Amyotrophic Lateral Sclerosis ve Travmatik Spinal Kord Yaralanması Servikal Ventral Horn Hedefleme intraspinal Hücre Transplantasyonu

Özet

Sinir habercisi nakli, korunması ve / veya spinal kord yaralanması (SCI) ve motor nöron bozukluğu, amiyotrofik lateraller skleroz (ALS) kaybettim / işlevsiz servikal frenik motor nöronların yerini gelecek vaat eden bir strateji. Biz, ALS ve SKY kemirgen modellerinde servikal omurilik ventral boynuz hücre teslimat için bir protokol sağlar.

Özet

Frenik motor nöron kaybına bağlı olarak solunum yetmezliği, insan travmatik omurilik yaralanması büyük bir kısmı ^(SCI) olguda 1 bir zayıflatıcı bir sonucudur ve nihai motor nöron bozukluğu, amiyotrofik lateraller skleroz ^(ALS) 2 olan hastalarda ölüm sebebidir.

ALS, üst nispeten hızlı bir dejenerasyon ve alt motor nöronlar ile karakterizedir yıkıcı bir nörolojik bozukluktur. Ortalama 2-5 yıl hastalık nihayetinde yenik hastalar diyafram ³ frenik motor nöron innnervation kaybı nedeniyle solunum felci tanısı. % 10 ailesel formu ise vakaların büyük bir çoğunluğu, sporadik. Ailesel vakaların yaklaşık yüzde yirmi Cu / Zn süperoksit dismutaz 1 (SOD1) gen, kromozom ²¹ 4 üzerindeki çeşitli nokta mutasyonlarının bağlantılıdır . Mutant insan SOD1 genler ^{(G93A, G37R, G86R, G85R)} taşıyan transgenik farelerin ^4,5 ve sıçanlarda ⁶ üretilen ve motor nöron kaybı diğer hayvan modelleri varlığına rağmen, şu anda hastalığın en çok kullanılan modeller var .

Spinal kord yaralanması (SCI), ^yaralanma 7 tipi, yeri ve şiddetine göre değişen koşulları, fiziksel travma, omurilik çıkan fonksiyonel sonuç ile heterojen bir set . Bununla birlikte, insan SKY vakalarının yaklaşık yarısı frenik motor nöron kaybı ve yaralanma bulbospinal solunum ^aksonları 1 inen zayıflatıcı solunum fonksiyon bozukluğu nedeniyle, servikal bölgeleri etkiler . SCI hayvan modellerinde bir dizi en yaygın olarak kullanılan ve klinik olarak ilgili kontüzyon ⁸ ile geliştirilmiştir.

Nöral prekürsör hücreler (NPC) çeşitli sınıflar Nakli nöro kayıp ya da işlevsiz MSS hücre tipleri, sağlamak yerine, gen faktörler sunmak için yeteneği nedeniyle, ALS ve SCI de dahil olmak üzere, travmatik CNS yaralanmalar ve nörodejenerasyon, tedavisi için umut verici bir tedavi stratejisi ilgi ^9.

ALS ve SKY hem de hayvan modelleri, frenik motor nöron kaybı ve buna bağlı olarak solunum ^uzlaşma 10,11 dahil olmak üzere, bu hastalıkların pek çok klinik ilgili yönlerini, model olabilir. ALS ve SCI bu hayvan modellerinde solunum fonksiyon NPC tabanlı stratejilerin etkinliğini değerlendirmek için, hücresel müdahaleler özellikle frenik motor nöronlar gibi terapötik ilgili hedefler içeren bölgeler olmalıdır. Biz SOD1 ^G93A fareler ve sıçanlar, yanı sıra omurilik sıçan ve fareler ¹¹ gibi nörodejeneratif modelleri servikal spinal kord ventral gri cevher içine NPC'ler çok segmental, intraspinal nakli için ayrıntılı bir protokol sağlar.

Protokol

Yöntemleri

1. Hücre Hazırlık

Örnek olarak, biz, çünkü bu hücre tipi ile deneyimimizin glial progenitör hücrelerinin nakli ^için 12 hazırlanıyor prosedür anlatacağız . Ancak, orta ve örneğin tripsin kullanımı da dahil olmak üzere protokol özelliklerini, transplantasyon için kullanılan özel hücre türüne bağlı olacaktır.

1. 37.0 Pre-sıcak tüm çözümler ° C su banyosu.
2. HBSS balon 2X durulayın. 0.05% tripsin / EDTA 5.0 mL/T-75 şişesi ekleyin. 37.0 ° C inkübatör 3 dakika şişesi inkübe edin. 5 veya 10 ml pipet ile balon hafifçe 3X Karışım.

İsteğe Bağlı: 1.0 mg / ml soya tripsin inhibitörü DMEM/F12 olarak ekle 5.0 mL/T-75 balon.

3. 5.0 mL orta her şişesi 2X durulayın. Havuz hücreleri ve durular. Tüm sonraki basamaklar için buz üzerinde hücrelerin tutun.
4. Konik tüp içinde 5 dakika boyunca 200-300 g Spin: tercihen santrifüj 4 soğutmalı ° C Durusu (ve kaydetmek) süpernatant. 1,0 mL orta hücreleri yeniden askıya alma, ve transfer 1,5 ml Eppendorf tüpüne.
5. Canlılığını belirlemek için Tripan Mavi kullanarak hemasitometre hücreleri saymak.
6. 1.5 ml tüp (tercihen santrifüj 4 soğutmalı ° C 10 dakika için 800 RPM) yine Spin Durusu (ve kaydetmek) süpernatant.
7. Orta istenilen son hacim hücrelerin uygun hücre yoğunluğu elde etmek için yeniden askıya.
8. Hücre süspansiyonları birden fazla 1.5 ml Eppendorf tüpleri dağıtın. Hücrelerinin nakli kadar ıslak buz üzerinde tutun.

Hamilton şırınga / iğne bu tüp içine derin sığamaz olarak, 0.75 ml tüpler kullanmayınız. Çoklu enjeksiyonlar olasılıkla ameliyat oturumları sırasında yapılan ve bir hücreleri pek çok kez aynı tüp rahatsız etmemek için istiyor. Gerekli olandan en az% 50 daha fazla hacim hücre süspansiyon hazırlamak için deneyin. Hücreleri cerrahi oturum boyunca buz üzerinde tutun. Hücreleri yazılan transplantasyon büyük canlılığı sağlamak için hücre süspansiyonlarının hazırlanması 4-5 saat içinde nakli hücreleri.

2. Cerrahi için önce hazırlanması

1. Ameliyat öncesinde ilgili temel davranış değerlendirmeler Davranış.
2. İmmun supresyonu: subkutan Siklosporin A (CSA: 10,0 mg / kg vücut ağırlığı) veya intraperitoneal (IP) FK-506/Rapamycin (1.0 mg / kg vücut ağırlığı) nakli için en az 3 gün önce başlamış olmalı, olmalı kurban kadar günlük olarak verilmiştir. Içme suyu (günlük enjeksiyonlar yerine) Yönetim tavsiye edilmez. Kemirgen kökenli hücrelerin nakli, insan kökenli hücrelerin nakli FK-506/Rapamycin bizim seçimimiz ise CSA, seçim bizim immünosupresan.
3. Cerrahi aletler, cerrahi öncesi Otoklav. Ameliyatı yapmak için düzenli ve temiz bir yerde, hem de araçları koymak için derli toplu bir yer hazırlayın. Bir cam boncuk sterilizatör de yararlıdır. Bu işlem çok daha kolay yapacak, ameliyat sırasında tüm araçlar temiz (özellikle rongeur) tutun. Cerrahi işlem sırasında kullanılan her türlü malzemenin steril olması gerekmektedir.
4. Gibi cerrahi mikroskop gibi sterilize edilemez Aletleri uygun bir dezenfektan ile silinmelidir ve cerrah, bir kez steril eldiven giydiğinde, onun / onun eldiven kontamine olmadığı, steril bir malzeme (örneğin gazlı bez) ile kaplı kolları.
5. Cerrah ameliyat başlamadan önce bir dezenfektan (klorheksidin fırçalayın) / ellerini yıkamalıdır. Cerrah, steril eldiven, yüz maskesi, ve temiz bir önlük giyecektir.

3. Cerrahi: Hayvan Hazırlama ve Cerrahisi

Hayvan Hazırlık:

1. Tartılır, hayvan ve uygun dozda anestezi uygulanacak: Isofluorane solunum veya anestezi kokteyl (IP üzerinden teslim) [acepromazine maleat (0.7 mg / kg), ketamin (95 mg / kg) ve xylazine (10 mg / kg)].
2. Pinch ayak ve / veya hayvan düzgün anestezi olup olmadığını belirlemek için (yanıp sönen gözlemlemek için pamuk uçlu bir aplikatör ile üst göz kapağı dokunmadan) palpebral refleks kullanabilirsiniz. Kornealar, ameliyat öncesinde bir suni gözyaşı merhemi uygulanarak korunmalıdır.
3. (Herhangi bir eklenti gerekli) elektrikli tıraş makinesi ile saç tıraş. Hayvanın arka orta kulaklar için biraz rostral Tıraş. Iyi Tıraş, cilt ve saç kesi içine almak önlemek için kesilmiş saç kaldırmak. Cerrahi hazırlık, cerrahi, cerrahi alan sokak saç kirlenmesini önlemek için yapılacaktır alanından uzakta yapılmalıdır.
4. Povidin-İyot antiseptik solüsyon ile gazlı bez Soak ve traş alana cilt için geçerlidir. Cerrahi alan, çevre doğru sitenin merkezine fırçalayın dikkatli olmak, povidin-İyot çözeltisi ile en az iki kez temizlendi olmalıdır. Bu site daha sonra% 70 alkol veya sulandırılmış antiseptik fırçalayın ile yıkanabilir. Alanda steril örtüler ile kaplanmış olmalıdır.
5. Ameliyat boyunca, ısıtma i padler çok hayvanın normal vücut ısısını korumak için önerilir. Buna ek olarak, vücut sıcaklığı kontrol edilmelidir. Haddelenmiş gazlı bez yerleştirin hayvan. Yetişkin bir sıçan için, rulo gazlı bez kalınlığı ~ 1.0 inç ve 6.0 inç uzunluğunda olmalıdır. Cerrahi kurulu Teyp Bu ped hareket etmez böylece. Göğüs / omuz seviyesinde yastık yerleştirin hayvan. Cerrahi kurulu silah pad üzerinde silah ve teyp gerin. Fikir kadar nedenle servikal kord derin cilt yüzeyinin altında bulunan bu yana ameliyat boyunca çalışmak için daha kolay olduğunu servikal spinal kord pervane.

Cerrahi:

6. (8 x büyütme), en düşük mikroskop büyütme içerik orta hat kesi yapmak için neşter bıçağı kullanın. Öte yandan cildi gergin yapmak için (cilt kesilirken kolaylaştırır) ile yanal cilt Stretch, skapula için kafa tabanına kesi yapmak. (Bkz. Şekil 1)
7. Omurga üzerinden 3 kas tabakaları yoluyla kesi yapmak için neşter bıçak kullanın. Hafif Öte yandan her iki tarafta (lateral medial) kas sıkmak. Kas kesiler daha kolay ameliyat sonunda dikilmesi kılan, pürüzlü olması, böylece mümkün olduğu kadar az sayıda kesim ile tüm kas tabakaları kesmek için neşter yeterince sıkıca basın emin olun. Ancak, derin doku hasarı (spinal sütun) yaratarak önlemek için çok sıkı bir şekilde basmayın.
8. Paraspinal kas örten kas ayırmak için iki pamuk uçlu aplikatörler ile büküm hareket kullanın. Biri burada kuvvetli olabilir. Bu kanama neden olacağı için, kesilen ya da gözyaşı etmeyin. Aplikatörler ile hareket Büküm güzel, hasar veya kanama neden olmadan ayrı doku tease. Kanama cerrahi herhangi bir aşamasında ortaya çıkarsa, sabırlı olmak en iyisidir. Kan cerrahi alanda vizyonunu belirsiz çünkü çok kanama devam acele kalkmayın. Koterizasyon veya hafif bir basınç kanama sitesine uygulanan, ancak bu sabır en iyi bulmak olabilir. Uygulama ile, bu ameliyat boyunca çok az veya hiç kanama olması gerekir.
9. 4 ev yapımı retraktörler (bkz. Şekil 2) ile kas geri çekin. Bu retraktörlere bir retraktörü (bkz. Şekil 2-inset) şeklinde sağlam Ataç yapılabilir. Ameliyattan önce bu Otoklav. Bakım retraktörlere uçları künt doku hasarı önlemek için alınmalıdır. Retraktörü dize bağlayın. Pozlama kare / dikdörtgen şeklinde olmalıdır. Bu şekil 4 retraktör kullanarak 4 köşe çekerek elde edilebilir. Kuruluna Teyp dize retraktörlere güvence altına almak için (bkz. Şekil 2) için. Piyasada satılan retraktörler da kullanılabilir, ancak bu kullanmamayı tercih edilebilir. Bu ameliyat boyunca açık bir şekilde görmek için iyi bir cerrahi alanı oluşturmak için çok önemlidir. "Körü körüne" boyunca devam etmeyin.
10. Omurganın sırt yüzeyi temizleyin paraspinal kas. Omuriliğe dorsal yüzeyinde paraspinal kas ile başa çıkmak için, 2 potansiyel stratejileri vardır. Vertebraların dorsal yüzeyinden paraspinal kas kaldırmak için ilk strateji, sıçan dişli forseps ve orta ölçekli yaylı makas kullanın. Kemik kemik yüzeyi daha iyi ortaya çıkarmak için çok yakın bir kesim yapmaya çalışın. Vertebra yüzeyine paralel kesimler olun, ama kordon içine kesmeyin. İkinci yaklaşım için, para-spinal kas orta hat kesi yapmak ve küçük retraktör ile yanal geri çekin. İkinci yaklaşımda ise, kas sonra ameliyattan sonra tekrar bir araya sütüre edilebilir.
11. Vertebra kemik yüzey temizlenir. C4, C5 ve C6 seviyeleri (bkz. Şekil 3) kas çekmeye rongeur (en önemli cerrahi alet) kullanın. Bu, elbette, hedeflenen spinal düzeylerde bağlıdır. Öte yandan, sıçan dişli forseps ile C2 süreci üzerinde kas tutarak rongeur tek elle kullanırken, tüm spinal kolon güvenli. C2 cerrahi alanında büyük rostral bir süreçtir. C3 yanı sıra kas biraz altında. C4, C5 ve C6 onları örten küçük kas çünkü erişimi kolay.
12. C5 laminektomi ile başlayın. Yine, sıçan dişli forseps ile C2 tutarak güvenli. Rongeur: tüm lamina (orta hatta yakın kapmak şemaya bakınız) tut. Pozisyonu rongeur böylece aracı spinal kolon ekseni tamamen dik. Yavaş yavaş lamina ezmek. Bu omurilik dokusuna zarar görmesine neden olarak omuriliğe aşağı itmek değil. Ezilme ve kırık parça kemik yukarı doğru yavaşça çekin. Biri kolayca kaldırmak çekmeye böylece Rongeur parça ezmek gerekir. Kemik parçası hala lamina geri kalanı bağlıysa bu omurilik kanama ve olası yaralanmalara sebep olacaktır, römorkörler yok. Rongeur temiz ve keskin olmalıdır. Rongeur gibi belgeleri yıkanmış / (bkz. Şekil 4) steril bir kapta verilebilir steril serum fizyolojik ile silinmelidir.
    Rongeur dik konumlandırma laminektomi ilk açılış içinomuriliğe dicular tercih edilir. Bu adım, daha sonra laminektomi rongeur kordon yüzeyine göre yaklaşık 30-60 derecelik bir açı ile kemik altında yavaşça ekleyerek genişletmek için küçük "nibbles" alarak takip edilebilir.
13. C4-C6 lamina laminektomi uzatın. Bir kemik üç spinal seviyeleri üzerinde sürekli bir açılış yapın. Laminektomi ölçüde intraspinal enjeksiyon istenen yer (ler) göre ayarlanabilir.
14. Bu kanama neden olacaktır, çünkü çok uzak yanal laminektomi uzatmak etmeyin. Ventral boynuz hedef için, enjeksiyon yerinde nispeten medial, bu yüzden çok yanal laminektomi uzatmak için gereksizdir. (Bkz. Şekil 5)
15. ~ 15 x büyütme oranını artırın.
16. Bağ dokusu (ve mümkünse kurutulmuş kan) dura üstünde keskin düz / # 5 forseps ile temizleyin. Bağ dokusu ve dura arasındaki fark deneyimi ile öğrenmiş olması gerekir.
17. İnsizyon dura, mini-yay makas veya microknife ya çok sert bir meningeal tabaka. Sadece medial dorsal rootlets giriş bölgeye spinal kolon eksenine paralel bir kesi yapmak. Bu bir ventral boynuz hedef sağlayacaktır. (Bkz. Şekil 6)
18. # 5 forseps keskin düz / kapmak için kullanın ve biraz omurilik, dura kaldırın. Çimdik / omurilik zarar vermeyin. Bu biraz pratik alır. Microknife ya da çok küçük yaylı makas ile kesiler olun. Omurilik zarar vermeyin.
19. Kesi rostral-kaudal eksen biraz uzatın. Dura gerginlik biraz omurilik güzel bir poz oluşturmak için dura ayrı olacaktır.
20. Amaçlanan her enjeksiyon için uygun tüm siteler kesiler olun. Omurilik yüzeyi beyaz renkli parlak bir görünüme sahiptir Dura, puslu saydam bir görünüme sahiptir. Biri dışında bunları ayırt etmek için öğrenmek gerekir. Bu deneyin, bir iğne ile dura üzerinden enjekte etmek için tavsiye edilir. Dura, onu delmek için zor olacak, böylece zordur. Buna ek olarak, dura delip iğne yerleştirilmesi yörüngesini etkileyebilir ve bu nedenle hücre anatomik hedef teslim etkileyecektir.
21. 3 düzeyleri (toplam 6 sitelerinde) bilateral servikal genişleme geniş bir bölgeyi hedef hücreleri enjekte edilir. Enjeksiyon sayısı ve yer (ler), tabii ki, belirli bir denemenin bağlıdır.
22. Piercing dura sonra, beyin omurilik sıvısı dökeceğim. Kuru yüzey kablosu ve gazlı bez veya pamuk uçlu bir aplikatör ile tüm maruz.
23. Hücre enjeksiyonu için, 10.0μL Hamilton gaz geçirmez RN şırınga kullanın.
24. 33-gauge / 45 derecelik bir metal RN Hamilton iğne eğimli takın. Iğne keskin olmalıdır. Sadece ~ 20 enjeksiyon (iğne daha az enjeksiyonları ile daha keskin olacaktır) için de aynı iğneyi kullanın. Bir de iğnelerin çekti cam kapiller tüplerin kullanabilirsiniz. 26-gauge künt Hamilton metal iğne çekilir cam ucuna takmak için epoksi kullanın. Cerrahi mikroskop ve mikrometre slayt: ~ 75,0-100,0 mcL (hücre çapı bağlı olarak enjeksiyon işlemi sırasında hücreler zarar vermek istemiyor) dış ucu çapı kesin. Biz 33-gauge metal iğneler tercih ediyor.
25. Hücreler buz üzerinde Eppendorf tüp içinde süspansiyon kolayca düşecek. Hemen önce enjeksiyon şırınga yükleme hücreleri süspansiyon içine kadar tüp hafifçe dokunun. Çok yoğun hücre ve / veya neden kabarcıkları zarar olarak fiske etmeyin. Alternatif olarak, hücreleri hafifçe karıştırın 20.0μL pipet adam kullanın: pipet hücre süspansiyonu, sadece bir veya iki kere yukarı ve aşağı.
26. Sadece bir enjeksiyon yerinde için yeterli hücre süspansiyonu hacmi yükleyin. Bir planları, çoklu enjeksiyon yapmak Hücreler enjeksiyon şırınga içinde süspansiyon düşecek. Yavaş yavaş baloncuklarının ve / veya hücrelere zarar vermemek için şırıngaya hücreleri kadar sürebilir. Özellikle laboratuarda çalışma glial progenitör hücreler için, 2-5 dakika içinde 1.0 mcL başına 50,000-75,000 hücrelerinin bir seyreltme 2.0 mcL hücre süspansiyonu enjekte. Biz 2uL/site servikal omurilikte doku hasarına neden olmadığını bulduk. Bunun yerine, omurilik parankimi zarar görmesine neden olabilir: tecrübemizi büyük (çapı 10.0 -20.0 mikron glial atalarıdır daha büyük boyutta özellikle) hücre sayıları artan bu hacim düşündürmektedir. Biz her yerinde enjekte etmek (en azından sağlam servikal spinal kord) hücrelerinin uygun numaralarını belirlemek için geniş bir hücre dozaj deney gerçekleştirdi. Parametreler belirli bir hücre tipi ve hastalık durumu tespit edilmelidir.
27. Line şırınga / iğne istenen anatomik bölgeye doğru hedef omurganın ekseni ile paralel kadar. Iğne, cerrahi kapsamı kafa tutabilirim (cerrahi tabloya göre yaklaşık 80 derece) yeterli açılı, ama mümkün olduğunca 90 derece olarak yakındır. Alt mikroskop kullanılarak spinal kord dorsal yüzeyine doğru ucu (bkz. Şekil 7).
28. Amaç iğne girişi zo sadece medialdorsal rootlets ne (bkz. Şekil 8). Iğne ucu ile omurilik yüzeyine hafifçe dokunun. Hafif iğne ile omurilik bastırın. Iğne omurilik geri normale kadar geri çekin. Kayıt olarak bu pozisyonda z = 0.0 mikromanipülatör cetvel kullanarak.
    Not: Biz rutin servikal spinal kord enjeksiyonlar sırasında vertebral kolon stabilize yok. Bizim anestezi rejimi kullanarak, ağır nefes alma nedeniyle servikal spinal kord yukarı ve aşağı hareket bir sorun olmamıştı. Ancak, ağır nefes alma, bir sorun olup olmadığını, spinal kolon, vertebra ezmek veya zarar için dikkatli olmak, kemik yavaşça sıkma ve düzeyleri C2 ve C7 modifiye forseps kullanarak para-omurilik kas çevreleyen tarafından özelleştirilmiş bir çerçeve kullanılarak stabilize olabilir omurilik dokusu altında yatan. Işlem sırasında hayvanın nefes sığ hale gelirse, daha fazla anestezik ilaç verilmelidir. Ameliyat başlamadan önce anestezi cerrahi bir düzlemde yeniden sağlanmıştır kadar kesilmelidir.
29. Biraz daha düşük omuriliğe iğne. Bunu yaparken mikroskop bakmak emin olun. Alt-yetişkin sıçan ventral boynuz hedef 1,5 mm derinliğe kadar iğne. Alt-yetişkin farelerde ventral boynuz hedef 0,75 mm derinliğe kadar iğne. (Bkz. Şekil 9). Bu derinlik numaraları (en az 3 aylık) kadın ve erkek Sprague-Dawley sıçanlar (250-450 gram) ve C57BL / 6 farelerinde (20-35 gram) yetişkin temsilcisi. Tabii ki, derinlik ve lateral pozisyonda ilgi belirli bir bölgeye bağlıdır. Omurilik omurilik dokusuna zarar vermemek için iğne takılı iken enjeksiyon sistemi / cerrahi kurulu veya cerrahi tablo Rahatsız etmeyin.
30. Enjeksiyondan önce istenilen derinliğe kadar iğne düşürdükten sonra iki dakika bekleyin (daha uzun süre daha iyi).
31. 2.0 mcL pompa kontrolörü kullanarak sabit hızda 2-5 dakika içinde enjekte edilir.
32. Enjeksiyondan sonra yavaş yavaş omurilik iğne çıkarmadan önce iki dakika bekleyin (daha uzun süre daha iyi).
33. Her enjeksiyondan sonra dH2O ile temiz şırınga tıkanmasını önlemek için. Yavaş yavaş yukarı çekmek ve 3-5 kez sınırdışı. Enjektör içine hava çekemez.
34. En düşük büyütme (: ~ 8 x aynı cerrahi başında) geri dönün. Sütür dura 9-0 sütür kullanarak kapalı, ama bu kesinlikle gerekli değil. Aynı zamanda zordur. Biz geçmişte dura kapalı sütüre, ama biz, hayvan davranışları, nakli dura sütür ile kapalı değil hayatta kalma ya da omurilik histoloji hiçbir farkı bulmak. Dura koruyucu bir parça steril jel köpük ile kaplı olabilir. Jel köpük dural insizyon yerinde üstüne doğrudan konulmalıdır. Ancak, yüzey-perfüzyon sonrası diseksiyon sırasında omurilik gelfoam bazen omurilik yüzeyine sıkıca yapışır gibi aniden gelfoam bu parça çekerek değil, dikkat çekmek için önemlidir.
35. İsteğe Bağlı: Dikiş paraspinal kas 4-0 sütür ile kapatıldı.
36. Sütür 4-0 sütür ile tek seferde üç örten kas tabakaları kapattı. Rostral-kaudal ekseninde üç yerde Sütür kasları (bkz. Şekil 10).
37. Zımba cilt 9.0 mm yara klipleri (bkz. Şekil 11) ile kapattı. Tam yara iyileşmesi önce zımba çekerek hayvan önlemek için iğne sahipleri ile zımba sıkın. Dışında Uzay zımba yaklaşık 0.5 cm. Bu bozulmuş iyileşme ve nekroza yol açabilir, yara klipleri üzerine sıkın.
38. Batırılmış gazlı bez ile yara alan için povidin-İyot antiseptik solüsyon uygulayın.
39. Sıcak su yastığı dolaşan hayvan kurtarmak için izin ver. Hemen cerrahi sonrası; steril Ringer solüsyonu (0.5 mL fare sıçan için 5,0 ml) cilt altı enjeksiyonu verin. Hayvan susuz ve / veya dikkatsiz görünür takip enjeksiyonları da temin edilebilir. Sefazolin, 6.0mg/kg kullanarak profilaktik antibiyotik tedavisi kullanılabilir, ancak, deneyim, aseptik teknik takip ve tüm aletleri / cerrahi malzemelerin sterilize edilir, bu nakli prosedürü ameliyat sonrası enfeksiyonların olmadığını göstermektedir. Bu önlemler takip edilirse, antibiyotik tedavisi önerilmez.
40. CSA veya FK-506/Rapamycin günlük kurban kadar devam edin.
41. Tüm cerrahi ~ 45 dakika (6 enjeksiyonu siteleri ile) daha az almalıdır. Aksi takdirde, hayvan uyanmak başlayacak ve daha ağır nefes olumsuz omurilik içine enjeksiyon etkileyecektir.

Associated Protokol Çeşitli Adımlar ile Sorunları Giderme İpuçları

/ Kötü hücre sağkalım eksikliği: Bu büyük olasılıkla enjeksiyonu ile ilgili teknik bir sorun değil, ama muhtemelen, hücre tipi ve / veya immunesuppression rejimi enjekte özellikleri nedeniyle . Bu konular ampirik bir hücre tipi ve hayvan modelinde özel bazda değerlendirilmesi gerekir. Bağışıklık eksikliği olan sıçan ve fare modelleri bir dizi durumuimmunesuppression ile ilgili sorunları aşmak için de mevcuttur, ancak bu hayvanların aynı zamanda maliyet, bir koloni korumak için ihtiyaç ve cerrahi ve iskan sırasında gerekli ek dikkatli zorluklar mevcut.

Fonksiyonel açıkları cerrahi sonrası gözlenen: tecrübemizi, hatta 6 enjeksiyonları siteleri (, ön ayakları ve hindlimb kavrama kuvveti ve frenik sinir / diyafram bileşikler kas aksiyon potansiyelleri gibi önlemler değerlendirildiğinde, bu yordamı herhangi bir fonksiyonel açıklarının oluşumu gözlenen değil 2μL servikal spinal kord). Doku yıkımı da görülmemiştir. Bu sorunların ortaya çıkması olası nedenleri şunlardır: (# 5 kablosu kısma gibi dura kesim sırasında geniş hacimli ve / veya cep numaraları, yanlış laminektomi kaynaklanan istenmeyen zararları, incelik eksikliği enjekte, önerilen iğne kullanarak değil forseps) veya spinal kord (sıkıcı bir iğne değiştirin) Hamilton iğne ekleme işlemi sırasında.

Hücreler ventral gri madde bulundu: Bu konularda bir dizi nedeni olabilir. Enjeksiyon mediale veya laterale hedef kaçırırsa, enjeksiyon sistemi omurilik ekseni ile paralel düzgün sıraya ve dorsal rootlets giriş için sadece medial iğne eklemek için emin olun. Enjeksiyon dorsal veya ventral hedef kaçırırsa, iğne ucu omurilik dorsal yüzeyine dokunmadan sadece zar zor olduğunda, önerilen Hamilton iğne kullanmak uygun konik (daha uzun bir eğim ile z ekseninde okuma sıfır emin olun ) etkileyebilir, iğne takarken omuriliğe baskı olmadığını temin mikromanipülatör tam olarak kullanarak derinlik ölçüm özen ve önerilen kilo aralığı içinde hayvan kullanmak. Eğer sürekli bir yerde (histolojik değerlendirme ve daha sonraki bir teknik değişiklik gerektiren) hücreler enjekte buna göre eğer tekniği ayarlayın. Enjeksiyonlar enjeksiyon sitelerin tüm rastgele dağılmış, tutarlılığını artırmak için uygulama yapmaya ihtiyaç var. Eğer hücreler çoğunlukla iğne izi boyunca omurilik dorsal yer olma eğilimindedirler, hücre enjeksiyonu öncesi ve sonrasında daha uzun süre beklemek ve daha uzun bir süre boyunca gerçek enjeksiyon uzatmak.

4. Temsilcisi Sonuçlar:

Fare-türetilen glial progenitör hücrelerin omurilik düzeyinde C4 yetişkin bir SOD1 ^G93A sıçan ventral boynuz (50.000 hücre / site) transplante edildi. Fare-kaynaklı nakledilen hücrelerin fare spesifik antikor, M2, algılama ile ev sahibi sıçan doku ayırt edilebilir. Bu görüntü, transplantasyon sonrası 1 ay ^M2 + nakli kökenli hücrelerin (bkz. Şekil 12) hayatta gösterir . Hücreler ventral gri cevherde lokalize, ancak enjeksiyon yerinde medial lateral ventral boynuz (en frenik motor nöronların yerini: noktalı çizgi ile gösterilen) kaçırdı. Kist oluşumu yok site başına 50.000 hücreleri enjekte edildiğinde, enjeksiyon prosedürü kaynaklanan herhangi bir davranış bozukluğu. Ancak, hücrelerin daha yüksek sayılar (gerçek sayı, hücre tipine göre değişir ve sistematik olarak değerlendirilmesi gerekir), enjeksiyon yerinde hasara ve iğne izi boyunca (bkz. Şekil 13: astrosit marker immünhistokimya, GFAP ) enjeksiyon .

Şekil 1. İlk cilt insizyonu düşük mikroskop büyütme (8 x büyütme), orta hat kesi yapmak için neşter bıçağı kullanın. Öte yandan cildi gergin yapmak için (cilt kesmek için daha kolay kılan) ile yanal cildi gerin ve kürek (ifade kafatası tabanı (kulakların arkasında düzeyinde) kesi (kalın noktalı çizgi ile gösterilen) ince noktalı çizgi).

Şekil 2. Cerrahi alan Pozlama. Cerrahi maruz kare / dikdörtgen şeklinde olmalıdır. Bu şekil 4 retraktör kullanarak 4 köşesine doğru çevresindeki kas çekerek elde edilebilir. Retraktörlere güvenli ve düzgün alanında açık tutmak için cerrahi kuruluna retraktörlere bağlı Teyp dize.

Şekil 2-inset. Cerrahi alanında maruz kalma Retraktörler retraktörlere, omurilik ve ameliyat için yeterli alan açık görüş hem cerrahi alan yaratmak amacıyla kas geri çekmek için kullanılır . Retraktörler istenilen şekil ve boyut sağlam Ataç şekillendirme yapılabilir. Ameliyat için önce retraktörlere Otoklav. Retraktörü dize bağlayın.

Rakam3. Paraspinal kas vertebra. Sonrasında kaldırılması, vertebra rongeur ile iyice temizleyin dorsal yüzey. Bireysel lamina yanı sıra, omurganın lateral giren dorsal rootlets olarak görülebilir.

Şekil 4. Laminektomi. Omurilik düzeyinde C5 laminektomi başlayın. Rat dişli forseps ile kas örten seviye C2 tutarak Güvenli spinal sütun. Rongeur: tüm lamina (orta hatta yakın kapmak şemaya bakınız) tut. Pozisyonu rongeur böylece aracı spinal kolon ekseni tamamen dik. Yavaş yavaş lamina ezmek. Bu omurilik dokusuna zarar görmesine neden olarak omuriliğe aşağı itmek değil. Ezilme ve kırık parça kemik yukarı doğru yavaşça çekin. Biri kolayca kaldırmak çekmeye böylece Rongeur parça ezmek gerekir. Kemik parçası hala lamina geri kalanına bağlı ise bu omurilik kanama ve olası yaralanmalara sebep olacaktır, römorkörler yok. Rongeur temiz ve keskin olmalıdır.

Şekil 5. Omurilik dokusunda aşağıdaki laminektomi maruz kalması. C4-C6 omurilik maruz laminektomi uzatın. 1, 3, spinal seviyeleri üzerinde kemik sürekli bir açılış yapın. Bu kanama neden olacaktır, çünkü çok uzak yanal laminektomi uzatmak etmeyin. Ventral boynuz hedef için, enjeksiyon yerinde nispeten medial bu yüzden tam lateral vertebral kemik ölçüde laminektomi uzatmak gereksiz.

Şekil 6. Yüksek büyütme omurilik dorsal yüzeyi belirgin bir dorsal kan damarı spinal kord orta hatta aşağı çalışan görülebilir. Bu kan damarı desen çoğu durumda görülmektedir; Ancak, bazı hayvanların kan damarı olmayan bir orta hat yörünge gösterilecek. Dorsal rootlets omurilik dorsal lateral yönleri görülebilir. Bu sinirler, omurilik üzerinde dura Göre dumanlı bir görünüme sahip.

Şekil 7. Enjeksiyon kurulum. Line şırınga / iğne istenen anatomik bölgeye doğru hedef omurganın ekseni ile paralel kadar. Iğne, cerrahi kapsamı kafa tutabilirim (cerrahi tabloya göre yaklaşık 80 derece) yeterli açılı, ancak omurilik dorsal yüzeyine doğru mümkün (sol panel) gibi yaklaşık 90 derece daha düşük enjeksiyon ucu kullanarak mikroskobu (sağ panel). Iğne ucu ile omurilik yüzeyine hafifçe dokunun. Hafif iğne ile kablosunu bastırın. Iğne omurilik normal durumuna geri kadar geri çekin. Z = 0.0 mikromanipülatör cetvel kullanarak bu pozisyonda kaydedin.

Şekil 8. Dorsal rootlets (noktalı çizgi ile gösterilen) giriş bölgeye sadece medial omurilik enjeksiyon Amaç iğne Yüksek büyütme.

Şekil 9. Omurilik Diyagram: nasıl ilgi anatomik bölgeyi hedef ventral boynuz, dorsal rootlets giriş bölgeye sadece medial insizyon dura spinal kolon eksenine paralel hedef çalışıyor. Bu bir ventral boynuz hedef sağlayacaktır. Alt-yetişkin sıçan ventral boynuz hedef (hayvanın yaş ve cinsiyet çok derinliği fark yapmaz) 1,5 mm derinliğe kadar iğne. Alt-yetişkin farelerde ventral boynuz hedef 0,75 mm derinliğe kadar iğne. Tabii ki, derinlik ve lateral pozisyonda ilgi belirli bir bölgeye bağlıdır.

Şekil 10. Cerrahi sitenin kapatılması. Sütür 4-0 sütür ile tek seferde üç örten kas tabakaları kapalı. 3 noktada rostral-kaudal ekseninde kasları dikin.

Şekil 11. Zımba cilt cilt Zımbalama. 9.0 mm yara klipleri ile kapattı. Tam yara iyileşmesi önce zımba çekerek hayvan önlemek için iğne sahipleri ile zımba sıkın. Ayrı Uzay zımba yaklaşık 0,5 mm.

Şekil 12. Servikal ventral boynuz glial atalarıdır Transplantasyon 50.000 fare türevi glial progenitör hücrelerin omurilik düzeyinde C4 SOD1 ^G93A sıçan ventral boynuz naklediliyor. M2 + fare kaynaklı nakledilen hücrelerin nakli sonrası 1 ay atlattı. Hücreler ventral gri cevherde lokalize, ancak enjeksiyon yerinde medial lateral ventral boynuz (ifade cevapsıznoktalı çizgi).

Şekil 13. Yüksek sayıda nöral prekürsör hücrelerin doku hasarı aşağıdaki nakli hücrelerin daha yüksek sayılar (gerçek sayı, hücre tipine göre değişir ve sistematik olarak değerlendirilmesi gerekir), enjeksiyon yerinde hasar ve iğne izi boyunca enjeksiyon.

Tartışmalar

SOD1 ^G93A fareler ve sıçanlar, yaş ve bir grup içinde hayvanların seks maç ve farklı gruplar için aynı çöp içinde hayvan dağıtmak. Içeren çalışmalar için Bu hastalık süreçleri kadın ve erkekler arasında farklılık gösterebilir, çünkü ALS ve SKY modellerin her ikisi için de aynı cinsiyetten tüm hayvanları kullanmak için tercih edilir, ancak, aynı zamanda her iki cinsiyetten yeterli hayvanlar olmak mümkün cinsiyete özgü etkilerini tespit etmek için yararlı olabilir gibi ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası
HBSS	Gibco	14170
0.05% tripsin	Gibco	25300
Soya tripsin inhibitörü (isteğe bağlı)	Sigma	T-6522
Acepromazine maleat (0.7 mg / kg)	Fermantasyon Hayvan Sağlığı
Ketamin (95 mg / kg)	Fort Dodge Hayvan Sağlığı
Xylazine (10 mg / kg)	Bayer
# 11 Feather cerrahi bıçak	Elektron Mikroskopi Bilimler	72044-11
Pamuk uçlu aplikatörler (6 inç)	Balıkçı	23-400-101
Rat-dişli forseps	Güzel Bilim Araçları	Sıçan: 11.023-15; Fare: 11.042-08
Orta ölçekli yaylı makas	Güzel Bilim Araçları	15012-12
Mini yaylı makas	Güzel Bilim Araçları	15000-10
Rongeur	Güzel Bilim Araçları	Sıçan: 16.121-14; Fare: 16.221-14
Microknife	Güzel Bilim Araçları	10056-12
Iğnelikler	Güzel Bilim Araçları	12502-14
Sütür: 4-0	Vicryl	S-183
Staples: 9 mm	AutoCLIP	427631
Zımba: 9 mm (Refleks # 203-1000)	Dünya Hassas Aletler	5000344
Sıcak su pompası (T / Pompa)	Gaymar	P / N 07999-000
Siklosporin A: 250.0 mg/5.0 ml ampul	Novartis / Sandimmune	NDC 0078-0109-01
FK-506	LC Laboratuvarları	F-4900
Rapamisin	LC Laboratuvarları	R-5000
Enjektör	Dünya Hassas Aletler	UMP2
Micro 4 mikroenjektör Pompa Kontrolörü	Dünya Hassas Aletler	UMC4
Mikromanipülatör	Dünya Hassas Aletler	Kite-R
10.0 mcL Hamilton şırınga	Hamilton	80030
Hamilton: 33-gauge iğne, 45 ° eğim, 1 inç	Hamilton	7803-05
Cam 20.0 mcL microcapillary pipetler (isteğe bağlı)	Kimble	71900-20