CD71/TER119 Flow-sitometrik Testi kullanarak Fare eritro-id progenitörlerin Tanımlama ve Analiz

Özet

Doğrudan taze hasat fare kemik iliği, dalak veya fetal karaciğer farklılaşma aşamalı özel fare eritroid atalarıdır ve öncüleri, belirlenmesi ve moleküler analiz için bir akış sitometri yöntemi. Tahlil hücre yüzey belirteçleri CD71, Ter119 ve hücre boyutu dayanır.

Özet

Eritropoez çalışmada, kırmızı kan hücrelerinin erken hematopoetik ve eritroid atalarıdır nasıl şekillendiğini anlamak hedefliyor. Özellikle kırmızı hücre oluşumu oranı sentezi, doku hipoksisi tarafından tetiklenir eritropoietin hormonu (EPO), tarafından düzenlenir. Epo hızlı bir artış yeterli oksijenlenme sonuçları, eritropoetik oranı artış sürüş için bir tehdit, eritropoetik stres yanıtı olarak bilinen bir süreçtir. Dolaşımdaki kırmızı hücrelerin sayısında artış dokuya oksijen taşınmasını artırır. Bu nedenle, verimli bir eritropoetik stres yanıtı yüksek irtifa, anemi, kanama, kemoterapi ya da kök hücre nakli gibi fizyolojik ve patolojik koşullarda hayatta kalma ve kurtarma için kritik öneme sahiptir.

Fare eritropoezi çalışma ve stres yanıtı için önemli bir model. Fare kesin (erişkin tip) eritropoezi yenidoğan dalak, ve yetişkin dalak ve kemik iliği, fetal karaciğer embriyonik gün 12,5 ve 15,5 arasında yer alır. Dokusunda eritroid atalarıdır Klasik yöntemler, kırmızı hücre kolonileri Epo içeren yarı-katı medya kaplama yol vermek için bu hücrelerin yeteneği güveniyor. Onların eritroid prekürsör döl morfolojik kriterlere göre tespit edilir. Ne bu klasik yöntemlerle moleküler çalışma için farklılaşma aşamalı özel eritroid hücreler çok sayıda erişim sağlar. Burada doğrudan taze izole fare doku bağlamında farklılaşma aşamalı özel eritroid atalarıdır ve öncüleri, belirlenmesi ve eğitimi bir akış sitometri yöntemi mevcut. Tahlil hücre yüzey belirteçleri CD71, Ter119 dayanmaktadır ve akış sitometrik 'ileriye dağılım' parametre, hangi hücre büyüklüğünün bir fonksiyonudur. CD71/Ter119 testi in vivo eritropoetik strese tepki sırasında eritroid atalarıdır çalışma için kullanılabilir, örneğin, anemik fare ya da fare düşük oksijen koşullarında ev sahipliği yapmaktadır. Ayrıca eritropoezi değiştirilmiş moleküler yolun belirli bir rolü değerlendirmek üzere, eritroid, genetik olarak değiştirilmiş yetişkin fareler ya da embriyoların dokularda doğrudan atalarıdır çalışma olabilir.

Protokol

1. Dokuların hasat

1. 2 ila 5 ml soğuk boyama tamponu (salin (PBS)% 0,2 BSA ve 5mM glikoz fosfat tamponlu) içeren tüplere hazırlayın. Doku hasat öncesi buz üzerinde tüpler tutun.
2. Cull fareler uygun onaylanan protokole göre (örneğin CO ₂ inhalasyon servikal dislokasyon takip).
3. EDTA veya heparin kan toplama tüpleri içine kalp ponksiyon daha sonra analiz, hematokrit örneğin, retikülosit sayımı veya CBC analizi için kan çizin.
4. 1. adımda hazırlanan ayrı bir tüp, her bir fare doku yerleştirerek, dalak ve kemik Hasat. Dalak kolay erişim sol tarafında. Kemik iliği, hasat biri veya her ikisi femur. Hasat doku buz üzerinde tutun.
5. İsterseniz, dalak tartın. Eritropoetik bir stres yanıtı geçiren Fare dalak ağırlığı önemli bir artış göstermesi muhtemeldir.

2. Dalak hücrelerinin hazırlanması

1. Önceden ıslatılmış 3 ml şırınga pistonu kullanarak, dalak, dalak parçası (ideal olarak, yaklaşık 10 ⁸ hücre eşdeğer 0.1 gram veya daha az) 40 mikron steril hücre süzgeç (Fisherbrand katalog numarası 22.363.547 veya diğer) ile hafifçe itmek 50 ml konik bir tüp yerleştirilir. Bu işlem sırasında tüp buz üzerinde tutun. Toplam 2 ml boyama tampon bir süzgeç vasıtasıyla hücrelere yıkayın.
2. Herhangi bir küçük öbekler kırmak için hafifçe gergin hücre süspansiyonu pipetle. Gerekirse, hücrelerin tekrar süzün.
3. Santrifüj yoluyla hücreler iki kez yıkayın ve soğuk tampon yeniden askıya.
4. Hemasitometre kullanarak hücrelerin güvenin. Tipik verimi 1-2 x 10 ⁸ hücre / dalak. Akış sitometri analizi için, aliquote ya FACS boyama tüp içine örnek başına 1 ila 2 milyon hücre, (BD Falcon polistiren yuvarlak alt tüpler, 352.008) veya U-bottom 96 plaka (BD Falcon 353.910). Örnek boyama hacmi son bir hücre konsantrasyonu 0,5 için 1 x 10 ⁷ hücre / ml veya 1-2, ul 200 x 10 ⁶ hücre / 200 ul örnek.

3. Kemik iliği hücreleri hazırlanması

1. 1 veya 3 ml bağlı bir 26g iğne, soğuk boyama tamponu ile önceden doldurulmuş şırınga hazırlayın.
2. Femur kemik açıkça görselleştirmek şekilde bağlı kaslar çıkarın.
3. Kemik uçları mümkün keskin cerrahi makas, femur iki ucu kapalı snip, yakın kullanma. Bu femur uzunluğu boyunca çalışan kemik iliği boşluğu, giden, her kesim sonunda küçük bir delik ortaya çıkarmak gerekir.
4. 1. adımda önceden doldurulmuş şırınga kullanarak, iğne, bu delikler aracılığıyla takın, ve bir tüp içine yavaşça, diğer ucunda kemik iliği delikten dışarı floş.
5. Yukarıdaki dalak olarak 40 mikron (bkz. bölüm 2.1) süzgeç ile kızarmış yumuşak pipetleme hücreleri ve zorlanma ayrıştırmaları.
6. Soğuk boyama tamponu santrifüj hücreler iki kez yıkayın
7. Hücre sayımı ve bölüm 2.4 'te olarak tekrar süspansiyon haline getirin. Tipik verim femur başına yaklaşık 10 ⁷ hücrelerdir.

4. Fetal karaciğer hücrelerinin hazırlanması

1. Zaman gebe dişi farelerde hazırlamak için, akşam çiftleşme için fareler kurmak; vajinal fişler için 10, takip eden gün saat önce incelemek; vajinal fiş tespit edildiği gün, günde 0,5 olarak kabul edilir. Veteriner personelin hamile kadın tanımlamak için bu tekniği ile yabancı araştırmacılar yardımcı olabilir. Gebelik aynı zamanda izleme fare ağırlığı ile tespit edilebilir.
2. Zamanlı gebe dişi fareler için günde 12.5 ile 14.5 ve gebelik üzerine itlaf. Uterin boynuz buz gibi kültür ortamı ya da boyama tamponu içeren bir Petri yemek kaldırılır.
3. Embriyolar her rahim kaldırılır ve fetal karaciğer disseke edilir. Diseksiyon mikroskobu embriyonik gün 12.5 (E12.5) veya genç için gereklidir.
4. Karaciğerleri mekanik tampon içinde pipetleme dissosiye olabilir ve 96 plaka ayrı ayrı ya da işlenmiş, ya da deneysel gereksinimlerine bağlı olarak, bir araya toplanmış.
5. E13.5 A fetal karaciğer ~ 10 ⁷ hücreleri vardır. Hücreler tampon boyama iki kez yıkanır ve akım sitometri analizi için 1-2 x 10 ⁶ hücre / 200 ul örnek yeniden süspanse edilir.

5. Flow sitometri antikor boyama

1. Kontrol örnekleri dışında, aşağıdaki maddeleri içeren tüm numuneler için kullanılan ön-mix boyama primer antikor hazırlayın:
   • 200μg/ml bir final konsantrasyon ChromePure Tavşan IgG (Jackson, 015-000-003). Şişenin üzerindeki stok konsantrasyonu (değişebilir) kontrol edin. Bu fare hücreleri Fc reseptörleri engellemek için kullanılır; bunun için kullanılıyor olabilir alternatif türlerin fare IgG veya sıçan IgG. Türlerin seçimi, bu türler olamaz bu durumda primer sıçan / fare / tavşan antikorları karşı sekonder antikor boyama protokolde potansiyel varlığı ile belirlenir.d engelleme antikorlar gibi. Alternatif olarak,% 5 tavşan serumu, saf IgG yerine de kullanılıyor olabilir. Bir başka alternatif monoklonal antikorlar veya fare Fc reseptörlerine yönelik Fab parçaları kullanmaktır. Aşağıda temel protokolü, herhangi bir sekonder antikorlar içermez ve herhangi bir üç tür IgG kullanılan olabilir.
   • CD71-FITC, 1:200 oranında sulandırılmış (stok 0.5mg/ml, BD Biosciences, 553.266)
   • Ter119-PE, 1:200 (stok 0.2mg/ml, BD Biosciences, 553.673) seyreltilmiş
   • Herhangi bir ek antikorlar ilgi yüzey epitoplar yönettiği, örneğin antikorlar, Fas ya da FasL ^(1,2) yönetti . Antikor çözümü tersini tüp 2-3 kez hafifçe karıştırın.
2. Her bir hücre örneği 200 ul ön karışımı ekleyin ve yavaşça hücrelerin yeniden askıya.
3. Kontrol hücre örnekleri aşağıdaki gibi hazırlayın:
   • 'Lekesiz' tampon boyama bu hücrelerin sol ve hücrelerin arka plan otofloresans sağlar.
   • 'Tek renk' denetimleri: antikor / protokolünde kullanılan her renk için böyle bir kontrol gereklidir. Bu kontrollerde hücreler ya doğrudan konjuge primer antikor ile boyanmış ya da birincil bir antikor ve konjuge sekonder antikor ile. Bu kontroller, kanallar arasında spektral örtüşme düzeltmek için kullanılır.
   • 'Floresans eksi bir' (FMO) kontrolleri: böyle bir kontrol protokolü her antikor / renk için gerekli olan hücreleri hariç protokol tüm renkleri / antikorlar ile boyanarak renk / FMO kontrolü için antikor. FMO kontrolü, belirli bir kanal için bu kanal için gerçek bir arka plan sağlar. Bu non-spesifik antikor, aynı izotip ve test antikor (izotipi kontrol) aynı floresan işareti ile konjuge içerebilir.
4. Primer antikor inkübe örnekleri ve ilgili denetimler 45 '1 saat karanlıkta (alüminyum folyo kapak buz kovası koymak) için buz üzerinde leke.
5. Inkübasyon sonunda, yaklaşık 400 xg 4 ° C 3 '5' için, her numune tüpü ve spin boyama tampon 3ml ekleyerek hücreleri yıkamak 96 kuyucuğu kullanıyorsanız, hacmi 200 ul hücreler üç defa yıkamak.
6. Ilgili, ikincil antikor leke geçerlidir. Ilk antikor leke olarak uygulayın ve yıkayın.
7. Annexin V ile ilgili ise, bir leke üreticinin talimatlarına gibi HEPES tamponu kullanarak, inkübasyon sonunda uygulanır. Bu leke, oda sıcaklığında 15 dakika süreyle uygulanır, ya da 1 saat buz üzerinde.
8. Hücreleri ölü hücreleri hariç, geçirimsiz bir hücre DNA boya içeren çözüm boyama akış sitometri analizi için yeniden askıya alınır. Birkaç DNA boyaları Propidium İyodür, 7-amino-aktinomisin D (7AAD), ya da DAPI da dahil olmak üzere mevcuttur. Bunların arasından seçim spesifik antikor boyama için alınan kanallar mevcut kanalları, akış sitometresinde mevcut kanalları bağlıdır. 7AAD BD-Biyobilimler (559.925) elde edilen ve üreticinin talimatlarına göre kullanılır. DAPI boyama için, (Roche, Kedi # 236.276) toz 1mg/ml bir stok dimetilformamid (DMF) -20 ° C'de tutmak ve tampon boyama 1:15,000 için 1:10,000 sulandırmak.

6. Flow-sitometrik sıralama

1. Hücreler CD71 karşı antikorlar, Ter119, soy işaretleri ve akış sitometri analizi (Bölüm 5) açıklandığı gibi bir canlılığı boya ile etiketlenir. 5 etiketleme sırasında hücre konsantrasyonu artabilir x 10 ⁷ / ml.
2. Soy ana karışımı yapmak için aşağıdaki antikorların her bir eşit miktarda karıştırın:
   • FITC Rat Anti-Mouse CD41 MWReg30, BD Pharmingen 553.848
   • FITC Rat Anti-Mouse CD45R/B220 RA3-6B2, BD Pharmingen 553.087
   • FITC Hamster Anti-Mouse CD3e 145-2C11, BD Pharmingen 553.061
   • FITC Rat Anti-Mouse CD11b/Mac-1 M1/70, BD Pharmingen 557.396
   • FITC Rat Anti-Mouse Ly-6G ve Ly-6C (Gr-1) RB6-8C5, BD Pharmingen 553.126
   • (Bu her 0,5 mg / ml 'her bir antikor hisse senetleri, 1:400 dilüsyon eşdeğerdir) 1:80 ana karışımı kullanın.
3. , Düşük basınç sıralama koşulları ve geniş memeleri kullanın. Aria (BD Biosciences) 100 μ memesi, 20 psi basınç kullanın.
4. Koleksiyon tampon: PBS ile% 20 fetal sığır serumu ekledi.
5. Sıralanmış popülasyonlarının saflık kontrol etmek için, bir canlılığı boya içeren bir tampon (7AAD veya benzeri) her örnekten küçük bir kısım yeniden çalıştırın.

7. Temsilcisi Sonuçlar:

CD71/Ter119 yetişkin kemik iliği veya dalak boyama etiketli ProE Erya, EryB ve EryC (bkz. Şekil 1) ^1, dört alt kümelerini bir gelişim sırasını belirler. Morfolojik olarak, bu giderek daha olgun erythroblasts karşılık gelir. Şekil 1, çok küçük bir olay (çekirdek, kırmızı kan hücrelerinin de dahil olmak üzere), toplu hücreler ve ölü hücreleri atar veri analizi aşamasında, yolluk sırasını göstermektedir.

Hücre yüzey proteinleri İfade Ter119 ve CD71 boyama aynı zamanda ilgili antikorlar ekleyerek, bu alt gruplarının her biri için eş zamanlı olarak ölçülür. Şekil ^1, 1 Fas ölüm reseptörü hücre yüzey ekspresyonu bir örnek gösterir . Bu ölçüm Epo ile enjekte edilen farelerde gerçekleştirilen ya da kontrol farelerde serum fizyolojik enjekte edildi. Epo in vivo ¹ Erya nüfus Fas ifade bastırır açıktır.

Her alt hücreleri için hücre içi proteinler ya da hücre döngüsü durumu ifade de ölçülebilir. Şekil 2 taze hasat edilen kemik iliği hücreleri temsilcisi hücre döngüsü analizi göstermektedir. Bu ölçümler gerektiren CD71 ve Ter119 hücre yüzeyi boyama ek olarak, hücre içi etiketleme (Tartışma bölümüne bakınız) hücrelerinin fiksasyon ve permeabilization.

Fetal karaciğer, non-eritroid hücreler CD41 için negatif 'Lin-hücreler, Mac-1, Gr-1, B220 ve CD3 (Şekil 3) ilk yolluk tarafından dışlanır. Geri kalan hücrelerin alt ayrılmıştır S0 S5 6 alt kümelerini içine. Fetal karaciğer hücrelerinin hassas desen (Tartışma bölümüne bakınız) embriyonik yaşına bağlıdır. E13.5 fetal karaciğerde S3 alt kümesi bir temsilci hücre döngüsü analizi (Şekil 4) gösterilir.

Şekil 1. fare dalak CD71/Ter119 eritroid altkümelerini A. Ayırıcı stratejisi: Dalak hücreleri işlenmiş ve CD71, Ter119 ve Fas yönelik antikorları ile etiketlenir. Bu rakam, veri toplama adım izleyerek analiz strateji gösterir. Histogram ben edinilmiş tüm etkinlikleri gösterir. Çapraz kapı, çiftlerin ya da büyük agrega hariç, tek hücre, olması muhtemel olayları temsil eder. Hücreler bu kapıdan daha histogram II analiz edilmektedir. Burada çok küçük olaylar, büyük olasılıkla çekirdekleri veya enkaz, dışlanır. Kapılı hücrelerin membran geçirgen apoptotik hücreleri muhtemeldir DAPI-pozitif hücreler, daha fazla analiz dışında tutulmuştur histogram III gösterilmiştir. Histogram IV yaşayabilir dalak hücrelerinin ortaya çıkan nüfus gösterir. ProE kapısı CD71 ^yüksek Ter119 ^ara hücreleri içerir. Ter119 ^yüksek hücreleri daha histogram analiz V. Burada CD71 ^yüksek hücreler daha az olgun, büyük 'Erya' erythroblasts ^(CD71 yüksek ^Ter119 yüksek ^FSC yüksek) ve daha küçük, daha olgun 'EryB' erythroblasts ^(CD71 yüksek ^Ter119 yüksek ^FSC düşük) bölünmüştür . En olgun erythroblast altkümesi EryC (CD71 ^düşük Ter119 ^yüksek FSC ^düşük). Histogram VI, özellikle Erya alt grubunda bazal durumda fareler (tuzlu su enjekte) ve Epo tek bir doz ile enjekte edilen farelerde hücre yüzey Fas ifade, gösterir. Fas antikoru ile boyama, CD71/Ter119 boyama ile eşzamanlı olarak yapıldı. Belirtilen alt gruplarının her birinden sıralanmış hücre B. sitospin preparatları . Hücreler Giemsa ile boyanmış ve diaminobenzidin, ikincisi hemoglobin ile kahverengi bir leke üretir. Sitospin veri aslında Liu ve ark yayımlandı, Kan. Tem 1, 2006, 108 (1) :123-33. Epub 2006 Mar 9.

Şekil 2 fare kemik iliğinde CD71 ^yüksek Ter119 ^yüksek erythroblasts Hücre döngüsü analizi. Fareler BrdU intraperitoneal olarak enjekte edildi ve dalak ve kemik iliği 30 ila 60 dakika sonra toplandı. Hücreleri sabit ve permeabilize (fiksasyon, permeabilization ve BrdU boyama protokol, üreticinin talimatlarına göre), CD71 ve Ter119 lekeli BrdU birleştirmek için kendi kopyalayan DNA'sına BrdU yönelik bir monoklonal antikor ile boyandı. BrdU-pozitif hücre döngüsünün S-faz. Interfaz hücreleri BrdU-negatif ve DNA boya 7AAD kullanarak, G1 veya G2 / M aşamaya çözülebilir.

Şekil 3 fare fetal karaciğerde CD71/Ter119 eritroid altkümelerini A. Ayırıcı stratejisi:. Fetal karaciğer hücreleri CD71, Ter119 etiketli, ve olmayan eritroid soy belirteçleri ('Lin') yönetti FITC etiketli antikorlar bir kokteyl. Canlı hücreler (7AAD-negatif), Lin ifade incelendi ve Lin-hücreler daha S0 S5 eritroid altkümelerini bölünmüştür. Genç ve olgun S4/S5 altkümelerini hücrelerin yokluğunda gösterilen daha az olgun erythroblasts, E13 fetal karaciğer oluşur belirtilen alt gruplarının her birinden sıralanmış hücreler B. sitospin preparatları . Hücreler Giemsa ile boyanmış ve diaminobenzidin, ikincisi hemoglobin ile kahverengi bir leke üretir. Sitospin veri başlangıçta pPop ve ark ublished PLoS Biol 8 (9): e1000484. DOI: 10.1371/journal.pbio.1000484.

Şekil 4, fetal karaciğer eritroid altkümelerini hücre döngüsü analizi. BrdU ile Hamile farelere enjekte edildi ve fetal ciğeri permeabilize, sabit, 30 ila 60 dakika sonra hasat ve CD71, Ter119 ve BrdU karşı antikor ile boyandı . S3 hücreleri hücre döngüsü durumu gösterilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Akış sitometri yöntemi, hücre yüzey belirteçleri, protein ekspresyonu, hücre sağkalım, fosfor-spesifik ^{antikorların 3} ve hücre döngüsü durumu kullanarak hücre sinyalizasyon dahil olmak üzere bir floresan konjuge spesifik antikor veya ligand, ile tespit edilebilir herhangi bir hücresel fonksiyonları eş zamanlı olarak soruşturma sağlar. Bu ölçümler, taze izole eritropoetik doku bağlamında, farklılaşma aşamasında belirli alt kümelerini bir dizi her yapılabilir. Bu yöntem, bu ned...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktifin Adı	Şirket	Katalog numarası
FAS-biotin	BD Pharmingen	554256
Streptavidin APC	Moleküler Probları	S868
40 mikron steril hücre süzgeç	Fisherbrand	22363547
FACS boyama için polistiren yuvarlak alt tüpler	BD Falcon	352008
U-bottom 96 plaka	BD Falcon	353910
ChromePure Tavşan IgG	Jackson ImmunoResearch	015-000-003
CD71-FITC (hisse senedi 0.5mg/ml)	BD-Biosciences	553266
Ter119-PE (hisse senedi 0.2mg/ml)	BD-Biosciences	553673
7AAD	BD-Biosciences	559925
DAPI tozu	Roche	236276
FITC Rat Anti-Mouse CD41 MWReg30	BD Pharmingen	553848
FITC Rat Anti-Mouse CD45R/B220 RA3-6B2	BD Pharmingen	553087
FITC Rat Anti-Mouse CD411b/Mac-1 M1/70	BD Pharmingen	557396
FITC Rat Anti-Mouse Ly-6G ve Ly-6C (Gr-1) RB6-8C5	BD Pharmingen	553126
FITC Hamster Anti-Mouse CD3e 145-2C11	BD Pharmingen	553061
APC BrdU Akış kiti	BD Pharmingen	557892
Annexin V-biotin	BD Pharmingen	556418