Organotipik Kollajen Ben Assay: 3-Boyutlu Bağlamında Hücre Davranışı değerlendirin A Dövülebilir Platformu

Özet

Bir yöntem olup kollajen tip I ve primer insan fibroblast oluşan bir 3-boyutlu matrisi hazırlanması için tarif edilmektedir. Bu doku stroma temel özelliklerini taklit eder ve mikroskopi birçok formları için müsait olduğundan bu organotipik jel invaziv hücre göçü değerlendirmek için yararlı bir substrat olarak hizmet vermektedir.

Özet

Hücre göçü gelişimi, yara iyileşmesi, bağışıklık sisteminin hücresel yanıtları, ve tümör hücrelerinin metastaz gibi biyolojinin birçok yönleri için esastır. Göç ışık mikroskobu ile incelenmesi için mükellef hücresel dinamikleri yapmak için cam lameller üzerine çalışılmıştır. Ancak, hücre göçü birçok açıdan sadakatle cam ve plastik ¹ gibi sert iki boyutlu yüzeyler tarafından temsil edilmeyen, elastikiyet, protein kompozisyonu ve gözenek boyutu dahil yerel çevrenin özelliklerine bağlı olduğu açık hale gelmiştir. Ayrıca, stromal fibroblastlann ² ve ³ bağışıklık hücreleri dahil olmak üzere diğer hücre tipleri ile etkileşimi kanser hücreleri istila teşvik edilmesinde önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. Moleküler düzeyde incelenmesi giderek karşılaştırıldığında aynı hücrelerin ilaç tedavisine yanıt dahil moleküler dinamik, önemli ölçüde farklı olduğunu göstermiştir in vivo ^4.

İdeal olarak, bu canlılar kendi doğal bağlamında hücre göçü incelemek için iyi olurdu, ancak bu her zaman mümkün değildir. Böyle hücre elde matrisi, Matrigel, organotipik kültürü (burada açıklanan) doku eksplant, organoids ve xenografts gibi Orta doku kültürü sistemleri, bu nedenle önemli deneysel ara vardır. Bu sistemler yaklaşık bazı in vivo ortamda yönlerini ancak böyle stably transfekte hücre hatları, ilaç tedavisi rejimleri, uzun vadeli ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme kullanımı gibi deneysel manipülasyon için daha uygundurlar. Böyle ara sistemleri probları doğrulamak ve görüntü öncesinde vivo ⁵ görüntüleme üstlenen hücreleri ve floresan gazetecilere dinamik tepki için gerekli parametreleri kurmak Vaitoudden olarak özellikle yararlıdır. Bu nedenle, onlar livin üzerinde deney ihtiyacını azaltmada önemli bir rol hizmet edebilirg hayvanlar.

Protokol

1. Cilt eksplantlarından fibroblast kültürlerinin oluşturulması

1. 100 ünite / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin, ve 0.25 ug / ml Fungizone takviye insan önkol elde edilen 4 mm punch biyopsi MEM yerleştirilir.
2. Herhangi bir deri altı yağ Trim ve ince petri dibine bir dizi 24 Bistüri sallanan tarafından küçük parçalar halinde biyopsi doğrayın.
3. Şişenin yüzeyi kadar birincil fibroblast büyüme ortamı (MEM% 10 FCS, 100 ünite / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin, ve 25 ug / ml Fungizone ile desteklenmiş) ile 25 ^cm2 doku kültürü şişesi içinde yer doku bulamaç eklendi kapalı ama sıvı derinliği doku float için yetersizdir.
4. % 5 _CO2 nemlendirilmiş bir atmosfer içinde 37 3 gün inkübasyondan ° C ardından, birincil fibroblast büyüme ortamı olarak 3 ml eklenir.
5. Taze primer fibroblast büyüme ortamı ile başka bir 3 gün inkübasyon değişimi medya takiben veya cel eğerls onlar taze ortama 01:04 bölünebileceği neredeyse konfluent vardır. (Fungizone Bu noktadan itibaren ihmal edilebilir).

2. Evre I - sıçan kuyrukları gelen kollajen I hazırlanması

Not: Yaklaşık 12-14 ergen (taze veya dondurulmuş) sıçan kuyrukları için protokol

1. % 70 etanol içinde yıkanarak sıçan kuyruğu hazırlayın ve aşağıdaki gibi tendonlar kaldırın:
2. Ile yukarıdan aşağıya doğru kuyruk ortasında dilimleme sıçan kuyruk deri çıkarın bir neşter ve kuyruk uzunluğu boyunca pealing.
3. Kuyruk proksimal bölgenin çekirdek tendonu ayırın.
4. Dişli forseps kullanarak kılıfı kaçınarak kuyruk distal bölgeye yönelik tendonu çıkarın.
5. 48 saat için 4 ° C sıcaklıkta karıştırıldı, tendonun 1 g / L 0.5 M asetik asit, 250 ml çıkarın.
6. 30 dakika ekstraktı (7,500 xg) santrifüjleyin ve pelet atın.
7. Süpernatant% 10 eşit bir hacim (ağırlık / hacim) NaCl ekleyin ve 30-60 dakika için karıştırın.
8. Santrifüj (10,000 xg), süpernatanın atmak ve 4 C'de 24 saat karıştırıldı ~ 1:1 oranında, 0.25 M asetik asit içinde yeniden çözülür çökelti ° C.
9. 6L 6-8 değişikliklere karşı kolajen çözeltisi ~ 17.5 mM asetik asit (soğuk su litre başına 1 ml glasiyel asetik asit, değişim 2 x günlük) Dialyze.
10. 1.5 saat için 30.000 xg'de diyaliz kollajen santrifüjleyin.
11. Steril şişeye süpernatant ve yer çıkarın.
12. ~ 2 mg / ml arasında bir konsantrasyonda 4, 0.5 mM asetik asit kullanılarak ° C'ye ayarlayın kolajen

3. Evre II - gömülü fibroblastlar (8 gün için sözleşme için izin) ile 3D matris kurma.

1. Önceden soğutulmuş bir şişe 4'te Soğuk reaktifler kullanarak ° C karışımı birleştirin. Buz üzerinde kollajen I tutun.
2. Konfluent birincil fibroblastlar biri T75 şişesi için (~ hücre sayısı 1 x 10 ⁶⁾ kullanımı:
   • 25 ml fare kuyruk kolajeni (yaklaşık kons 2mg/ml)
   • 10x 3 miMEM
   • 0.22 M NaOH: Birincisi, 2ml, kollajen turuncu yanana kadar düşmesi-bilge iken, karıştırarak ekleyin
   • fakat pembe (genellikle en fazla 3 ml) eklenmiştir. Yaklaşık p ^H = 7.2.
   • Not: Hatta hafif alkali koşullara maruz kalırsa fibroblastlar jel sözleşme olmayacak gibi orta / jel nötral veya hafif asidik kalmasını sağlamak için önemlidir.
3. , Fibroblastlar Trypsinise 5 dakika boyunca 400 xg'de spin ve süpernatant kaldırmak.
4. 5 dakika boyunca üzerinde sıkma: 12 x 35 mm plastik tabaklar hazırlayın - normal fibroblastlar / kollajen karışımı bir şişeye 12 yemekleri ulaşmak.
5. 3 ml FCS fibroblastların yeniden askıya ve hemen kollajen karışıma ekleyin ve karıştırın.
6. Levha yaklaşık 2,5 ml tabak başına kollajen / fibroblast mümkün olduğunca çabuk. Kabarcıklar ve kollajen ayarını önlemek için deneyin.
7. Kollajen 10 dakika için hava içinde% 5 _CO2 nemlendirilmiş bir atmosfer içinde 37 ° C 'de geçsin.
8. Fibroblast 1ml büyümeye ekleTh ortamı (DMEM +% 10 FCS).
9. Bir pipet kullanarak yemeğin taraftan kollajen / fibroblast matriks ayırın.
10. Ertesi gün: fibroblast büyüme ortamı (DMEM +% 10 FCS) 1ml ekleyin.
11. Her gün medya değiştirin. Onlar 24-iyi çanak uyum kadar, yaklaşık 8 gün boyunca sözleşme kollajen / fibroblast matriks İzin (çapı 1.5 cm ~ 3.5 cm Daralma, Şekil 1'e bakınız).

Not: kolajen konsantrasyon uygulamasına uyacak şekilde ayarlanması gerekmektedir. Daha fazla kollajen çözüm sulandırmak, daha hızlı fibroblastlar yaptırılacaktır. Daralma oranı küçük farklılıklar, aynı konsantrasyonda kollajen farklı seri ile yaşanacaktır. Benzer şekilde, farklı fibroblast kültürleri farklı oranlarda kollajen jeller daralacağını, daha fibroblastlar sunmak, daha hızlı daralma oranı. Kollajen konsantrasyon ve fibroblast yoğunluğu dolayısıyla tarafından, daralma oranı değiştirmek için ayarlanabilir olabilirkollajen jel ve nihai yoğunluk.

4. Evre II - matris üstüne faiz Kaplama hücreleri

Not: Kullanmadan önce etanol ile tüm forseps ve ekipmanları sterilize edin.

1. Künt forseps kullanarak, hafifçe 24-iyi çanak sözleşmeli matris taşıyın. Bunu kat değil emin olun.
2. Matris üstüne yaklaşık 4 x 10 ⁴ / ml ve plaka 1ml (tripsin kurtulmak trypsinising, spin hücreler sonra) ilgi hücrelerinin süspansiyonu hazırlayın. Ihtiyaç duyulan hücre tam sayısı kullanılan hücre tipine bağlı olarak değişebilir. Hücre ortamı ilgi hücrelerin normal büyüme ortamı olmalıdır.
3. Hücrelerin matrisin üst, yaklaşık 3-5 gün izdiham büyümeye izin verin.

5. Evre III - işgali için bir ızgara (yaklaşık 0-21 gün) matris aktarılması

1. Bir tripod oluşturmak ve (Bakınız Şekil 2) kullanmadan önce otoklav paslanmaz çelik ızgaralar kesin.
2. Steril ızgara yerleştirin6 cm çanak, ızgara üzerinde bir seviyede (yaklaşık 10.5ml) büyüme ortamı ekleyin. Yer ızgara üzerinde matris ve matris alt ortam maddesi ile temas halinde olduğu, ancak daldırılmayan kadar yavaşça ortam aspire. Bu istila teşvik eden bir eğim oluşturur hava / sıvı arayüz olarak adlandırılır. Her orta iki gün (Bakınız Şekil 2) değiştirin.
3. Canlı hücre floresan hücreleri kullanarak içeriksel görüntüleme bu aşamada veya daha erken de görüntülenebilir. Sözleşmeli veya fibriler kollajen ben ikinci harmonik üretimi (SHG, Şekil 3'e bakınız) kullanılarak görüntülenebilir. Biz sitoplazmik GFP ifade hücreleri en az 200 mikron derin imaged olabilir oysa SHG, matriks içine en az 100 mikron yansıması bulabilirsiniz geniş alan algılama ile birlikte çoklu foton uyarma kullanma.

Not: istilası ölçümü ile ilgili olarak, Matris ızgara üzerine edildiği gün 0. Gün tanımlar. Izgaraların üzerine Yerleştirme işgali int teşvik hücre kültürü ortamı bir degrade üretir matris o. Örnekleri sonraki 1 üzerinde yansıması olabilir - 21 gün (veya daha uzun) gibi invazyon, çoğalma, hayatta kalma ya da farklılaşma (referans listesine bakınız) gibi biyolojik süreçleri değerlendirmek için.

6. Evre IV - Fiksasyon

1. Falcon bir tüp içinde% 4 PFA 5 ml ilave edilir.
2. Bir düz yüzey üzerine matris aktarın. Taze temiz neşter (Eğer kesit boyama olacak gibi) ile yarıda matris Kes, gece boyunca düzeltmek, neşter ve% 4 PFA transferi ile matris kaldırın.
3. Organotipik matrisler artık antikor ile leke / (Bakınız Şekil 3) seçim leke hazırız.

7. Temsilcisi sonuçları:

Şekil fibroblast ve petri kopuk ve 6-8 gün içinde sözleşme izin sıçan kuyruk kollajen fibroblast sözleşmeli kollajen I. Karışım 1 Örnek.

Şekil 2 "src =" / files/ftp_upload/3089/3089fig2.jpg "/>
2 Organotipik tahlil ilerlemesi Şekil. Organotipik kurulum ve progresyon A, şematik. B, paslanmaz çelik, hava / sıvı arayüzü oluşturmak için steril ızgara üstüne kollajen / fibroblast matris örneği.

Organotipik assay 3 Uygulamalar Şekil. A, B non-invaziv ve invaziv pankreatik duktal adenokarsinom (PDAC) hücreleri organotipik matris ile zamanla istila eder. C, fibroblast sözleşmeli kollajenöz dermal bileşeni katmanlı epidermis gösteren derisi eşdeğeri yaşıyor. D, C8161 melanom hücrelerinin işgalci bir fibroblast için kollajenöz Dermal eşdeğer. E organotipik matriks içinde etkileşim ve fibroblast (kırmızı) ile işgalci invaziv PDAC hücreler (yeşil)-daralmıştır. F , ekstrasellüler matriks (mor) çevreleyen aşağılayıcı etkileşim invaziv PDAC hücreler (yeşil) multiphoton tabanlı ikinci harmonik üretimi kullanarak görüntülendi.

Tartışmalar

Burada invaziv hücre göçü ^6-8 çalışmalar için uygun bir 3-boyutlu matrisi üretmek için bir yöntem sunmaktır. Matris birincil insan epidermal fibroblastlar tarafından birkaç gün bir süre içinde sözleşmeli kollajen tip 1 fibrillerinin oluşmaktadır. Kollajen poli-peptit ucunda tepkime özelliklerini koruyan ve tampon koşulları ⁹ nötrleştirme üzerine daha büyük agregalar halinde kollajen fibrillerin çapraz bağlanma teşvik asit ekstraksiyon, değil enzimatik sindirimi ile hazırlanır. Daha yakından in vivo kolajen özelliklerini taklit eder ve jel içinde kültür hücrelerinin invazif özellikleri için önemli sonuçlara sahiptir yeniden oluşturulmuş jel elde edilir. Kollajen çapraz bağlama genç hayvanlarda daha kararsızdır çünkü taze veya dondurulmuş başlangıç ​​malzemesi kullanılıp kullanılmadığını önemli, ama ergen sıçan kuyrukları kullanmak değildir önemlidir. Kollajen Ben genç hayvanlardan elde etmek bu nedenle kolay ve w yeniden oluştururITH yüksek sadakat.

Kolajen matris sabittir ve lekeli istilacı tümör hücreleri ya da stromal fibroblastlann ^2,10 ya karşı yönlendirilmiş antikorlar ile ve istila ^5,6 inhibe ilaçların etkinliğini test etmek için son derece yararlıdır edilebilir.

Bu protokol, birincil insan derisi fibroblast kullanımını göstermektedir, ancak, bu araştırma altında doku tipine bağlı olarak, diğer doku tipi, ikinci birincil fibroblast kullanmak mümkündür. Bu stabil bir şekilde floresan protein konjugatları ile transfekte edilmiş olan hücreler de dahil olmak üzere ölümsüzleştirilmiş, fibroblastlar, kültürleri kullanılarak oluşturulması da mümkündür. Bu şekilde stromal tümör her iki hücre invazyonu ¹¹ sırasında hücre-hücre etkileşimleri görselleştirmek için etiketlenmiş olabilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar (isteğe bağlı)
10x MEM	Gibco	21430	-
NaOH	Sigma	367176-500G	Su içinde 0.22 M stok hazırlayın
FCS	PAA Laboratuvarlar	A15-101	-
35 mm yemekleri	Şahin	353001	Adım 3.4 için
60 mm yemekleri	Şahin	353004	Adım 5.2 için
Bahar forseps künt	Samco	E003/02	Düzgün değil, Dişli
% 16 paraformaldehit	Elektron Mikroskopi Hizmetleri	15710	Kullanımdan önce PBS içinde% 4 ile seyreltilir
Cd-1, boyutu 40 mesh için ekranlar	Sigma	S07707-5EA	Paslanmaz çelik ızgaralar, paket başına 5
Diyaliz boru	Medicell Uluslararası	7607 2295	12 - 14 kD
PBS	Oxoid	BR0014G	-
Asetik asit	Sigma	242853	-
24 de çanak	Şahin	353047	Adım 4.1 için
Fungizone	Vitrogen In	15290018	-