Tümör Hücrelerinin vaskülojenik Faaliyet değerlendirin bir Matrigel Tabanlı Tüp Oluşumu Testi

Özet

Bir tüp oluşum denemesi tümör hücrelerinin damar etkinliğini değerlendirmek için kullanılır.

Özet

Geçtiğimiz birkaç on yıl içinde, bir tüp oluşum denemesi büyüme kullanarak faktör-azaltılmış Matrigel genellikle vasküler endotelyal hücrelerin in ^vitro 1-5 anjiyogenik faaliyet göstermek için istihdam edilmiştir . Ancak, son zamanlarda giderek artan kanıtlar, bu testte, vasküler endotelyal hücreler için davranış test etmek için sınırlı olmadığını göstermiştir. Bunun yerine, aynı zamanda tümör hücrelerinin damar ^fenotip 6-8 geliştirmek için bir dizi yeteneğini test etmek için kullanılır olmuştur . Bu yeteneği, xenotransplanted hayvanlar, vaskülojenik taklit ^(VM) 9 olarak bilinen bir süreç olarak tanımlanan vaskülojenik davranışı ile uyumlu idi . Tümör hücre-aracılı VM, endotelyal hücre ^{anjiyogenez 6,} 10-13, bağımsız, tümör gelişiminde hayati bir rol oynar gösteren çok sayıda kanıt vardır. Örneğin, tümör hücrelerinin melanoma ve glioblastoma hasta ^{8, 10, 11} kan, doku örnekleri perfüze, vasküler kanal oluşumu katılmak bulundu . Burada, tümör hücrelerinin vaskülojenik aktivite değerlendirilmesi yararlı bir araç olarak bu borulu şebeke tahlil nitelendirdi. Biz böyle melanom B16F1 hücreleri, glioblastoma U87 hücreleri ve meme kanseri MDA-MB-435 hücre gibi bazı tümör hücre hatları vasküler tübüller formu mümkün olduğunu, ancak bazı kolon kanseri HCT116 hücreleri gibi değil. Ayrıca, bu vasküler fenotip Matrigel kaplanmış hücre sayıları bağlıdır. Bu nedenle, bu testte vasküler potansiyel vasküler hücreler, tümör hücreleri gibi diğer hücrelere de dahil olmak üzere çeşitli hücre tipleri ekrana güçlü bir yardımcı olarak hizmet verebilir.

Protokol

1. Tümör Hücrelerinin vaskülojenik Faaliyet değerlendirin bir Matrigel Tabanlı Tüp Oluşumu Testi

1. , Tümör hücreleri ve mikrovasküler endotel hücreleri Hazırlanması: U87 hücreleri, melanom hücrelerinin B16F1, meme kanseri MDA-MB-435 ve kolon hücrelerinin HCT116 gibi beyin tümör hücreleri (% 10 FBS ve penisilin / streptomisin ile desteklenmiş DMEM yetiştirilen tüm Invitrogen gelen .) Endotel hücre hattı insan mikrovasküler endotel hücreleri (HMVECs) 1 mcg / ml hidrokortizon ve 1 ng / ml epidermal büyüme faktörü,% 10 FBS ve penisilin / streptomisin ile desteklenmiş EBM2 orta (Lonza) kültüre edildi. Hücreler PBS üç kez yıkanır ve% 0.05 tripsin / EDTA (Invitrogen) ile müstakil edildi. 2,000 rpm ile 5 dakika süreyle santrifüj sonra, hücre pelletleri tekrar PBS ile yıkandı. Sonra, bir hemasitometre pelet hücreleri sayıldı.
2. Matrigel hazırlık: Bir kısım büyüme faktörü-azaltılmış Matrigel (BD Bioscience), oda sıcaklığında ısınmış. Tamamen çözülmüş önce, buz üzerine transfer edildi ve sıvı, en az 10 dakika boyunca buz üzerinde tutulmalıdır. Sonra Matrigel 50 ul Matrigel eşit olarak dağıtmak için izin veren bir yatay düzeyde 96-kuyucuğu kaplama, 37 ° C'de 30 dakika inkübe edildi
3. Tüp oluşumu: hücreler (1-2 x 10 ^4), endotel hücreleri tümör hücrelerinin ya da EBM-2 serum serbest DMEM ile yeniden askıya alınan ve Matrigel üst üzerinde yüklü idi . Bu testte tübül gelişimi üzerine bazı ajanların etkilerini ölçmek için kullanılmış ise, bu ajanlar (uyarıcıları veya inhibitörleri), serum serbest orta eklendi. Her koşullu grup 4-6 kuyu içeriyordu.
4. Görüntü ve veri analizi: 37 takiben kuluçka ° C gecede, her iyi, doğrudan mikroskop altında incelendi. Tübüller sabitleme için gerekli olsaydı,% 10 formalin tuzlu tabanlı çözüm ul 100 nazikçe eklendi ve on dakika sonra, analiz için hazır. 10x faz kontrast mikroskop altında, her alanda tübüller görüntülü ve ortalama 3-5 rastgele alanlardan her kuyuda Tübüllerin bir sayılmıştır.

2. Temsilcisi Sonuçlar:

Bu tübüller, poligon ağı oluşturmak bağlanmak uzatılmış hücre gövdeleri üretilmişti HMVECs, pozitif kontrol olarak kullanıldı. B16F1, U87 ve MDA-MB-435 hücre HMVECs tarafından oluşturulan benzer vasküler tübüller geliştirilmiş, ancak HCT116 hücreleri (Şekil 1) vermedi. Doza bağımlı bir hücre tüp oluşumu U87 hücreleri test edildi. Şekil 2'de gösterildiği gibi, 10.000 hücreleri durdurulan tübüller kurdu. Hücrelerin iki katına sonra, sağlam bir damar ağı HMVECs olarak görülen karşılaştırılabilir. Buna karşılık, 5.000 'den az hücreleri vasküler bir fenotip oluşturmak için başarısız oldu.

Şekil 1 Tüp oluşumu HMVECs, U87, MDA-MB-435, ve B16F1 hücreleri tarafından uyarılan, ancak HCT116 hücreler, tüm hücrelerin (2 x ¹⁰ 4) Matrigel üzerinde yüklü olan ve gece boyunca inkübe edildi . Tübüller faz kontrast kullanılarak görüntülenmiştir. HMVECs Pozitif kontrol olarak kullanılmıştır. 3-5 alanların bir temsilci gösterildi. Bar: 100 mikron.

Şekil 2 hücre sayısı bağımlı bir şekilde hücre kaynaklı U87 tübüller Farklı sayıda köşeleri belirtildiği gibi U87 hücrelerinin tüp oluşumu için kullanılmıştır. HMVECs pozitif kontrol için kullanılmıştır. Bar: 100 mm.

Tartışmalar

Bu testte başarılı olmak için, Matrigel kalitesini ilk test edilmelidir. Bioscience BD HMVECs kullanarak tahlil öncesi çalıştırmak için küçük bir örnek alınabilir. Farklı parti ürünleri, bazı çok sayıda tüp oluşumu için en uygun durumda vermezseniz hangi benzemeyen nitelikler gösterebilir. Matrigel bir kısım 96-kuyucuğu yüklendiğinde kabarcıkları tübül oluşumu bozabilir çünkü İkincisi, herhangi bir kabarcıkları kaçınılmalıdır olmalıdır. Minik kabarcıklar iyi tespit edilir...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktifin Adı	Şirket	Katalog numarası
DMEM	Invitrogen	11995
FBS	Invitrogen	16000-044
Büyüme faktörü-azaltılmış Matrigel	Bioscience BD	47743-720
EBM2 kiti	Lonza	CC-3156
Nikon ECLIPSE TS100 mikroskop	Nikon