Biyogüvenlik Geliştirilmiş Polimer complexed Ecotropic lentivirüs İnsan Hücreleri, İletimi

Özet

Lentiviruses genin fonksiyonu keşfetmek için çok değerli bir araştırma aracı; Ancak, araştırmacılar bilinen pantropic lentivirüs kodlama ya da şüphesi onkogenler üretimi önlemek için isteyebilirsiniz. Alternatif olarak, biz ecotropic reseptör mSlc7a1 ifade etmek için modifiye insan hücreleri üzerinde ecotropic lentivirüs kullanmak için daha güvenli bir protokol mevcut.

Özet

Kök ve tümör hücre biyolojisi çalışmaları genellikle laboratuvar personeli için önemli güvenlik sorunları yükselterek, bilinen ya da şüphelenilen onkogenler insan hücrelerinde viral transdüksiyon gerektirir. Yaygın olarak kullanılan VSV-G pseudotype Pantropic lentiviruses, gen fonksiyonu olmayan bölünen hücreleri de dahil olmak üzere çok sayıda hücre tipleri, transduce çünkü çalışmak için değerli bir araç. Ancak, araştırmacılar, üretim ve yüksek biyogüvenlik düzey sürüş gereksinimleri ve güvenlik sorunları nedeniyle onkogenler kodlama pantropic virüs santrifüj önlemek için isteyebilirsiniz. C-Myc ve SV40 büyük T antijeni dahil olmak üzere birçok güçlü onkogenler, bağlı pluripotent kök hücreleri (iPSC) üretimini artırmak için bilinmektedir. Tüm diğer iPSC indükleyici genetik değişiklikler (OCT4, SOX2, KLF4, NANOG, LIN28 ve p53 kaybı) fonksiyonu da nispeten yüksek güvenlik endişesi de bunları yaparken, kanser bağlantılar var.

Kanser ile ilgili bu virüsler hücresel yeniden programlama ve pluripotency eğitim yararlı olsa da, güvenli bir şekilde kullanılması gerekir. Bu biyogüvenlik konuları ele almak için, düşük maliyet ve uygun taşıma hakkında ek vurgu ecotropic lentivirüs insan hücrelerinin transdüksiyon için bir yöntem göstermektedir. Biz% 90 daha fazla uyum sağlamak yeterince yüksek titreye sahip ecotropic lentivirüs reseptör ifade, bu yaklaşımın etkinliği doğrulayarak, virüse maruz kalan insan hücreleri.

Lentivirüs genellikle Ultrasantrifügasyon yoğunlaşmıştır; Ancak, bu işlem birkaç saat sürer ve infeksiyöz aerosollerin insan biyomedikal araştırmacıların üretebilir. Daha güvenli bir alternatif, viral parçacıkların, kondroitin sülfat ve polybrene (CS / PB) kompleks hücrelerin üzerine tortulaşmış olabilir gibi. Bu teknik, fonksiyonel viral titresi stably önemsiz eklenen zaman ve maliyet, fare retrovirüs reseptör ifade hücreleri 3-kat artar. Insan dermal fibroblastlar (HDFS) İletimi maksimum bu polimer konsantrasyonu ilgi hedef hücre tipi için titre edilmelidir, kanser hücre hatları için daha önce rapor edilen en iyi değerden yaklaşık 4 kat daha düşük CS / PB konsantrasyonları kullanılarak geliştirilmiştir. Bu nedenle yeni bir hücre tipi polimer toksisite için tahlil methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (MTT) kullanımını tanımlamak. Biz, minimal akut toksisite gösteren viral transdüksiyon sonra polimer kompleksleşme veya polybrene (PB, 6 mg / ml) standart dozda ya HDFS eşdeğer canlılığı gözlemliyoruz.

Bu protokol, biyogüvenlik riskleri azaltarak ve transdüksiyon hızını artırarak, insan hücrelerinde onkogenlerin aşırı ekspresyonu için ecotropic lentivirüs kullanımı açıklanmaktadır. Ayrıca viral parçacıkların aerosol oluşturan santrifüj kaçınarak transdüksiyon geliştirmek için polimer kompleksleşme kullanımını göstermek.

Protokol

1. Lentivirus production, harvest, and freezing

1. Consult your institutional safety official before beginning this protocol, and follow their recommended safety guidelines.
2. Day 1. Start with healthy, rapidly growing 293T cells to produce virus. Plate the cells at 5 x 10⁶ cells per 10 cm plate. Use antibiotic-free 293T medium (high-glucose DMEM with 10% FBS and 4 mM L-glutamine) for virus production.
3. Day 2. In the late afternoon, transfect 293T cells as follows (numbers given are for one 10 cm plate). Let all reagents warm up to room temperature. Pipette 375 μl OptiMEM into a microcentrifuge tube, then add 25 μl Fugene HD. Do not allow undiluted Fugene to contact the surface of the tube.
4. In a microcentrifuge tube, mix:
   • 5 μg transfer plasmid (Slc7a1, target vector, or fluorescent control vector)
   • 3.75 μg packaging plasmid (pCMV-dR8.91 or psPax2)
   • 1.25 μg envelope plasmid (pMD2.G for pantropic, pHCMV-EcoEnv for ecotropic)
   • serum-free OptiMEM to 100 μl
5. Combine the two tubes and incubate the mixture 20-30 minutes at room temperature.
6. Change the medium on the 293T cells to 10 ml fresh antibiotic-free 293T medium. Add the Fugene/plasmid mix drop-wise to the plate and incubate overnight at 37°C, 5% CO₂.
7. Day 3. Change medium on the 293T cells to 10 ml fresh antibiotic-free 293T medium. Be gentle, because 293T cells adhere only loosely and can slough off by media pipetted too forcefully onto the monolayer. Incubate for two days in a humidified incubator for virus production.
8. Day 5. Harvest virus and filter with a 0.45 mm low protein binding filter. Use immediately or dispense into single-use aliquots and freeze at -80°C. Frozen pantropic and ecotropic virus should be re-titered after it has been stored for six months and one month, respectively.
9. Titer the virus as follows, using cells that are relatively amenable to transduction. Transduce cells with fluorescent control virus overnight using serial dilutions (e.g. 1:10, 1:100, 1:1000) in fresh medium with 6 μg/ml PB. Change to fresh medium the next day. Allow the cells two days after transduction to begin expressing the fluorescent protein, then determine the fraction of transduced cells by FACS. Calculate the titer in transforming units (TU) per ml, based on dilutions that yield < 15% transduction to minimize multiple transduction events.
   

2. Transduction of human target cells with murine retrovirus receptor Slc7a1

1. Select a multiplicity of infection (MOI) = 2 to ensure that most cells will be transduced. For target cells that are resistant to transduction such as HDFs, a higher MOI will be required; we dilute the viral supernatant only 1:2 to achieve transduction of a majority of the cells.
2. Transduce target cells overnight with viral supernatant diluted in fresh culture medium with 6 μg/ml PB, which increases transduction by enhancing electrostatic interaction between the virus and target cell.¹ Ideally one should use a minimal volume of virus, such as 1 ml for a 35 mm plate, because diffusion is a limiting factor in transduction efficiency.
3. Culture cells for at least 48 hours after removing virus before transducing them with ecotropic virus, in order to ensure sufficient expression of the Slc7a1 receptor.
4. (Optional) It is possible to use blasticidin to select for stably transduced cells expressing Slc7a1, if desired. A blasticidin kill curve should be generated in advance to determine the lowest effective concentration, generally between 2 – 10 μg/ml, that kills all untransduced target cells in 7 days. About 2 days after removing the Slc7a1 virus, switch the transduced cells to medium containing blasticidin. Culture the cells in blasticidin-containing medium for 7 days, at which point all remaining cells will stably express the retrovirus receptor at which point they can be transduced with ecotropic virus as well as banked for future use as a stable Slc7a1-expressing line.

3. Polymer complex titration to determine toxicity

1. Day 1. Plate cells at 5000 cells/well in a 96-well plate, allowing at least triplicate wells for each experimental group. Include untransduced cells in complete medium to provide a baseline value for healthy cells, as well as samples consisting of cells in serum-free medium to induce growth arrest as a control. In parallel, plate cells in an appropriate format (such as a 24-well plate) for microscopic or FACS-based analysis of transduction efficiency in each experimental condition.
2. Day 2. Transduce cells in plates set up for both the MTT and FACS analyses with virus encoding GFP, at an MOI of 0.5 to transduce ~40% of target cells. Test varied concentrations of CS/PB (e.g. 50, 100, 200, 400, 600, and 800 mg/ml of each component), as well as 6 μg/ml PB, to determine optimal amounts. Generate polymer complexes as described in Part 4, below.
3. Day 3. Remove virus-containing medium and replace with fresh medium. Return the plates to a humidified incubator.
4. Day 5. Analyze FACS plate to determine the transduction efficiency with each polymer concentration.
5. Day 6. Remove the medium from all wells of the MTT plate and replace with 100 μl MTT solution (1 mg/ml MTT in complete medium). Culture for three hours in a humidified incubator to allow MTT to be reduced in the mitochondria of metabolically active cells.
6. Remove MTT solution and replace with 200 ml MTT solvent (0.1 N HCl, 0.1% Igepal CA-630 in isopropanol).
7. Incubate for two hours at room temperature or until all of the purple MTT formazan precipitate is dissolved. Read the absorbance on a microplate reader at 570 nm, subtracting the background reading at 690 nm.
8. Select the optimal polymer concentration that produces maximum enhancement of transduction, as determined by FACS, with minimal effect on metabolic activity, as determined by MTT. For HDFs, we selected 100 μg/ml CS/PB based on the data shown in the Representative Results, below.

4. Ecotropic transduction with polymer complexation

1. Prepare sterile-filtered stock solutions of PB and chondroitin sulfate at 20 mg/ml in water. Aliquot and store at -20°C.
2. Pipette viral supernatant into a microcentrifuge tube and dilute to the desired final concentration (e.g. MOI of 2) with fresh culture medium. Add equal volumes of PB and chondroitin sulfate (concentrations determined in step 3 above) in succession, flicking the tube to mix after each addition. The viral mixture will immediately become cloudy as precipitates form. Incubate the viral mixture at room temperature for 5 minutes to allow complex formation.
3. Remove media from the receptor-expressing target cells, replace with the viral mix, and incubate overnight at 37°C, 5% CO2. After removing the viral mix, wash the surface of the cells twice with PBS to aid in removing viral complexes. Complete removal is not necessary; we have observed no adverse effects on cell health from residual polymer complexes.

5. Verifying specificity of ecotropic transduction

1. When producing ecotropic virus for the first time, it is prudent from a safety perspective to verify that the virus is unable to transduce unmodified human cells. Transduce human cells with ecotropic lentivirus at relatively high concentration (only a 1 to 2-fold dilution of viral supernatant in fresh medium) overnight with 6 μg/ml PB or optimized CS/PB concentration.
2. Remove virus-containing medium and replace with fresh medium. After incubating cells for 2 days, validate transgene expression by FACS using fluorescent vectors and/or by RT-PCR with transgene-specific primers.

6. Representative results:

Fig. 1A shows the lentivirus production process, and Fig. 1B shows transduction of human cells with ecotropic lentivirus, including pre-transduction with murine retrovirus receptor Slc7a1. For titering virus, we use a human rhabdomyosarcoma cell line stably transduced with Slc7a1 (Slc-hRMS). When using fluorescent control vectors to monitor transduction efficiency, we routinely achieve > 90% transduction efficiency of Slc-hRMS with ecotropic virus, as shown in Fig. 2A and 2B. Transduction rates of HDFs are generally lower because the cells have not been blasticidin-selected for receptor expression (Fig. 2C). Titers of ecotropic lentivirus are generally 10-20% of VSV-pseudotyped virus when measured on Slc-hRMS (Fig. 2D).

One freeze-thaw cycle reduces titer of ecotropic virus by 16 - 3%, equal to titer loss during a single freeze-thaw cycle of VSV-pseudotyped virus (p > 0.05). Contrary to previous reports,² we observe no positive effect on virus titer from flash freezing in dry ice. Rather, we achieve higher post-thaw titers of either pseudotype by simply placing tubes of virus into a -80°C freezer (data not shown).

The MTT viability assay allows sensitive detection of growth arrest in target cells. Transduction with virus plus concentrations of CS/PB up to 800 μg/ml has no effect on HDF metabolism (Fig. 3A). Exposure to CS/PB without virus also has no toxic effect on cells (data not shown). FACS analysis of HDFs transduced with virus plus various concentrations of CS/PB shows enhancement of transduction compared to PB alone (Fig. 3B). The maximum enhancement occurs at 100 μg/ml CS/PB (Fig. 3C), several-fold lower than previously reported values.³ Thus, it is important to optimize conditions for any given target cell type.

Complexation with CS/PB enhances the observed titer roughly 3-fold in Slc-hRMS (Fig. 4A, p < 0.01). In practice, this yields a greater effect on transduction efficiency at low virus concentrations than at higher concentrations (Fig. 4B), which is most likely due to multiply transduced cells and receptor saturation at higher virus concentrations.

Transduction with ecotropic virus is specific for cells expressing murine retrovirus receptor. When transducing unmodified human cells with ecotropic virus, we have not observed fluorescence greater than the untransduced background whether using PB or CS/PB, as shown in Fig. 5A. Microscopically, HDFs show no transduction in the absence of receptor (Fig. 5B) while pre-transduction with receptor results in fluorescent cells (Fig. 5C).

Figure 1. Schematic view of (A) the virus production process and (B) transduction of human cells with murine retrovirus receptor followed by ecotropic lentivirus.

Figure 2. High-efficiency transduction of human cells with ecotropic lentivirus encoding GFP. Cells were pre-transduced with murine retrovirus receptor Slc7a1. (A) Human rhabdomyosarcoma cell line blasticidin-selected for Slc7a1 (Slc-hRMS), transduced (blue) or untransduced (pink) with GFP. (B) Fluorescent micrograph of ecotropic-transduced Slc-hRMS (4X). (C) HDFs transduced (blue) and untransduced (pink) with ecotropic GFP lentivirus; cells were transduced with Slc7a1 two days prior to ecotropic transduction. (D) Titer of VSV-G pseudotyped and ecotropic lentivirus, measured on Slc-hRMS.

Figure 3. Optimizing chondroitin sulfate/polybrene (CS/PB) concentrations in human dermal fibroblasts. (A) Viability of HDFs measured by MTT assay after transduction in the presence of PB only or with varied concentrations of CS/PB. (B) Enhancement of transduction efficiency in HDFs by different concentrations of CS/PB, measured by FACS. (C) Quantification of transduction enhancement, showing that maximum transduction occurs at 100 μg/ml CS/PB.

Figure 4. Effect of 400 μg/ml CS/PB on transduction of Slc-hRMS with ecotropic lentivirus. (A) Titer enhancement, and (B) fold change in transduction rate compared to 6 μg/ml polybrene alone.

Figure 5. Lack of ecotropic transduction of HDFs in the absence of murine retrovirus receptor Slc7a1. (A) FACS plot of BJ human fibroblasts, untransduced (pink) or transduced (blue) with ecotropic GFP lentivirus in both cases in the absence of receptor Slc7a1. BJ human fibroblasts transduced with ecotropic GFP lentivirus, without (B) and with (C) pre-transduction with receptor Slc7a1 (4X).

Tartışmalar

Moloney fare lösemi virüsü (MLV) ve onun reseptörü mSlc7a1 dayalı Rekombinant ecotropic gammaretrovirus iyi çalışılmış ve yaygın olarak kullanılabilir, fare hücreleri transgenlerin sunmak için 20 yılı aşkın süredir kullanılmaktadır. Ecotropic gammaretrovirus insan hücrelerine onkogenler sunmak için de son zamanlarda daha çok olmuştur. Hücresel yeniden programlama bağlamında, mSlc7a1 kullanımı iyi kurulmuş amphotropic virüs barındıran insan onkogenler nesil önlemek için ^4,5 Ancak, lentivirüs gammaretrovirus göre önemli avantajlar sağlar lentiviral ön-entegrasyon kompleksi sağlar çünkü refrakter hücre popülasyonlarının, sık sık yeniden programlama için arzu edilen ^{hedeflere 6} dahil birincil hücreler, uyum olmayan bölünen hücreleri ^{transdüksiyon} 7

Lentiviruses MLV virüs tropizm, toksisite ve diğer özellikleri ⁸ MLV pseudotyped ecotropic lentivirüs fare hücreleri, ⁹ uyum sağlamak olmuştur ama insan hücreleri üzerinde nadiren kullanılır olmuştur değiştirmek için bir çaba da dahil olmak üzere onlarca farklı pseudotypes, ile üretilmiştir ¹⁰ Bu nedenle, insan hücrelerinde hücresel yeniden programlama faktörler de dahil olmak üzere, bilinen ya da şüphelenilen onkogenler, teslim etmek için güvenli, uygun maliyetli ve yüksek verimli bir araç olarak MLV pseudotyped ecotropic lentivirüs kullanımını öneriyoruz.

Daha doğrusu, bu protokol, kanserle ilgili virüsleri ile self-aşılama potansiyel araştırmacılar, yalıtım, pantropic virüs onkogen (ler) ayırır; bu protokolü tamamen pantropic lentivirüs üretmek ve kullanmak gereksinimini ortadan kaldırmak olmadığını not etmek önemlidir. Protein mSlc7a1 ve insan homologu hSlc7a1 yayg amino asit taşıyıcıları bilinen Tümör Gelişimi veya alıcı hücreler üzerinde seçici bir büyüme avantajı tanımak yeteneği, ¹¹ amphotropic virüs içine dahil edilmesi için nispeten düşük riskli verme mSlc7a1 ile ifade edilir. Bu adım, gerekli biyogüvenlik düzeyi adanmış virüs veya doku kültürü tesisleri eksik laboratuvarlarda özellikle yararlı olabilir.

Bazı durumlarda pantropic virüsü hedef hücreleri doğrudan Slc7a1 plazmid transfecting kullanımı tamamen ortadan kaldırmak için mümkün olabilir, ancak bu tekniğin yararlı hedefler olacaktır birçok hücre transfeksiyon dirençli. Alternatif olarak, izole etme yeteneği blasticidin seçim hücreleri Slc7a1-transduced VSV-G pseudotyped lentivirüs ecotropic virüs bu hücrelerin çoğu için uyum sağlamak rutin olarak kullanılan bu tarihten sonra reseptör eksprese eden hücrelerin, bir stok oluşturmak için bir kez kullanılabileceği anlamına gelir deneyler. Araştırmacılar, her zaman tropizm ne olursa olsun, herhangi bir lentivirüs çalışan için kurumsal güvenlik yönergeleri takip etmelidir.

Bu protokol ile elde ecotropic virüs titreleri orta önceki çalışmalar ile anlaşma genellikle VSV pseudotyped virüs, pantropic virüs titresi% 10-20 daha düşüktür. ⁹ Bu titreleri stably Slc7a1 ile transduced insan hücrelerinde ölçüldü, bu nedenle alt ecotropic virüs için gözlenen titresi hedef hücrelere reseptör geninin çeşitli ifade kısmen olabilir. Bununla birlikte, protokolde elde viral titreleri çoğu uygulama için yeterli olandan daha fazla ve bazı durumlarda, hücrelerin çoğunluğunun transdüksiyon yol>% 90 hücre.

Santrifüj tabanlı teknikler genellikle viral parçacıkların konsantre kullanılır. Ancak, santrifüj, birkaç saat gerektirir infeksiyöz aerosollerin üretir ve viral parçacıkların önemli bir kaybına neden ^olabilir. 12, CS / PB ile kompleks bir alternatif olarak viral tropizm değiştirmeden transdüksiyon geliştirmek için ^{kullanılabilir.} 3 Bu yöntem (5 dakika hızlıdır gözlenen titresi yaklaşık üç katına ise, (10 ml virüs başına $ 0.03)) ve ucuz. Hiçbir özel ekipman veya tescilli reaktifler ve gerekli diğer hücre hatları önceki çalışma ile anlaşma, CS / PB HDFS maruz kaldıktan sonra en az akut toksisite gözlenen bu ^protokol 13 Bir potansiyel dezavantajı bazı mikroskobik görünür polimer kompleksleri uymasını kültür hücreleri birkaç gün. Biz bu kompleksleri, hücrelere açıkça zehirli olmasa da, hücresel süreçleri daha ince etkileri olabileceği olasılığını ekarte edemez.

Burada güvenli ve verimli bir şekilde onkojenik faktörleri ile insan hücrelerinin uyum için bir metodoloji tarif var. Bu yaklaşım, iPS hücreleri de dahil olmak üzere onkogenler ve kök hücre biyolojisi inceleyen araştırmacılar için harika bir yardımcı programdır olmalıdır.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktifin Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
pLenti6/UbC/mSlc7a1	Addgene	17224	Murin MLV reseptör
pMD2.G	Addgene	12259	VSV-G zarf
pCMV-dR8.91	D. Trono laboratuar 14		Ambalaj plazmid (eşdeğer plazmid psPax2 Addgene edinilebilir, Kedi Numarası 12260)
pHCMV-EcoEnv	Addgene	15802	Ecotropic zarf
FUGW	Addgene	14883	Plazmid GFP kontrolü
OptiMEM	Invitrogen	31985
Fugene HD	Roche	04 709 705 001
Hexadimethrine bromür (Polybrene)	Sigma-Aldrich	H9268
Kondroitin sülfat sodyum tuzu köpekbalığı kıkırdağı	Sigma-Aldrich	C4384
Blasticidin S	Balıkçı	BP 2647100
Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (MTT)	Sigma-Aldrich	M2128
Igepal CA-630	Sigma-Aldrich	I3021