Hücre Biyolojisi Degrade üreten mikroakışkan Aygıt

Özet

Biz, iyi tanımlanmış mikroçevresinin mekansal ve zamansal degradeleri üretebilir degrade üreten mikroakışkan cihaz mikroimalat için bir protokol tanımlamaktadır. Bu yaklaşımda, degrade üreten mikroakışkan cihaz yönlendirilmiş hücre göçü, embriyogenez, yara iyileşmesi, ve kanser metastazı çalışma için kullanılabilir.

Özet

Hücresel davranışlarının incelenmesi için bir degrade üreten mikroakışkan cihazın imalat ve işleyişi açıklanmıştır. Tam akışkanlar işlemek, yüksek verimli deneyler etkinleştirmek, ve istikrarlı çözünen konsantrasyonu gradyanlar oluşturmak için mikroakışkan bir platform sağlayan deneysel bir araçtır. Geleneksel gradyan jeneratörler, poli (dimethylsiloxane) (PDMS) ile karşılaştırıldığında tabanlı mikroakışkan cihazlar iyi tanımlanmış profiller ile istikrarlı büyüme faktörleri konsantrasyon gradyanlar üretebilirsiniz. Burada, üç ayrı girişleri ile basit degrade üreten mikroakışkan cihazlar geliştirdi. Üç mikro konsantrasyon gradyanlar oluşturmak için bir Mikrokanallı birleştirilir. Epidermal büyüme faktörü (EGF) benzeri bir moleküler ağırlığı ile istikrar ve büyüme faktörü degradelerin şekli floresein isothyiocyanate (FITC)-dekstran tarafından teyit edildi. Bu mikroakışkan cihazı kullanarak, yüksek konsantrasyonlarda maruz fibroblastlar EGF konsantrasyonu degradelere doğru göç ettiğini göstermiştir. Göç eden hücrelerin hücre göç ve hareketlilik yön yönelimi kantitatif hücre izleme analizi ile değerlendirildi. Böylece, bu degrade üreten mikroakışkan cihaz göç eden hücrelerin davranışlarını incelemek ve analiz etmek için yararlı olabilir.

Protokol

A. mikroimalat mikroakışkan degrade üreten cihaz

1. Si gofret, reaktif oksijen plazma (30W, harrick Bilimsel az 5 dakika, NY) ile tedavi edilir.
2. Negatif fotorezist (SU-8 (50), Microchem, MA) Si gofret 1 dakika 1000 rpm'de spin-kaplı.
3. Gofret yumuşak 65 pişirilmiş ° C daha sonra 95 ve 10 dak ° C 30 dakika bir ocak.
4. Gofret UV ışığı (200W) en az 30 mikron özellik boyutu ile bir şeffaflık maskesi ile 3 dakika maruz kalmaktadır.
5. Gofret 65 pişirilmiş yazılan ° C 1 dakika ve 95 ° C de 10 dakika.
6. 100 mikron kalınlığında kanalları ile Si SU-8 fotorezist geliştirici ana kalıp kullanılarak geliştirilmiştir.
7. Gofret mikro içeren bir Petri kabı içerisinde yerleştirilir.
8. Poli (dimethylsiloxane) (PDMS) (Sylgard 184) kalıplar, karıştırma silikon elastomer ve sertleştirici (10:1 oranı) tarafından imal edilir.
9. PDMS karışımı Si ana kalıp üzerine dökülür.
10. Si ana kalıp 10 dakika kabarcıklarını çıkarmak için bir vakum desikatörde yerleştirilir.
11. PDMS 1 ~ 2 saat boyunca 70 ° C'de kür.
12. PDMS kalıpları Si ana kalıptan sıyrılır.

B. deney düzeneği

1. Hücre giriş, çıkış ve beslerken girişler PDMS tabanlı mikroakışkan cihazın keskin zımbalama kullanarak açılmıştır.
2. Geri dönüşümsüz bir cihaz ve bir cam slayt (2 × 3 inç) reaktif oksijen plazma (30W, harrick Bilimsel az 5 dakika, NY) ile yapıştırılır.
3. Polietilen boru (PE 20, Becton Dickinon, MD) beslerken girişler mikroakışkan cihazın içine yerleştirilir ve daha sonra bir şırınga pompası bağlı.
4. Floresein izotiyosiyanat (FITC)-dekstran (MW = 10kD, 10 mcM, Sigma) ve tamponu (PBS, Invitrogen, CA) akışkan cihaz içinde istikrarlı gradyanlar onaylamak için mikroakışkan cihazın içine infüze.
5. Ekstrasellüler matriks (ECM) (yani, fibronektin) 1 saat inkübatör (37 ° C), mikroakışkan cihazın içinde kaplanmıştır.
6. NIH 3T3 fibroblast hücreleri tripsinize ve ayrışmış.
7. Disosiye hücreleri hücre yoğunluğu 2 × 10 ⁶ hücre / ml mikroakışkan cihazı (800 mm genişliğinde) yüklenir.
8. 2 ml medya ve 50 ng / ml epidermal büyüme faktörü (EGF), bir şırınga pompası (0.05 ul / dk) kullanarak çözünen gradyanlar üretmek için bir mikroakışkan cihazın içine doluyor.
9. Hücreler her 5 dakikada bir inverted mikroskop (Nikon TE 2000) kullanarak gerçek zamanlı takip edilmektedir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Hücreler yüksek konsantrasyonlarda doğru göç eden bir mikroakışkan cihaz EGF istikrarlı konsantrasyon gradyanlar maruz. Hücre göçü, kemotaktik indeks, göç hücrelerinin motilite yönlü yönlendirme hücre izleme analizi ile araştırıldı. Bu nedenle, bu degrade üreten mikroakışkan platformu kanser metastazı, embriyogenez ve akson rehberlik eğitimi için yararlı olabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dextran-FITC	Reagent	Sigma-Aldrich	FD10S	Fluorescein isothiocyanate (FITC) conjugated-dextran (10kD)
hr-EGF		Invitrogen	13247-051	human recombinant Epidermal growth factor
PDMS		K.R. Anderson Co.	2065622	Poly(dimethylsiloxane) (PDMS), Dow Corning Sylgard 184 (8.6 lb)
Negative photoresist		MicroChem Corp.	SU-8 50
Si wafer				silicone wafer, 4 inch
Petri dishes
Polyethylene tubing		BD Biosciences	PE 20
PBS		Invitrogen
Fibronectin
NIH 3T3	cell-line			fibroblast cells
Inverted microscope		Nikon Instruments	TE 2000