film çekmek için iyi bir fikirdir.
8. GFS damla performans, d _max kapsamı taşımak ve en az saniyede 60 kare hızla açılan kaydetmek. Kritik bir parçası ilk salınım, ancak uzun kayıt süreleri, aynı zamanda dinamik çalışma için kullanılabilir.

5. GFS Veri Analizi

1. Dijital "eşiklenir" bir görüntü içine ham video Dönüşümü ve video her kare her boncuk ağırlık merkezi konumunu belirlemek için ImageJ makro çalıştırmak. Bu açılan video için de.
2. X, Y ve Excel'e ImageJ alan veri dökümü ve puan arsa.
3. Uygun bir boncuk çifti video tarafından satın alındı, grafik gözle görülür bir kambur boncuk (d _min) en yakın olmanın göstergesidir ve grafik apeks d _max konumudur.
4. Bu verileri kullanarak, her bir boncuk yarıçap tam ImageJ belirlenir ve tüm bu bilgiler iç içe denklemi içine konur:
   d = [(g sin α) ² + (g cos α + d _max - g) ^{2] 0.5}
   g = [d _min ² + r _b ² - _(r + r _b) ^{2] 0.5} = r _b günah β
   c = d _max - _r - g
   (D = kütle merkezleri arasındaki mesafe; g = yerçekimi kuvveti; α = paralel derece objektif lens açısı, r _b = mobil boncuk yarıçapı _r = yarıçap demirlemiş boncuk ekseni kapalı eki β = açı ekvator bağlantılı boncuk.
5. Hacmi de verim ve boncuk, mobil boncuk molekülün kazandırır kuvvet yoğunluğu göz önüne alındığında, mobil boncuk takılmış yarıçapı kullanarak çıkarılır solvent kaldırma kuvveti sonra piconewtons hesaplanabilir. Bu yöntem piconewtons gergin bir molekül kuvvet F = V (db) bir (F = kuvvet, V = hacim, d = yoğunluk cam Microsphere, a = ivme ölçer ve nanometre antikor ekleri arasında mutlak molekül süresini hesaplar yerçekimi nedeniyle, b = yerinden su yoğunluğu).

6. Temsilcisi Sonuçlar:

Boncuk hazırlık doğru yapılırsa, hala arada bir boncuk tutam olabilirse de, en az boncuk agregasyonu olacak. Kapsamı ile bakıldığında, odanın içinde eşleştirilmiş olsun veya olmasın boncuk makul bir dağıtım olması gerekir.

Mümkün olduğunca titreşimleri en aza indirmek için önemlidir; bu ya bir hava tablo yapmak için, bir EQ monte tutan bir tripod için özel şok emici ayaklar, veya yayları titreşim izolasyonu için kullanılabilir kullanan sistem.

Mühürlü akış odası ile ilgili bir diğer yararlı ipucu tam olarak inşa edildikten sonra bir seviye tablosunu yaklaşık beş dakika boyunca ayakta izin vermektir. Bu herhangi bir unattached boncuk büyük nitroselüloz tabakası tampon ve dinlenme ile şamandıra sağlar. Slayt yerine tamamlanması üzerine doğrudan monte edilmiş olsaydı, araştırmacı tam anlamıyla görüş alanı üzerinden uçan boncuklar ile başa çıkmak için sürekli olurdu ve bu video edinimi sırasında olur th bozabilire deney. Bu şekilde yapılırsa, boncuk uçuş önemli ölçüde en aza indirilmeli ve temiz bir video sonuçları.

Potansiyel bir boncuk çifti GFS operatör tarafından tespit edildiğinde, bu çiftin davranışlarını izlemek için bir ön döndürme koymak için yararlıdır. Nadiren, büyük boncuk slayt sıkıca yapıştırılmış değildir. Bu durumda daha büyük satın alma süresi boyunca sabit bir pozisyonda boncuk kalış demirlemiş kritik, çünkü çifti kullanan hiçbir faydası yoktur. Çifti istikrarlı ve sergi gelmez "Eğer demirlemiş boncuk rulo," o zaman deneyler için uygundur.

Yerçekimi göre açı değişim karşısında boncuk ayırma mesafeleri bir arsa elde edilen verileri değerlendirmek için kullanılabilir. Iyi bir temsilcisi sonucu bir plato üzerinde küçük ayrımı gösterecek ve mobil boncuk yerçekimi etkisi nedeniyle bağlantılı boncuk kendini kurtarır gibi, grafiğin daha fazla ayrılık gösterecektir. Güzel bir zirveye ulaştı ve d _max denir temel tekrar dönen eğrisi aşağıya doğru başlar kadar bu şekilde devam eder d _min [Şekil 1]. İdeal koşullarda, bu imza simetriktir. Olmayan bir temsili bir sonuç tutarsız desenleri ile hiçbir farklı d _{min-d, max-d} min desen gösteren bir grafik göstermek ya da arasında bir toz parçası vardı, belki de belirten tek bir molekül için çok yüksek büyüklüğü siparişleri ayrımlarını göstermek mobil boncuk sadece ekli olmadığı belki de boncuk, veya. Çifti bulma, çekim, işleme ve analiz süreci, uygunsuz boncuk çiftleri itlaf birçok durdurmak boşluklar vardır. Yani, sürecin sonuna kadar almak ve önceki sonuçlar ile tutarlı bir molekülün uzunluğu varsa, bir çok emin orijinal boncuk çifti temsilcisi ve sonuçları dahil edilebilir. Boncuk çiftleri çekim yaklaşık yarısı, iyi bir gününde, meşru bir veri noktası olmayı yoluyla alınmış olabilir. Örneğin, MF20 ve MF30 antikorlar arasında miyozin sarmal bobin uzunluğu, EM veri ve AFM, 100 nm ^2,7,8,9 yaklaşım veri olarak bilinir. Sonucu bu uzunluğu birkaç kez ise, örnek toplanmış. Burada sunulan sonuçlar, standart GFS rotasyon deneyleri ve 96 nm ± 5 nm mesafe göstermek, [Şekil 2] MF30 ölçümleri ile yakından kabul eder (miyozin subfragment-2 N-terminus bağlar) ve MF20 hangi literatür değerleri çıkarılabilir miyozin (ışık meromyosin bağlanır) antikor ayırma mesafesi [Şekil 3].

Şekil 1 GFS yapılandırma. GFS ana bölümden etiketlenir.

Şekil 2 GFS prensibinin şematik. Sol tarafta en az mesafede demirlemiş boncuk centroid bir mobil boncuk centroid gösterir. GFS döndürülebilir olduğu gibi, mobil boncuk da gergin molekülünün ekseni ile paralel çalışan yerçekimi vektör ile hizalar. Bu pozisyonda, mobil ve bağlantılı boncuk sentroidler arasındaki mesafe maksimum. Sağ üst GFS film temsili bir dilim gösterir. Sağ alt GFS rotasyon geçiren bir görüntü.

Şekil 3 grafiğin sol d _dakika gösteren Temsilcisi sonucu; 17,78 mikron göreceli bir ayrılık d _max ve d boncuklar arasında göreli olarak ayrılması 17.75 mikron temel _etrafında dakika dönüş .

Şekil 4 GFS rotasyon deney ortalama MF20 ve MF30 antikorlar 96 nm arasındaki mesafeyi gösteren Temsilcisi sonuç. Bu S2 yaklaşık uzunluğu temsil eder.

Şekil 5 Miyozin II dimer antikor ve / veya aktin ekleri de dahil olmak üzere GFS ile kullanmak mümkün ekleri göstermek için kullanılır. Farklı farklı bölgelerde farklı GFS stratejilerini ölçmek için, ya da miyozin dimer çubuk etki gücü dik paralel olarak uygulamak veya eklenti olanakları sağlar.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Dijital eşiklenir bir temsili bir film dönüştürürken, bu, video, her çerçeve içinde aynı bölgede korumak için eşiklenir bir görüntü için çok önemlidir. , Bir boncuk çifti boncuk birbirlerinden bağımsız hareket nedeniyle, eşiklenir alanlarda herhangi bir sürüklenme boncuk sentroidler arasındaki izafi mesafeleri önemli bir hata da sürüklenme ve tanıtmak için neden olabilir. Eşik alanı kontrol 5 nm 26 nm mesafe ölçümlerinde hata beş kat azalttı. Ayrıca, mesafe ve kuvvet değerleri ve...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-Aminopropyltriethoxysilane	Polysciences, Inc.	919-30-2
Acetone	Fisher Scientific	A18P-4
Pyridine	Sigma-Aldrich	110-86-1
Glutaraldehyde	Fisher Scientific	G7776
Glycine	Research Organics	BP381-1
Tris	Sigma-Aldrich	9682T
Sodium azide	Amresco	71289
BSA	Sigma-Aldrich	AMR-0332-100G
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
EDTA	MSI	E9884
Nitrocellulose	Sigma-Aldrich	60443
N-N Dimethyl Formamide	Extracted from Large New	D4254
Rabbit skeletal myosin II	Zealand White Rabbits (7-8)	NA
MF30 antibody (9-10)	Developmental Studies Hybridoma Bank	MF30
MF20 antibody (6)	Hybridoma Bank	MF20
Lab microscope	Boreal	WW57905M00
Equatorial mount	Celestron	CG-5
Digital video cam	Sony Corporation	XCDV60
Caliper release	Cabelas	IA-415482
Compression spring	Jones Spring Co.	723
Extension spring	Jones Spring Co.	770
ImageJ	National Institutes of Health	NA
Fire-i drivers & application	Unibrain	3.80
Excel	Microsoft	NA