Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.
Method Article
Flash ve ReAsH biarsenical boyalar özellikle proteinlerin tetracysteine motiflerine bağlanır ve seçici canlı hücrelerde protein etiketleyebilirsiniz. Son zamanlarda bu etiketleme stratejisi, farklı protein konformasyonlar veya oligomerik devletler için sensörler geliştirmek için kullanılır olmuştur. Biz etiketleme yaklaşımı tanımlar ve yöntemleri kantitatif bağlayıcı analiz etmek.
Floresan proteinleri ve boyalar, hücrelerin protein kaçakçılığı, yerelleştirme ve fonksiyon çalışması için gerekli araçları vardır. Yeşil floresan proteininin (GFP) gibi floresan proteinleri yoğun proteinlere füzyon ortağı olarak küçük etiketleri konformasyonel değişikliği gibi hücrelerin incelenmesi gereken proteinlerin yeni işlevler sağlayan bir protein ilgi 1 özellikleri, son gelişmeleri takip etmek için kullanılmış olsa da ve protein dernek 2, 3. Bir küçük etiket sistemi genetik biarsenical boyalar bağlayan bir hedef protein, içine yerleştirilen bir tetracysteine motifi (CCXXCC) içerir ReAsH (kırmızı floresan) ve Flash (yeşil floresan), 2 canlı hücrelerinde bile yüksek özgüllüğü. TC / biarsenical boya sistemi, konformasyonel değişikliği ve protein-protein etkileşimleri 4-7 ölçmek için birçok yeni yaklaşımlar sağladı floresan proteinleri daha ana proteine daha az sterik kısıtlamalar sunmaktadır . Yakın zamanda hücrelerde mutant huntingtin ifade oligomerization, sensörler, bir roman gibi TC etiketleri uygulama geliştirdi Huntington hastalığı 7 nöronların agrega mutasyona uğramış. Huntingtin iki floresan boyalar, bir protein konumunu izlemek için floresan protein ve sadece monomerlerin biarsenical boyalar bağlayan ikinci bir TC etiketi ile etiketlenmiş. Bu nedenle, protein ve biarsenical boya reaktivitesi arasında ko değişiklikler hücre içinde mekansal eşlenebilir mikroskopik oligomer içerikler sağladı. Burada, Flash veya ReAsH canlı memeli hücrelerinde ve nasıl iki renkli floresan (Kiraz / Flash CFP / / Flash veya GFP ölçmek için bir floresan proteini (Kiraz, GFP veya CFP) erimiş TC etiketli proteinlerin nasıl etiketlemek için tarif ReAsH kombinasyonları).
1. ReAsH / Flash ile etiketlenmesi için hücrelerin hazırlanması
TC etiketleri belirli bağlayıcı ölçüde değerlendirmek ve odaklı mikrograflar toplama kanalları arasında floresan bleedthrough değerlendirmek için pozitif ve negatif kontrollerin kullanılması önemlidir Not. Bu nedenle, iki renk (örneğin Flash / Cherry veya ReAsH / CFP veya ReAsH / GFP kombinasyonları), örnekler, tek renk (örneğin Floresan protein tek başına ya da mümkünse hiçbir floresan ile Flash / ReAsH ama bağlı TC-etiketli bir protein için hazırlanan sağlamak protein)
Hücreler ekleyerek Flash / ReAsH eklemeden önce EDT ekleyebilir ve hemen önce tampon yapmak önemlidir. 37 ° C dokusunda kültür inkübatör tam 30 dakika boyunca inkübe. Eşiğe deneyimimiz uzun inkübasyon süreleri önemli ölçüde artırır. Yeni yapıları da, zaman ve Flash / ReAsH konsantrasyonu (0.5-2 mcM) etiketlenmesi için optimize edilmelidir.
Bu yıkamadan sonra, hücreler, bu non-spesifik biarsenical boya floresan artırdığını bulduk rağmen paraformaldehid (% 3.2 solüsyonu ile 15 dakika) ile sabit olabilir. Bu nedenle genellikle görüntü hücreleri oda sıcaklığında yaşıyor. (Etiketleme biarsenical boya bağlanmasını engelleyen önce bu hücre fiksasyonu unutmayın.)
2. Görüntüleme konfokal mikroskop hücreleri
3. Verilerin analizi
4. Temsilcisi sonuçları:
Biarsenical boya ile etiketleme hücrelerin başarı, birkaç anahtar parametreleri bağlıdır. Öncelikle, boya ile etiketleme zamanlaması çok önemlidir. Biz bulduk, etiketleme uzun süre (30 dakika daha fazla) yüksek düzeyde bir non-spesifik bir arka plan boyama sonuç. Şekil 1, daha önce 7 açıklandığı gibi TC etiketi içeren CFP türev Cerulean erimiş huntingtin parçası yabani tip formu (25Q) için tipik bir sonucu gösterir . Bu örnek ReAsH ile 30 dakika boyanmış ve TC etiketi eksik örnek minimal arka plan var. Biz paraformaldehid artar arka plan ile hücre sabitleme metanol ile tespit floresan protein etiketi floresan lağvetti ederken bulduk. Bu nedenle hücreler mümkünse biz görüntü canlı. Ayrıca bu fiksasyon önce dikkat etmek önemlidir.biarsenical boya ile etiketleme için TC motifi değişiklikler nedeniyle, muhtemelen onların bağlayıcı önler.
Tutarlı sonuçlar elde etmek için bir başka kritik faktör, hücre yoğunluğu. Biz, gevşek bir şekilde dağıtılmış ve aynı zamanda geniş bir topaklanma farklı hücreler biarsenical boyaların düzensiz boyanma yol açabilir görüntü hücreleri kritik bulduk.
Şekil 1 Tetracysteine etiketleri ve huntingtin (exon1-25Q) Cerulean füzyonlar ile transfekte canlı hücrelerde ReAsH boyanma. TC etiketi huntingtin Cerulean füzyon (7 açıklandığı gibi) kavşak noktasında yer almaktadır. Piksel yoğunluğu korelasyon arsa hücre boyunca bağlayıcı ReAsH farklılıkları bir değerlendirme sağlar ve konformasyonel değişikliği veya ligand etkileşimleri nedeniyle bağlayıcı ReAsH değişiklikler harita için kullanılabilir.
Ikinci bir boya ile floresan protein ve konformasyonel özellikleri ile etiket protein lokalizasyon yaklaşımı farklı proteinlerin konformasyonlar hücreleri ve protein konformasyonu dinamiklerini değiştiren olaylar tahakkuk haritalama için çok potansiyel sunmaktadır. ReAsH / Flash ilk memeli hücresel retinoik asit bağlayıcı protein 4 protein katlanması için bir hücre sensörü olarak kullanılmıştır. Bu örnekte, bir TC etiketi bağlı Flash gelişeceğini formuna göre katlanmış şeklind...
Çıkar çatışması ilan etti.
Bu çalışma DMH ve TDM (NHMRC proje hibe) bağışları ile finanse edilmiştir. DMH Miegunyah Trust tarafından finanse edilen bir Grimwade Üyesi.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reaktif Adı | Şirket | Katalog Numarası | Yorumlar |
---|---|---|---|
Μ-slaytları 8-iyi | Ibidi | 80826 | Biz bu odasına görüntüleme için kültür hücreleri için özellikle yararlı olabilmesi için slaytlar bulabilirsiniz. |
TC-Flash II Tetracysteine Etiket algılama hücresinde Kiti * yeşil floresan * * canlı hücre görüntüleme | Invitrogen | T34561 (Flash) veya T34562 (ReAsH) | |
Hanks 'Dengeli Tuz Çözeltisi | Invitrogen | 14175-103 | |
2,3-Dimercapto-1-propanol | Sigma-Aldrich | D1129-5ML | |
1,2-Ethanedithiol | Sigma-Aldrich | 02.390-25ml |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır