Kuş Embriyo Model kullanarak Kanser metastaz Kantitatif Analiz

Özet

Kantitatif PCR kullanarak, köklü civciv CAM modeli, uzak organlara insan tümör hücreleri metastaz kantitatif analiz etmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.

Özet

Primer tümörün metastaz kanser hücrelerinin yayılmasını sırasında, işgal, çevre dokulara ve uzak organlara yayılabilir. Metastaz, birçok doku tipleri, a değişken zaman dilimlerinde, içerir ve genellikle zor araştırmak ve ölçmek için, organların içinde derin meydana karmaşık bir süreçtir. Buna ek olarak, metastatik sürecinin etkinliği zor tümör hücre davranışı tek bir yönü katkısını değerlendirmektir metastatik kaskad birden fazla adımlar etkilenir. Bunun bir sonucu olarak, metastaz testlerin sık metastaz çalışma mutlaka gerçekçi bir bağlam sağlamak için deney hayvanlarında yapılmaktadır. Ne yazık ki, bu modellerin daha da kompleks fizyolojisi karmaşıktır. Civciv embriyo chorioallantoic membran (CAM), tümör hücrelerinin xenografting alıcı kabuğu altında bulunan iyi vaskülarize ekstra embriyonik doku erişilebilirlik nedeniyle eşsiz bir metastaz okuyan birçok sınırlamalar üstesinden in vivo modeldir. (Şekil 1). Ayrıca, doğal civciv embriyo immünyetmezligi beri, CAM kolayca engraftman hem normal ve tümör dokularının destekler. En önemlisi, kuş CAM başarıyla büyüme, istila, anjiyogenez ve mikroçevresinin itilme dahil olmak üzere birçok kanser hücresi özellikleri destekler. Bu kanser metastazı yol ve yeni potansiyel terapötikler metastatik kanser cevabı tahmin etmek yollarının araştırılması için model son derece yararlı hale getirir. Türlerin belirli Alu PCR yaygın hücrelerinin algılama kantitatif 25 hücreleri gibi birkaç kişi tarafından kolonize organlarda metastaz değerlendirmek için mümkün kılar. İnsan Epidermoid Karsinomu hücre hattı (HEp3) kullanarak kanser hücrelerinin spontan civciv karaciğer ve akciğer gibi uzak organlara metastaz analiz etmek için bu modeli kullanın. Ayrıca, Alu-PCR protokolü kullanılarak testin duyarlılığı ve tekrarlanabilirlik intravasation, tutuklama, ekstravazasyon ve kolonizasyon metastaz bireysel unsurları olarak analiz etmek ve ölçmek için bir araç olarak göstermektedir.

Protokol

1. Xenografting için yumurta (spontan metastaz) hazırlanması

1. Yeni bırakılmış döllenmiş tavuk yumurtası, 10 gün ve 100 ° F% 60 nem için dönen bir inkübatör inkübe edilir. Yumurta, her saat başı dört kez döndürülür.
2. Gelişim günde 10 yumurta, kendi taraflarında bir yumurta rafa yerleştirilir. Kaz-boyun lambası veya diğer bir uygun ışık kaynağı, künt sonunda airsac bulunan yumurta kabuğu içine ışık tutarak mum yumurtalar için kullanılır.
3. Chorioallantoic ven bulunur ve işaretlenir. Bu bağlamda, birkaç büyük kan damarlarının birleştiği kabuğunun üst kısmında yer almaktadır. Bu şube noktada kan damarı CAM, aşağı düşer ve embriyo bağlanır. 1cm kare kutusu ven dal noktası yaklaşık 1cm uzakta kabuğu üzerinde kalem ile çizilmiş. Alan ve meydanın çevresine iyot batırılmış bir pamuklu bir bez kullanılarak temizlenebilir.
4. Bir silikon karpit taşlama taşı (Dremel parçası # 84.922) hava kesesi içine yumurtanın künt sonuna kadar açılmış bir delik ile donatılmış dönen bir kesme aleti (Dremel) kullanma. Bu aynı aracı kullanarak bir delik kabuğu membran kısa duruş, yumurtanın üstüne önceden çizilmiş bir kare içinde delinmiş. 25-gauge şırınga iğnesinin ucunda ince bir frez ile yatan CAM gözyaşı dikkatli olmak kabuğu zarı küçük bir delik yapmak için kullanılır. CAM ¼ "Tygon boru airsac delik karşı yerleştirilen bir parça ile donatılmış otomatik bir pipet yardımı ile oluşturulan hafif bir emme kullanarak kare alanda kabuğu zarı daha sonra ayrılmış. Emme başvurusu üzerine, bir hava cebi delik meydanında altında CAM kabuğu başarıyla uzak düşmüş olduğu anlamına olmalıdır. CAM bırakılır sonra, hava kesesi ve chorioallantoic ven yakınındaki meydanda bulunan delik delik bir parça bant laboratuvar bant ile kapatılır. Yumurta daha sonra tümör hücrelerinin aşılama beklentisiyle 100 ° F ve% 60 nem sabit bir inkübatör içine yerleştirilir. Sıralı bir tasviri için şekil 1'e bakınız.

2. Yumurta intravenöz enjeksiyon için hazırlanması (deneysel metastaz)

1. Yeni bırakılmış döllenmiş tavuk yumurtası, 12 gün ve 100 ° F% 60 nem için dönen bir inkübatör inkübe edilir. Yumurta, her saat başı dört kez döndürülür.
2. 12 yumurta gelişim gününde, kendi taraflarında bir yumurta rafa yerleştirilir. Kaz-boyun lambası veya diğer bir uygun ışık kaynağı, künt sonunda airsac bulunan yumurta kabuğu içine ışık tutarak mum yumurtalar için kullanılır.
3. Chorioallantoic ven bulunur ve işaretlenir. 0.5 cm dikdörtgen 1cm doğrudan damar yukarıdaki kabuğu üzerinde kalem ile çizilir. Alan ve meydanın çevresine iyot batırılmış bir pamuklu bir bez kullanılarak temizlenebilir.
4. Dremmel matkap ucu (# 118) kullanılarak çizilmiş yerde kabuğu küçük bir pencere oluşturulur. Pencere sonradan mineral yağ damla şeffaf hale yatan kabuğu zar maruz kaldırılır. Bir grafik tasviri için Şekil 5A bakın.
5. Bu noktada hava kesesi ve chorioallantoic ven yakınındaki meydanda bulunan delik delik bir parça bant laboratuvar bant ile kapatılır. Yumurta daha sonra tümör hücreleri enjekte beklentisiyle 100 ° F ve% 60 nem sabit bir inkübatör içine yerleştirilir.

3. Tümör hücrelerinin aşılama veya enjeksiyon için hazırlanması.

1. Xenografting için herhangi bir kalıntı medya, tripsin, EDTA veya kaldırmak için, tümör hücrelerinin tripsin / EDTA kullanarak kendi kültür yemeklerinden müstakil ve fosfat 10 ciltlik ile yıkanır tamponlu salin (PBS).
2. IV enjeksiyon için, kültürlü hücreler enzimatik olmayan hücre-ayrılma çözümü kullanarak müstakil, ve serum ücretsiz DMEM ile yıkanır. ve)
3. Hücreler bir hemasitometre sayılır ve aşılama için 10-40 milyon hücre / ml PBS içinde yeniden süspanse, ya da alternatif olarak 1 milyon hücre / ml IV enjeksiyon için serum serbest DMEM yeniden süspanse.

4. Yeni maruz CAM (Spontan metastaz) tümör hücreleri üzerine Aşılama

1. Yumurtalar inkübatör kaldırılır ve yerini yeni bir hava cebi oluşmuştur önceden çizilmiş bir kare kesilmiş küçük bir pencere. Bu en kolay bir kesim tekerlek (# 409 dairesel kesme tekerleği ile Dremel aleti) ile donatılmış bir döner alet ile yapılır. Kabuğu olan küçük bir bölümü çıkarın ve altta yatan CAM ortaya çıkarmak için bir çift iğne-burun forseps kullanılır.
2. Pamuk uçlu bir aplikatör (Fisher Marka # 23-400-001) CAM 5 kez aşınır. Biraz pamuk kan belirgin olmalıdır. CAM zarar hemen sonra, hücre süspansiyonu 25μl hasarlı bölgeye yerleştirilir. Optimal hücrelerinin sayısı tespit empirically ama 0.5X10 ⁵ 1x10 ⁶ arasında olabilir. yumurtanın pencere bandı ile ağzı sıkıca kapatılmış ve civciv hücrelerini yerleşmek için izin vermek için 10-15 dakika ayakta kalan. 15 dakika sonra yumurtaları sabit kuvöz iade edilir.
3. Tümörler, özel uygulama ve tümör hücre hattında kullanılan niteliğine bağlı olarak 5-8 gün büyümeye izin verilir. Sıralı bir tasviri için şekil 1'e bakınız.

5. Tümör hücrelerinin enjeksiyonu (Deneysel metastaz)

1. Hücre süspansiyonu 30 Gauge insülin şırınga 100μl kullanarak her bir embriyo allantoik damar içine enjekte edilir, yumurta, sabit bir inkübatör döndü ve bir ek 1-7 gün boyunca orada kaldı.
2. Farklı zaman noktalarında, akciğer veya düşük CAM her embriyo hasat ve aşağıda açıklandığı gibi, tümör hücrelerinin tespiti için işlenmiş.

6. Hasat tümörler ve piliç dokuların

1. A diseksiyon alanı hazırlanır. Tahlil, çok hassas bir PCR yaklaşım kullanarak insan DNA nicel metastatik hücreler algılar. Bu nedenle eksojen DNA ile kontaminasyonu önlemek için çok önemlidir. Diseksiyonlarının özel bir alanda yapılmaktadır ve her hayvan arasında diseksiyonları boyunca araçları temizlenir. Primer tümörün ve iç organların kaldırmak için bir takım kaldırmak için, bir takım yumurta kesmek için bir set: diseksiyon süreci boyunca, araçlar 3 ayrı set kullanılan örnekleri çapraz kontaminasyon önlemek için. Buna ek olarak, dört yıkama kapları, her bir hayvan arasındaki araçlar durulama sıralı için kullanılır. Bu yıkar sırayla şunlardır: 1) çift distile su, 2) çift distile su, 3) çamaşır suyu ve 4)% 70 etanol.
2. Yumurta sabit kuvöz kaldırılır ve hayvanları uyutmak ve euthanize 15 dakika boyunca buz üzerinde yerleştirilir. Pencereler tümörler görünür hale gelmesi gibi açılır. Bazı kabuğu kaldırarak büyük pencereler açılması gerekebilir. CAM primer tümör rezeke tartılır ve histoloji için işlenmiş.
3. Radyal eşit parçaya kabuk keserek civciv kabuğu kaldırılır. Embriyo kesim kabuk dekante ve temiz bir tekne meme tartmak yan aktarılır. Hayvan taze, temiz bir araç seti ile disseke edilir. Hayvan sternum ile kesim tarafından açıldı. Embriyo, karaciğer ya sağ ya da sol lob toplanan bir parça açıktır. Taşlık bağlı yemek borusu hafifçe çekerek ve kesme organlar bağlamak visera daha sonra iç organları tarafından kaldırılır. Akciğerler kesip toplamak için göğüs kafesi, göğüs plakası ayrılır açıldı ve kalp kaldırılır. Bu noktada, akciğer dört kenarından kesmek mümkün (baş en yakın üst göğüs kafesi, trakea ve sağ tarafta birlikte diyafram yakınında alt sol tarafındaki). Tutarlılık uğruna, aynı akciğer her hayvan toplanır. Hasat doku örnekleri daha sonra kullanılmak üzere -20 ° C'de saklanır veya DNA izolasyonu için hemen işlenebilir.

7. Genomik DNA izolasyonu ve kantitatif PCR Analizi

1. Genomik DNA SYBR Green Özü-N-Amp Doku PCR kiti (Sigma-Aldrich Katalog # XNATRG) kullanarak dokular elde edilir. Edilen DNA temiz bir Eppendorf tüp aktarılır ve -20 ° C'de saklanır veya hemen kullanılabilir. Sonraki PCR reaksiyonu kullanmadan önce nükleaz ücretsiz su DNA 01:50 sulandırmak için önemlidir. Alternatif olarak, DNA standart DNA ekstraksiyonu protokolleri (Zijlstra ve ark, 2002) herhangi bir sayı kullanılarak elde edilebilir.
2. İnsan DNA'sı kullanarak insan Alu dizileri için kantitatif PCR özel civciv dokularda tespit edilmiştir. Kantitatif PCR SYBR yeşil amplifikasyon Exract-N-Amp kiti kullanılarak yapılır Alu-spesifik primerler kullanılarak. SYBR yeşil, tampon, tuzlar dNTP, Taq polimeraz ve Jumpstart Taq Antikor içeren bir 2x reaksiyon karışımı PCR kiti ile birlikte gelir. Reaksiyon karışımı, her astar 0.4μM, 15μl nihai hacmi oluşur. Çoğu durumda edilen DNA kullanılarak 01:50 nicel veri sağlayacaktır seyreltilmiş için, ancak, en uygun miktarda DNA ampirik optimize edilmesi gerekebilir. Tavuk GAPDH primerler PCR Alu dizileri için aşağıdaki koşullar altında çalışan bir iç kontrol sistemi olarak kullanılır: polimeraz aktivasyon 95 ° C 'de 2 dakika süreyle 95 30 döngüleri takip ° 30 s, 63 ° C için 30 sn 72 ° C, 30 s. Tavuk GAPDH reaksiyon koşulları ancak 40 döngü PCR uzatmak için gerekli olabilir Alüminyum için açıklanan aynıdır.
3. Metastaz Kantitatif analiz, kontrol grubu (Schmittgen ve Livak, 2008 deney grupları karşılaştıran ΔΔCt yöntemi kullanılarak yapılır. Zijlstra ve ark, 2002). Alternatif bir standart eğri Özü-N-Amp kiti (Zijlstra ve ark, 2002) kullanılarak çıkarılan insan tümör hücreleri dilüsyon serileri kullanılarak oluşturulabilir. İstatistiksel anlamlılık Öğrenci T-test veya deney ve kontrol grupları Anova analizi kullanılarak değerlendirilmiştir.

8. Temsilcisi Sonuçlar:

Şekil 1. Tavuk embriyo metastaz modeli. A) önemli adımlar kesiti modelin görünümünü gösteren dört panel diyagram: 1. Inkübasyon 10 gün sonra. CAM yakın maksimum boyutuna ulaştı. Arterler ve damarlar belirgin bir yumurtanın üst karşı konumlandırılmış alantoyik ven görünür. 2. Kabuğu iki delik delme hemen sonra yumurta: airsac içine bir allantoik ven için ek noktasına bitişik. 3. Hafif bir vakum sonra görünüm airsac tahliye ve CAM bırakmak için kullanılır olmuştur. Tümör hücreleri (mavi) düştü CAM uygulanır. 4. Aşılı tümör hücresinin büyümesini sağlayan sonra, tavuk embriyo dokusu ile birlikte tümör analiz için hasat B) modelin seri tasviri: 1. Kuluçkalık yumurtalar, 2. Allantoik ven konumu, 3 işaretleniyor. Kabuğu üzerinde herhangi bir delik, 4. CAM Damlama, 5. Kesme, aşılama tümör hücresi, 6 için bir açılış. Tümör hücrelerinin uygulamak, 7. Buz üzerinde yumurta Soğutma önce doku toplama, 8. 7 gün sonra büyüme tümör Hasat.

Şekil 2 CAM tümörlerin Histolojisi. Tümör taşıyan chorioallantoic membran alınan dokular, formalin, kesitli sabit ve trikrom boyası ile işlendi. A) CAM büyüme yedi gün sonra tümör HEp3. B ve C, A gösteren, tümör ve stroma büyütülmüş bölgeleri göstermektedir. D) normalleri CAM.

Şekil 3. Kantitatif boyuna metastaz analizi. Yüksek veya düşük metastatik yeteneği (HEp3 M (Yüksek) ve sırasıyla HEp3 M (Düşük)) baş ve boyun kanseri tanısı HEp3 için Varyantlar Alu PCR kullanarak yaymak için yeteneklerini analiz edildi. On hayvanlar 7 gün süresi için her zaman bir noktada analiz edildi. Bu örnekler # doku cells/50mg olarak bir standart eğri karşı nicel ve daha sonra ifade edildi.

Şekil 4. Hayvanlarda spontan metastaz hücreleri metastaz inhibe antikor 1A5 inhibisyon ile tedavi edildi. Tümörler, gün-10 embriyoların CAM uygulanan ^5x10 5 HEp3 hücreleri kullanılarak oluşturulmuştur . Hayvanların yarısı anti-CD151 antikoru 1A5 ile tedavi edilen tümör hücrelerinin uyguladıktan sonra üç gün. Tümör taşıyan hayvanlar akciğerler iki gün sonra hasat edilir ve kantitatif gerçek zamanlı alüminyum PCR tabi tutuldu. ChGAPDH Tersine kantitatif gerçek zamanlı PCR host genomik DNA eşdeğer miktarda (ΔΔCt yöntemi (kantitatif iki grup karşılaştırmak için B kullanılmıştır) varlığını doğrulamak için kullanılmıştır.

Şekil 5. Metastatik kaskad tutuklama, büyüme ve intravasation değerlendirilmesi. Tutuklama, büyüme hızı ve intravasation oranı: Temelde, ikincil bir organ metastazı üç yönlerini katkılarıyla tanımlanır. Bu deneysel metastaz (A) ve spontan metastaz (B) bir kombinasyonu kullanılarak belirlenebilir. 2saat yazılan enjeksiyon tutuklama hücre sayısı olarak tanımlanan deneysel metastaz (A) kullanarak tespit edildi. Tutuklandı hücrelerin hayatta kalma ve büyüme, hücre sayısı 24 saat sonrası enjeksiyon değişikliği olarak belirlenmiştir. Büyüme 3-7 gün sırasında proliferasyon oranı olarak tanımlanır. Intravasation spontan metastaz (B) intravasated hücrelerinin sayısı, değeri 6 gün metastatik yükünün büyüme öngördüğü aşması 7 gün metastatik yükünü hediye olarak tanımlanır kullanılarak belirlenir.

Şekil 6. CAM metastatik görselleştirme genişleme. GFP ifade HEp3 hücrelerinin gelişim 12. günde intravenöz enjekte edildi. 1, 3 ve 5 günde bir yumurta kurban CAM bir bölüm ve bir floresan stereo mikroskop ile görüntülendi. Kabuğu koyu yeşil arka tarafından oluşturulan, damarsal siyah çizgiler olarak görünür ve tümör hücrelerinin parlak yeşil noktalar olarak görünür.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Civciv CAM kanser biyolojisi ve metastatik ilerlemesi çeşitli yönlerini incelemek için bir model sistem olarak on yıllardır kullanılmaktadır. Dormansi analizi de dahil olmak üzere çeşitli gruplar tarafından bu modelde, metastatik yetenekleri Prensibi değerlendirme yapılmıştır (Aguirre Ghiso ve ark, 1999; Ossowski ve Reich, 1983), doku yeniden yapılanma (Deryugina ve ark, 2005; Hahn- DANTONA ve ark, 1999) ve metastaz (Zijlstra ve ark, 2008; Zijlstra ve ark, 2...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktifin Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar (isteğe bağlı)
1X Dulbecco'nun Modifiye Kartalı Medium (DMEM)	Invitrogen	11995073
Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin (D-PBS) (1X), sıvı	Invitrogen	14190250	pH: 7.4
Tripsin, EDTA 4NA% 0,05 (1X), sıvı	Invitrogen	25300054
Sporcu çıkım	Berry Hill	1550HA	Bu inkübatörler en hazır bazılarıdır. Ancak, video, farklı ekipman gösterecektir.
Sporcu inkübatör	Berry Hill	1502EA
Dremel döner aracı	Dremel
Hiçbir Dremel kesme tekerlekleri. 36	Dremel	409
Taşınabilir Pipet Yardım	Balıkçı	1368115E
Pamuk Aplikatörler Uçlu	Balıkçı	23-400-001)
Döllenmiş yumurta	Çeşitli		Birçok farklı satıcı kullanılabilir. Yumurta yaklaşık 35-55 gram olmalı. Onları yaş arasında 36 ve 55 hafta olmalıdır bırakır tavuklar.
Hemasitometre	Hausser Bilimsel, VWR	15170-090
Fiber-optik mikroskop aydınlatıcı	Amscope	HL250-AY	150W
25 iğne
SYBR Green Özü-N-Amp Doku PCR Kiti	Sigma-Aldrich	XNATRG