Canlı Hücre Kalsiyum Görüntüleme siRNA aracılığı ile gen susturma ile birlikte Ca tanımlar 2 + ER Membran Kaçak Kanallar ve Düzenleme Mekanizmaları

Özet

Endoplazmik retikulum, protein biyogenezi ve kalsiyum homeostazında önemli bir rol oynar. Biz, bize Ca2 + kaçak kanal rolü ele almak ve kendi varsayılan düzenleyici mekanizmaların karakterize sağlayan deneysel bir sistem kurduk. Bu sistem siRNA aracılı gen susturulması ve canlı hücre Ca2 + görüntüleme içerir.

Özet

Memeli hücrelerinde, endoplazmik retikulum (ER), proteinin biyogenezi yanı sıra ^kalsiyum 1 sinyalizasyon önemli bir rol oynar . ER membran heterotrimeric Sec61 kompleksi ER lümenine yeni sentezlenmiş polipeptitler için sulu bir yolunu sağlar. Son çalışmalar çeşitli laboratuvarlarda bu heterotrimeric kompleksi de geçici Ca ^{2 +} kaçak kanalları ^2-8 oluşabilir önerdi. Bu kavram için en önemli gözlem, doğmakta olan polipeptidlerin bu sürüm puromycin ^{Ca 2} + ER geçici serbest bırakmak için neden ribozom ve Sec61 karmaşık oldu . Ayrıca, ER luminal protein BIP Sec61 karmaşık ^9,10 düzeyinde iyon geçirgenliğini önlemede katkısı olduğunu in vitro olarak gözlenmiştir vardı. Biz, bize doğrudan potansiyel Ca ² + kaçak kanal olarak Sec61 kompleksinin rolü ele almak ve onun varsayılan düzenleyici ^{mekanizmaların} 11-13 karakterize sağlar deneysel bir sistem kurduk . Bu sistem siRNA aracılı gen susturulması ve canlı hücre Ca ^{2 +} görüntüleme ¹³ birleştirir. Hücreler, kodlama ve çevrilmemiş bölge (UTR), sırasıyla, SEC61A1 gen ya da negatif kontrol siRNA yöneltilen siRNA'lar ile tedavi edilir . Tamamlama analizde, hücreler wild tip SEC61A1 gen siRNA dayanıklı ifade sağlayan bir IRES-GFP vektör ile ortak transfekte vardır. Ardından hücreler değişiklikleri eşzamanlı olarak sitozolik Ca ^{2 +} konsantrasyonunun bir floresan mikroskop aracılığıyla hücrelerinin sayısı izlemek için oranlı metrik Ca ^{2 +} göstergesi Fura-2 ile yüklenir. Puromycin, küçük molekül inhibitörleri ve thapsigargin gibi çeşitli ajanların etkisi, Ca ^{2 +} kaçak değerlendirilmesi sitozolik Ca ^{2 +,} aynı zamanda sürekli ölçüm sağlar. Bu deneysel sistem bu pasif Ca ^{2 +} efflux sınırı protein ve mekanizmalar karakterize, çeşitli hücre tipleri, ii ER pasif ^{Ca 2} + efflux farklı ER membran proteinlerinin katkısı) değerlendirmek i) bize eşsiz fırsatlar verir ve iii) ilgili bileşenleri hastalık bağlantılı mutasyonların etkilerini incelemek.

Protokol

1. Stok çözelti hazırlanması

1. Hazırlayın kalsiyum ücretsiz tampon (140 mM NaCl, 5 mM KCI, 1 mM MgCl _2, 0.5 mM EGTA, 10 mM HEPES-KOH 10 mM glukoz, (pH 7.35)).
2. Çözünür Fura-2 1 mM stok solüsyonu elde etmek için DMSO'daki AM. Bir girdap kullanarak çözüm homojen açık sarı olana kadar karıştırın. Fincan ışıktan koruyun. Sulandırınız Fura-2 stok solüsyonu 1 ml Dulbecco'nun modifiye kartal orta (DMEM) HeLa hücrelerinde yükleme için 4 mcM bir final konsantrasyon% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin içeren içine.
3. Distile su (pH 7.0) 12.5 mM puromycin stok solüsyonu hazırlayın. -20 ° C'de saklayın alikot 500 mcM puromycin nihai konsantrasyonu kalsiyum ücretsiz tampon 12,5 mM puromycin stok solüsyonu sulandırınız.
4. 1 mM Stok çözelti elde etmek için DMSO'daki thapsigargin eritin.
5. 1 mg ophiobolin çözünür 20 ul kloroform ve daha sonra 25 ul DMSO ile karıştırın. Mikrosantrifüj tüp kloroform buharlaşıncaya kadar açık kalır. Böylece son ophiobolin konsantrasyonu 100 mM. -20 ° C'de saklayın alikot Önce, nihai konsantrasyonu 100 mcM kalsiyum ücretsiz tampon stok çözümler sulandırmak kullanmak. Böylece, canlı hücre görüntüleme için son DMSO konsantrasyonu% 0.1 aşmamaktadır.
6. -20 ° C'de 10 mM ve mağaza alikotları bir konsantrasyon DMSO'daki trifluoperazin çözülür Kalsiyum ücretsiz tampon kullanmadan önce 10 mcM bir final konsantrasyon stok solüsyonları sulandırınız. Ophiobolin A gibi canlı hücre görüntüleme Böylece son DMSO konsantrasyonu% 0.1 'den değildir.
7. 20 mcM stok solüsyonu hazırlamak için RNaz ücretsiz su siRNA'lar (SEC61A1 siRNA, SEC61A1 UTR siRNA ve kontrol siRNA) çözülür. Bir vorteks ile karıştırın ve göz çözünürleştirme gözlemlemek. Mağaza 50 ul alikotları -20 ° C'de

2. HeLa hücreleri gen susturma

ER Ca ^{2 +} efflux belirli bir protein katkısı incelemek üzere, söz konusu genin iki farklı siRNA'lar (Şekil 1) ile verimli bir şekilde susturulur. Buna ek olarak, susturma etkisi ilgili vahşi tip genin ifade üstesinden gelinmesi gerekir. Genelde biz sırasıyla faiz gen kodlama ve kodlama olmayan (UTR) bölgesinde, yöneltilen siRNA'lar kullanın. UTR yönettiği siRNA istihdam tamamlama için uygun bir yol sağlar.

1. Tohum 5.2 x 25 mm kapak kayma (poli-L-lisin (1 mg / ml) 200 ul 1 saat önceden tedavi) ile 6 cm kültürü çanak, ¹⁰ 5 HeLa hücrelerinde (ATCC yok. CCL-2 ) Dulbecco'nun modifiye kartal (DMEM) orta,% 5 CO ₂ (son hacim 3.9 ml) ile nemlendirilmiş bir ortamda% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve 37% 1 penisilin / streptomisin ve inkübe ° C içeren.
2. SEC61A1 siRNA, SEC61A1 UTR siRNA, ya da üreticinin talimatlarına (20 nM siRNA final konsantrasyon) göre HiPerFect Reaktif kullanarak bir negatif kontrol siRNA hücreleri Transfect . Kısaca, gerçek transfeksiyon prosedürü önce, ayrı bir mikrosantrifüj tüp içinde taze siRNA'lar hazırlayın: OptiMEM 80 ul çözünmüş her siRNA 4 ul (20 mcM) 20 ul HiPerFect transfeksiyon reaktif ekleyin. Bu karışımı hafifçe vortekslenmiş ve 10 dakika oda sıcaklığında inkübe edilir. SiRNA karışımlar (104 ul) numaralı seribaşı 5.2 x 10 ⁵ HeLa hücreleri (3.9 ml) damla damla ekleyin.
3. 24 saat sonra, orta (3,9 ml) ve aynı siRNA karışımı (104 ul) ile ikinci kez hücreleri transfect.
4. Western Blot analizi ile susturma değerlendirin. % 80 üzerinde olmalıdır. Hücre kültürü çanak hücreleri yıkayın fosfat tamponlu salin (PBS) ve DMEM onlara hasat. Kontes Otomatik Hücre Sayıcı istihdam hücreleri saymak. Proteaz inhibitörü (3 mg / ml Pepstatin A, 3 mikrogram / ​​kokteyl ile desteklenmiş (10 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 3 mM MgCl _2,% 0,5 NP40) hücrelerin hücre lizis tamponu Lyse ml Leupeptin, 3 mg / ml Antipain, 3 mg / ml Chymastatin) SDS-örnek tamponu (ile karıştırın ve 60 mM Tris-HCl, pH 6.8,% 2 SDS,% 10 gliserol,% 5 β-mercaptoethanol,% 0.01 'mavi bromphenol ) 10.000 hücre / ml son bir konsantrasyon elde etmek için. Isı örnekleri 56 ° C de 15 dakika ve daha sonra, parça DNA bazı cam boncuklar ve 20 dakika için vorteks ekleyin. Laemmli-tipi SDS-PAGE (genellikle ayıran jel polyacrylamid% 15) tarafından her bir numune ayrı ayrı 20 ul. ("Islak-leke") transfer tamponunda 3 saat veya gece boyunca (100 mM Glycin, 12,5 mM Tris-HCl) 400 mA sabit electroblotting PVDF membran ayrılmış proteinler aktarın. Daha sonra, sonra% 5 (w / v) oda sıcaklığında 30 dakika PBS, düşük yağlı kuru süt ve blok tavşan Sec61α C-terminus yöneltilen birincil antikor leke ortaya çıkarmak ve bir anti-β-aktin- fareden antikor. PBS-TritonX-100 (% 0.05) leke yıkayın ve tsırasıyla, 5 dakika süreyle PBS içinde WICE. Primer antikor görselleştirin ECL Plex keçi anti-tavşan IgG-Cy5 veya ECL Plex keçi anti-fare IgG-Cy3-konjuge ve Resim Quant TL yazılımı 7.0 ile birlikte Typhoon-Trio görüntüleme sistemi. SEC61A1 gen durumda, maksimum susturulması etkisi genellikle 96 saat sonra ilk transfeksiyon görülür. Bir temsilci deneyi Şekil. 2.

3. HeLa hücreleri, tamamlama

SEC61A1 sessizliğini fenotip kurtarmak için, SEC61A1 cDNA bir pCDNA3 iç ribozomal giriş sitesinin çoklu klonlama sitesi (MCS) (IRES) GFP-vektör sitomegalovirüs (CMV) organizatörü, MCS, içerdiği yerleştirildi IRES, artı, yeşil fluoresan protein (GFP) kodlama dizisinde.

1. Ilk siRNA transfeksiyon sonra 48 saat, döviz ikinci kez orta (3,9 ml) ve üretici protokolü (Fugene HD vektör son oranı olan 4 mg göre Fugene HD kullanarak boş vektör veya plazmid SEC61A1 ifade ya da hücrelere dönüşümü 16 ul Fugene HD vektör). Kısaca, dönüşüm işlemi önce, ayrı bir mikrosantrifüj tüp içinde taze plazmid hazırlamak: OptiMEM 80 ul çözülür her plazmid 4 mg 16 ul Fugene HD dönüşüm reaktif ekleyin. 10 dakika oda sıcaklığında yavaşça girdap bu karışımı ve kuluçkaya yatmaktadır. 5.2 numaralı seribaşı damla damla plazmid karışımı (0.1 ml) x 10 ⁵ HeLa hücreleri (3.9 ml) ekleyin.
2. Plazmid ifade, kalsiyum görüntüleme ve hasat öncesi floresan mikroskopi tabi kültür kaplarına 48 saat sonra. Gerekirse daha iyi floresan sinyalleri için PBS tarafından DMEM yerine. Soğutmalı CCD kamera ile donatılmış bir floresan mikroskop floresan görüntüleri kaydedin. Dönüşüm verimliliği aydınlık modunda sayılır ve% 80 üzerinde olmalıdır hücreleri tarafından GFP floresan görüntüleyen hücrelerinin sayısına bölünmesi ile tespit edilebilir. Tipik bir sonuç Şekil gösterilir. 3.

4. Canlı hücre kalsiyum görüntüleme

1. Ölçümü, önce 3,5 cm ayrı bir kültür çanak transfekte HeLa hücreleri ile kaplı kapak kayma aktarın. Fura-2, 25 ° C ^karanlık 11,12 45 dakika için 1 ml DMEM AM 4 mcM hücreleri yükleyin .
2. Fix iMic metal odası, 25 mm kapak kayma ve hücreleri iki kez yıkayın ve kalsiyum ücretsiz tampon (her seferinde 300 ul) kuluçkaya yatmaktadır.
3. Polikrom V ile 340 nm ve 380 nm dönüşümlü heyecan verici bir iMic mikroskop veri toplama ve 510 nm (:; yayıcı, 605/70 nm ışın dağıtıcı, 565 nm Filtre seti) yayılan floresan ölçüm başlayın. Her 3 s. 20-50 hücre / çerçeve içeren örnek resimleri Tutanak Fura-F340 ve F380, sırasıyla 340 ve 380 nm arka plan çıkarılır floresan karşılık oranları F340/F380, 2 sinyal.
4. 1 dakika sonra, kalsiyum ücretsiz tampon ya da aynı tamponu ile puromycin ile hücre tedavisi (500 mcM). Alternatif olarak, küçük bir molekül inhibitörü (10 mcM trifluoperazin veya 100 mcM ophibolin A) ile veya kalsiyum ücretsiz tampon ile hücre tedavisi.
5. 2 ya da 10 dakika süreyle oranlı metrik ölçümleri gerçekleştirilmektedir sonra, thapsigargin eklemek (1 mcM) ve ölçümler devam etmektedir.
6. Sonunda, cytoslic [Ca ^{2 +]} oranı ölçümleri kurulmuş bir kalibrasyon yöntemi ile tahmin edilmektedir. ² Excel 2007 ve Menşe 6.1 veri analiz.

5. Temsilcisi Sonuçlar:

Şimdiye kadar, SEC61A1 gen susturulması kalsiyum etkileyip etkilemediğini soru (Ca ^{2 +)} ER (Şekil 1) kaçak ele aldı. SEC61A1 gen 96 saat için HeLa hücrelerinde iki farklı siRNA'lar tarafından susturuldu. Hücre büyümesi ve canlılığı pek etkilenmez susturma, yarı-permeabilize hücrelerinin ER içine protein taşıma neredeyse tamamen inhibe olmuştur. Ayrıca, SEC61A1 susturuldu hücreleri ER Ca ^{2 +} kaçağı açısından ciddi etkilendi. SEC61A1 gen ekspresyonu ile gen susturma etkisi tersine dönmüştür. Böylece, tüm çekirdekli hücreleri ER membran bulunan Sec61 kompleksleri Ca ^{2 +} homeostazı çok önemli bir rol oynaması bekleniyor olabilir Ca ^{2 +} kaçak kanal oluşturur. Ancak, ER membran Sec61 kompleksleri oluşan kontrolsüz iyon geçirgenliğini, su dolu geniş gözenekler varlığı, ciddi Ca ^{2 +} ER lümenine sitoplazmada, hücre içi için önemli bir mekanizma içine düzenlenmiş bir sürümü ile müdahale . sinyalizasyon. Biz memeli Sec61α sitozolik N-terminalindeki bir kalmodulin (CAM) bağlayıcı motifi tespit bağlı CaM ama Ca ^{2 +-nanomolar} yakınlık ve sırası özgüllüğü ücretsiz apocalmodulin değil. Hücresel düzeyde, iki farklı CaM antagonistleri Ca uyarılmış ^{2 + değil Sec61 kanalları (Şekil 4 ve 5) yokluğunda varlığında ER bırakın. İkincisi Sec61 kanallar Sec61α IQ motifi mutasyonlar içerdiği olduğu görülmemiştir. Böylece, Ca 2 +-CaM Ca 2 sınırlayıcı + sızıntı ER (Şekil 6) yer almaktadır.}

Şekil 1. Akış şeması. Ayrıntılar için metne bakınız.

Şekil 2 verimliliği susturmak için veri analizi. Susturma (yükleme) Sec61α ve β-aktin yöneltilen antikorlar kullanılarak Western-blot analizi ile değerlendirildi. Primer antikor ECL Plex sekonder antikorlar ve floresan görüntüleme kullanılarak görüntülendi.

Şekil 3 transfeksiyon verimliliği için Veri analizi. Görüntüler soğutmalı CCD kamera ile donatılmış bir floresan mikroskop kaydedildi. Dönüşüm verimliliği aydınlık modunda sayılan hücreleri tarafından GFP floresan görüntüleyen hücrelerinin sayısına bölünmesiyle tespit edilebilir.

HeLa hücrelerinin canlı hücre kalsiyum görüntüleme veya SEC61A1 siRNA ve CaM-antagonist ophiobolin A. HeLa hücrelerinde varlığı ya da yokluğu varlığı Şekil 4 Ekran görüntüleri SEC61A1 (B) veya yöneltilen siRNA ile tedavi edildi negatif kontrol siRNA (A) 96 saat olarak belirtilmiştir. Bu hücreler, kalsiyum göstergesi Fura-02:00 ile yüklenen ve Ca ² inkübe ⁺ buffer sonra 0.5 mM EGTA, tampon ya da ophiobolin (Ophio A) içeren ücretsiz tampon eklenir ve inkübasyon devam etti. 10 dakika sonra, Ca ^{2 + serbestleşmesi,} dış Ca ² yokluğunda thapsigargin (TG) uygulanarak başlandı ⁺ ve inkübasyon devam edildi. Belirtilen zamanlarda sürekli kalsiyum görüntüleme ekran görüntüleri alınmıştır.

Şekil 5, canlı hücre kalsiyum görüntüleme deneyleri için Veri analizi . (A) Şekil tasvir gibi bir dizi deneyler Kinetik ve kantitatif analiz. 4A. Cytoslic [Ca ^{2 +]} kurulmuş bir kalibrasyon yöntemi ² oranı ölçümlerinden tahmin edilmiştir. Thapsigargin etkisi bar diyagram olarak gösterilmiştir. (BD) Hücreler 48 saat süreyle kontrol siRNA veya belirtilen SEC61A1-siRNA ile tedavi edilen ve daha sonra kontrol vektörü (C), ya da plazmid SEC61A1 ifade (C), ya da belirtildiği gibi plazmid mutant SEC61A1 ifade (D) ya ile dönüştürülmüş. Olarak Şekil 4 ve 5a sonra 48 saat, kalsiyum görüntüleme deneyleri yapılmıştır. Sitozolik Ca ² değişiklik istatistiksel analizi ^+, A gösterildiği sunulan gibi deneylerde thapsigargin eklenmesinden sonra konsantrasyon . P değerleri <0.001 anlamlı olarak eşleştirilmemiş t testi ile belirlendi ve üç yıldız işaretleri (***), NS, anlamlı değil gösterilir. Incelendi hücrelerin numaraları gösterilir. Ortalama değerler verilmiştir, hata çubukları standart hata (SEM) temsil eder. Biz bu örnekleri ref adapte olduğunu unutmayın. 13.

Şekil 6 Bu veriler Sec61 kompleksi doğmakta olan zincirler serbest bırakılması gerçekten ER ve Sec61 kompleks sitozolik ağız çevresinde bir kalsiyum nanodomain oluşumu kalsiyum salınımını yol açtığını göstermektedir. Bu kalsiyum kalmodulin bağlı ve kalsiyum kalmodulin Sec61 kompleksi kapanır. "

Tartışmalar

Memeli hücrelerinde, endoplazmik retikulum (ER), proteinin biyogenezi yanı sıra kalsiyum sinyalizasyonu önemli bir rol oynar. Burada, bize, doğrudan bir potansiyel Ca ² + kaçak kanal rolü adresi ve varsayılan düzenleyici ^mekanizmalar 13 karakterize sağlayan deneysel bir sistemi tarif var . Bu deneysel sistem bu pasif Ca ^{2 +} efflux sınırı protein ve mekanizmalar karakterize, çeşitli hücre tipleri, ii ER pasif ^{Ca 2} + efflux farklı ER membran proteinlerinin katkısı) değerlendirmek i) bize eşsiz fırsatlar verir ve iii) ilgili bileşenleri hastalık bağlantılı mutasyonların etkilerini incelemek.

Biz sadece canlı hücreler analiz edilmelidir notu ve bu genel canlılığı% 80 üzerinde olmalıdır. Bu nedenle, hücre canlılığı rutin üreticinin protokole göre, Nükleer-ID mavi / yeşil hücre canlılığı reaktifi istihdam değerlendirilir. Ayrıca, değişikliklerin sitozolik Ca ^{2 +} konsantrasyonu istatistiksel analiz zorunludur. Bu nedenle, deneyler en az 20 hücre, her durum için tek bir deneyde analiz edilmesi gereken hücre dört farklı gruplar ve iki lamelleri yapılmalıdır. Biz kapak fişleri tohumlama sonra aynı zamanda çeşitli deneyler yapılmalıdır olduğuna dikkat edin.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktifin Adı	Şirket	Katalog numarası
DMEM + GlutaMAX	Invitrogen	31966
OptiMEM + GlutaMAX	Invitrogen	51985
FBS	Biochrom	S0115
Penisilin / Streptomisin	PAA	P11-010
HiPerFect	Qiagen	301707
Fugene HD	Roche Diagnostics	04709713
Nükleer-ID Mavi / Yeşil hücre canlılığı reaktifi	Enzo Yaşam Bilimleri	ENZ-53.004
Fura-02:00	Invitrogen	F-1221
Puromycin	Sigma	P 7255
Thapsigargin	Invitrogen	T-7459
Ophiobolin A	Enzo Yaşam Bilimleri	ALX-270-109
Trifluoperazin	Sigma	T 6062
Kontes ® Otomatik Hücre Sayıcı	Invitrogen
Typhoon-Trio görüntüleme sistemi	GE Healthcare
DS-5MC kamera ile TE2000-S mikroskop	Nikon
polikrom V ile iMic mikroskop	Fotonik Kadar