Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.
Method Article
Farklı kortikal tabaka halinde ağlar, duyusal bilgileri kodlamak nasıl kortikal devre anlayışımızın temel bir konudur. Burada, kortikal katmanları belirlemek için tek birimler ve yerel alan potansiyelleri ve mevcut analizleri kaydetmek için multi-contact laminer elektrotlar kullanan elektrofizyolojik teknikler açıklanmaktadır.
Kortikal katmanlar neokorteks yerel ağlarda son derece tekrarlayan oluşan 1-4 boyunca her yerde yapılardır. Son yıllarda önemli bir ilerleme, kortikal farklı katmanları 5-8 nöronların yanıt özelliklerinde farklılıklar anlayışımız, ama hala orada olup olmadığını ve ne nöron popülasyonları laminar özel bilgileri kodlamak hakkında bilgi almak için sol büyük bir oldu şekilde.
Mevcut çok elektrot dizisi teknikleri, kortikal yüzey boyunca birçok kortikal alanı milimetre çapında yanıtlarını ölçmek için bilgilendirici, laminer kortikal devreler sorunu yaklaşım uygun olmasına rağmen. Burada bizim yöntem çoklu-temas laminer elektrotlar kullanan birincil görsel korteks (V1) kortikal katmanlar arasında bireysel nöronlar ve yerel alan potansiyelleri (LFPs) kurma ve kayıt için mevcut (Şekil 1; Plextrode U-Probe, Plexon Inc.)
Dahil yöntemler kayıt cihazı inşaat, kortikal tabakalarının belirlenmesi, ve açık alanların bireysel nöronların belirlenmesi. Kortikal katmanları belirlemek için, tam sahada parladı uyaranlara kullanarak zaman serisi LFP uyarılmış yanıt potansiyeller (ERP) ölçer. Daha sonra katman 4 tabanı (lavabo, katman 4 içinde daha sonra granüler tabaka 9-12 olarak anılacaktır) lavabo-kaynak yapılandırma eşlik polarite inversiyon tanımlamak için kaynak akım yoğunluğu (CSD) analizi gerçekleştirmek . Akım kaynak yoğunluk yerini, yönünü ve transmembran akım yoğunluğu, bizi tek bir penetrasyon 6 tüm katmanları, 11, 12 kayıt elektrotları doğru pozisyonu sağlayan bir dizin sağladığından yararlıdır.
1. NAN Microdrive inşaatı
NAN elektrot çekiş sistemi ile birlikte U-Probe kullanın. Bu sistemi kurmak 2-3 saat gerekiyor, ancak bir kez inşa değiştirmek çok basittir. Biz 4-kanal tabanı (Şekil 2a) içeren NAN kule, montaj başlar NAN odası (Şekil 2b), 1 mm aralığı (Şekil 2c), 1-4 vida mikro sürücülerindeki (Şekil 2d), 1 ızgara -4 kılavuz tüpleri (Şekil 2e, 500 mikron çapında ve yaklaşık 5-7 cm kesme) ve 1-4 Microdrive kuleleri (Şekil 2f). Basitlik için, bir kule ve bir U-Probe ile NAN sistemi oluşturmak için prosedür anlatacağız. Tüm malzemeler varsa bir eğitimden sonra, bu prosedür genellikle 2-3 saat sürer.
2. U-Probe sterilizasyon
Laminer elektrot Plextrode U-Probe Plexon A.Ş. 'den satın alınan ve 2000 $ civarında bir fiyata - 4000 $. Iletişim siteleri, sitelerin yapılandırma ve çapı her site sayısı: fiyat üç ana yönlerini bağlıdır. Şu anda, doğrusal bir yapılandırma ile 16-kanal versiyonu ve bir kişi çapı 25 mikron kullanıyor. Önemlisi, U-Probe kalınlığı, doğrudan temas çapı ile ilgili. Deneylerde, 25 mikron çapı 360 mikron kalınlığına eşit kişiler, her zaman kullanmışlardır. Sürüm modeli için geçerli maliyet yaklaşık 3500 $ dolar. U-Probe jumper ve topraklama teli ve satın alma tarihinden itibaren yaklaşık 4-6 hafta teslimat için kurşun-time bir elektrot halinde paketlenmiş geliyor.
3. U-Probe ilerlemek kayıt için
Dura gücü ve kalınlığı olgular arasında son derece değişken olduğu göz önüne alındığında, U-Pro ilerleyen genel bir yöntemin uygulandığıNAN Microdrive sistemi kullanıyor olması. Önemli olan, her U-Probe her rehber empedans ve U-Probe için genel ranger ayrıntılı bir analiz ile birlikte gelir. Olan kişileri empedanslar M 0.3-0.5 arasında değişmektedir elektrotlar kullandı. Şu anda bir empedans Plexon satın alma için kullanılabilir test ama ne yazık ki, bizim kayıtları zamanda bu cihaz mevcut değildi vardır. Sonuç olarak, biz empedans ayrıntılı bir analiz yapmak mümkün olmuştur.
4. Kortikal tabakaların tanımlanması ve doğrulanması
Biz uyarılmış yanıt potansiyel (ERP) paradigma ve kaynak akım yoğunluğu (CSD) analizi kullanarak kortikal katmanları belirlemek için bir prosedür hayata geçirdik. Bize doğru tüm katmanları tek bir penetrasyon kaydetmek için elektrot pozisyonu sağlayan, yerini, yönünü ve transmembran akım yoğunluğu bir dizin sağlar çünkü CSD dayanmıştır. Aslında, Charles Schroeder ve arkadaşları daha önce laminer kayıt, microlesion ve 9-12 V1 kortikal katmanları fonksiyonel kimlik ERP / CSD yöntemin etkinliğini doğrulamak için histolojik yeniden yapılanma kombine var. Diğer yöntemler kullanarak kendiliğinden üretilen salınımlar kortikal kortikal iğ gibi derinlik ve yukarı / Aşağı devletler 13-15 tanımlamak için kullanılmaktadır.
Bu analiz için, U-Probe eşit aralıklı temas boyunca LFP zaman serisi 2. mekansal türevine göre CSD hesaplar MATLAB (iCSD araç kutusu kullanan http://software.incf.org/ Yazılım / csdplotter / home ) 9,10,16,17.
5. Bireysel nöronlar ve açık alan eşleme tanımlanması
U-Probe birden fazla tek birimleri izole ve kayıt ile büyük bir başarı oldu. Tipik bir kayıt üzerinde, 6-10 iyi izole birimleri ve 14-16 yerel alan potansiyeli sinyalleri bekleyebilirsiniz. Tek birimler bulma tek elektrotlara göre de U-Probe ile daha güvenilir. Biri tam 16 elektrotlar ilerlemek için gerekli tüm donanım kullanmak için olsa bile, onlar tam olarak U-Probe ile kortikal katmanları bir fonksiyonu olarak bir ağ nüfusu keşfetmek mümkün olmazdı. Son olarak, genellikle 30-40 sızmalar, aynı U-Probe ile kaydedebilirsiniz.
6. Temsilcisi Sonuçlar: tek birimlerinin Kayıtlar ve birincil görsel korteks kortikal katmanlar arasında LFPs
Laminer elektrotları kullanarak analizinde en önemli adımlardan biri, güvenilir kortikal katmanları belirlemek ve birçok saat ve oturumlar boyunca bu kimlik doğrulamak için. Bu nedenle, biz, tam sahada parladı uyarıcı (Şekil 3a) yanıt laminer rehber boyunca LFPs uyarılmış yanıt potansiyeller (ERP) ölçülür. Şekil 3b kortikal katmanları belirlemek için geçerli kaynak yoğunluğu (CSD) hesaplamak amacıyla elde etmek için bilgi türünü bir örnek sağlar. Daha sonra katman 4 üssünde lavabo-kaynak yapılandırma eşlik polarite inversiyon tanımlamak için CSD LFP zaman serisi analizi istihdam. Şekil 4a, zamanın bir fonksiyonu olarak, kortikal derinliği karşısında kortikal katmanları yerelleştirilmesine CSD analizi (SG), granül (G) ve infragranular (IG) katmanları hatta dört saat kayıt oturumu başladıktan sonra sabit kalmıştır supragranular pozisyonunu göstermektedir. Şekil 4b, belirli bir katmana atanan bu kişiler ortalama temsil CSD izleri içeren bu örnekte, granüler tabaka ~ 50 ms CSD genlik belirgin bir düşüş uğrar. Bu analiz (0 mikron granüler tabaka referans olarak görev büyük lavabo-kütle merkezi ile temas) sırasıyla supragranular ve infragranular katmanları granüler katmanının üstüne ve altına elektrot kişileri atamak için bir referans olarak görev yaptı.
Laminer elektrot kullanarak başka bir eleştirel analizi doğru tespit etmek ve nöron 'açık alan yerelleştirilmesine. Bu prosedür, nöronlardan gelen en güçlü tepki oluşturmak için uyaran konumlandırma için hayati önem taşımaktadır. Şekil 5a, birincil görsel cort nöron iki alıcı alan parsellerin bir örnektirex (V1). Bu parsellerin kökenli odaklanma noktası, merkezi siyah bir bilgisayar ekranında görüntülenen bir küçük beyaz bir daire. Bu araziler renk, dinamik bir ters korelasyon uyarana karşı tepki olarak, her nöron ateşleme hızı temsil ediyor. Biz belirli bir deneme (örneğin, bir sinüs dalga ızgara) için uyarıcı pozisyon için bu bilgileri kullanabilirsiniz. Sunulmaktadır Uyaranlar alıcı alanında yerleri kapsayacak şekilde eş zamanlı olarak kaydedilen tüm nöronların ortalama alıcı alan boyutundan daha büyük.
Kortikal katmanları belirlemek ve en iyi açık alanı konumunda uyaran pozisyonundan sonra hayvan sabitleme ya da ayrımcılık görevlerini gerçekleştirir, biz çeşitli görsel uyaranlara mevcut olan deneysel protokol devam edebilirsiniz. Deney sonra, aynı kanala kaydetmek için tek birimler izole diken-dalga formu analizi gerçekleştirmek. Bu prosedür genellikle ana biraz zaman alır ve yeni bir analiz yazılımı ve teknikleri hazır olarak sürekli olarak geliştirilmektedir. Şekil 5b bir Plexon Çevrimdışı Sıralayıcısı kullandıktan sonra beklediğinizden çıktı tipine bir örnektir. Bu yazılım, tek bir birim izolasyon kullanarak görsel muayene yoluyla yapılır. Birinci ve ikinci temel bileşenlerinin ağırlığı, başak genişliği, vadi ve tepe özelliklerinin farklı salkım göre tanımlanır.
Şekil 1. Çoklu temas laminer elektrotları kullanarak Multi-contact laminer elektrotlar, V1 kortikal katmanlar arasında izole bireysel nöronlar ve LFP birimleri aynı anda faaliyet spike kaydetti . Her U-Probe, 1.6 mm toplam uzunluğu kapsayan 16 (100 mikron) eşit aralıklı elektrot temas oluşur. Her bir elektrot temas çapı 25 mikron ve platin iridyum oluşmaktadır.
Şekil 2. NAN ızgara inşaat NAN Microdrive sistemi klasik vidalı tahrik Microdrive üzerinde stabilite ve hassasiyet sağlar. Elektrot Her grup bağımsız olarak, kullanıcı tarafından tanımlanan bir çalışma aralığı içinde XY uçakları manipüle. Her grup, elektrot, bağımsız çalışma derinliği (100 mm) ve değişken hız aralığı, 0.001 mm / sn 0,5 mm / sn ve 1 mikrometre yüksek çözünürlüklü bir kullanıcı tanımlı içinde Z yönünde manipüle (a) 4 - kanal taban, (b) NAN kamara, (c) 1 mm boşluk, (d) 1-4 vida mikro sürücülerindeki, (e) 1-4 kılavuz tüpleri (500 mikron çapında ve yaklaşık 5-7 cm kesilmiş) grid , (f) 1-4 Microdrive kuleleri ve (g) NAN sistemi ve silindir taban.
Şekil 3. Maymunlar, 100 beyaz (~ 1Hz) parladı tam alan siyah ekran maruz iken Uyarılmış yanıt potansiyel paradigma ve LFP kortikal katmanları belirlemek için zaman serisi (a), uyarılmış yanıt potansiyel (ERP), pasif bir fiksasyon görev sırasında ölçülen ms ve daha sonra siyah döndü. (b) laminer U-Probe ile kaydedilmiş LFP cevapları her kişi için ERP izlerini almak için işlendi . Granüler tabaka tabaka 4 üssünde lavabo-kaynak yapılandırma eşlik polarite inversiyon, ERP izleri yanıtı genlik odaklı bir lavabo inversiyon yerini tarafından ve varlığı ile tüm oturumlarda tespit edildi. Inversiyon meydana geldiğinde noktalı kutusu süre zamanlama gösterir.
Şekil 4. Katman Kimlik akım kaynak yoğunluk analizi (a) Akım kaynağı yoğunluğu analizi (LFP zaman serisi 2. mekansal türevi dayalı) kullanarak baz lavabo-kaynak yapılandırma eşlik polarite inversiyon tanımlamak için kullanılan granüler tabaka. Kortikal tabakalarının belirlenmesi, (soldan sağa) zamanla nasıl korunur istikrarlı değerlendirdi. Bu örneklerde, sink akımına (mavi) ~ 400 mm (b) her bir parsel altında CSD izleri belli bir katmana atanan bu kişiler ortalama CSD temsil granüler tabaka ve açıklıklı temsil eder. Bu bize, ilk lavabo hassas zamanlama (bu örnekler ~ 50-60 ms CSD iz zarf standart sapmayı temsil ve siyah çubuklar parladı uyaran (100 ms) süresini belirtiniz. Belirlemek için izin
Şekil 5. Spike sıralama ve açık alan eşleme (a) İlk yarısı görsel bir derecesi hesaplanır ve iki katına çıkar. Sonra, ters korelasyon uyaranlara bir CRT monitör c yamaları sunulmaktadır0, 45, 90 ve 135 derece odaklı ızgaralar onsisting. Ateşleme oranları her bir nöron için, uyaranların her uzamsal konum için sunulmaktadır sonra, 40 ila 120 ms arasında 5 ms aralıklarla bağımsız olarak hesaplanır. Maksimum ateş oranları hesaplanmakta ve daha sonra her zaman gecikmesi için centroid. Sonra her gecikme centroid ve bitişik atış hızı yerleri arasındaki mesafe hesaplanır. Minimum mesafe ile zaman gecikmesi açık alan olarak seçilmiştir. (B) pik yüksekliği, vadi derinliği, vadi zaman zirve, tepe veya vadi zaman, vb gibi Spike dalga şekli özellikleri, çevrimdışı bir sıralama yazılım programı kullanılarak analiz edilmektedir ( Plexon). Dalga şekilleri tek bir nörondan başka bir çakışma olmadan kümelenmiş kadar Spike benzer özelliklere dayalı olarak sıralanır.
Şekil 6. CSD profili karıştırılır Şekil 3a da aynı kongre ama biz karışık temas yerleri ile rastgele yeni bir CSD matris derler bir karıştırma işlemi gerçekleştirilir. Bu analiz, daha iyi temporal etki değişmeden bırakarak elektrot pozisyonları karıştırma granül lavabo doğrulamak için kullanılır. Zaman içinde görüntülenen bu örnekleri, kortikal derinliğinin bir fonksiyonu olarak elektrot temas dağıtılması herhangi bir laminer özgüllüğü yok.
Çok birim kayıtları kortekste sinir ağları uyaran bilgileri kodlamak nasıl analiz için standart haline gelmiştir. Elektrot teknolojisindeki son gelişmeler göz önüne alındığında, laminer elektrotlar uygulanması yerel kortikal devreler benzeri görülmemiş bir karakterizasyonu sağlar. Çoklu elektrot kayıtları nöral nüfus dinamikleri hakkında yararlı bilgiler sunuyor olsa da, çoklu laminar elektrotlar daha yüksek çözünürlük ve nöronların özel konumu hakkında daha fazla bilgi sağlar. Ko...
Çıkar çatışması ilan etti.
Ye Wang, davranışsal eğitim ve Sorin Pojoga tartışmalar için teşekkür ederiz. NIH EUREKA Programı, Ulusal Göz Enstitüsü, Pew Scholars Program, James S. McDonnell Vakfı (VD) ve NIH Vizyon Eğitim Bursu (BJH) tarafından desteklenir.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Ekipman Adı | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
Nan Microdrive sistemi | Nan Aletleri | Nan-S4 | Şekil 2. Özel kelepçeler U-Probe kullanmak için gerekli. U-Probe dışında bahsettiğim her şeyin NAN aletleri tarafından sağlanmaktadır. |
Vida mikro sürücülerindeki | MIT Machine Shop | NAN ızgara için bir rehber tüp güvenliğini sağlamak için mümkün olan her şeyi uygun olmalıdır. | |
Paslanmaz Çelik Kılavuzu Tüpler | Küçük Parçalar | B00137QHNS (1) veya B00137QHO2 (5) | Bu 60 uzun ve bir Dremel el matkabı kullanarak laboratuvarda boyutu kesme |
Plexon U-Probe | Plexon, Inc | PLX-UP-16-25ED-100-SE-360-25T-500 | Ayrıca mevcut U-Probe özellikleri bak www.plexon.com bkz. Şekil 1. |
Tablo 1: Donanım.
Yazılım Adı | Şirket | Web sitesi | Yorumlar |
NAN yazılımı | NAN | http://www.naninstruments.com/DesignConcept.htm | Bilgisayar arabirimi Plexon sistemi ve NAN donanım karşılamak için ek bir seri port gerektirir |
Çevrimdışı Sıralayıcısı, FPAlign, PlexUtil, MATLAB programları | Plexon | http://www.plexon.com/downloads.html # Yazılımı | 'Kurulum Paketleri' altında |
NeuroExplorer | NeuroExplorer | http://www.neuroexplorer.com/ | 'Kaynaklar' başlığı altında |
CSDplotter Sürüm 0.1.1 | Klas H. Petterson | http://arken.umb.no/ ~ klaspe / user_guide.pdf |
Tablo 2. Yazılım.
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır