İnsan İsteyerek Pluripotent Kök Hücreler transfekte ve Nucleofecting

Özet

Genetik modifikasyon alanında son gelişmelere rağmen, insan embriyonik kök hücreleri (hESC) aktarılmasının kaprisli bir süreç olmaya devam etmektedir. Bildiğimiz kadarıyla, insan kaynaklı pluripotent kök hücreler (iPSCs) transfekte etmek için sistematik ve etkili bir yöntem bildirilmemiştir. Burada, biz verimli transfekte ve insan iPSCs nucleofect sağlam protokoller açıklanmaktadır.

Özet

Genetik modifikasyon kök hücre biyolojisi okuyan ve insan embriyonik kök hücreleri (hESC) ¹ potansiyel klinik uygulamaları ortaya koyan önemli bir araç olmaya devam etmektedir. Birkaç gen teslimat yöntemleri geliştirmeleri ^2-9 tarif edilmiş olmasına rağmen, transfeksiyon hESC için kaprisli bir süreç olmaya devam etmektedir ve henüz insan kaynaklı pluripotent kök hücreler (iPSCs) rapor edilmemiştir. Bu videoda, bizim laboratuarımızda rutin transfects ve gelişmiş yeşil flüoresan protein (eGFP) muhabiri ile plazmid kullanılarak insan iPSCs nucleofects nasıl gösterilmektedir. İnsan iPSCs uyarlanmış ve besleyici hücre transfeksiyon olasılığını ortadan kaldırmak için ve transfeksiyon sonrasında stabil transgenik IPSC klonların verimli seçimine izin veren besleyici ücretsiz kültürler olarak korunur. Nucleofection, insan iPSCs besleyici hücre Klimalı besleyiciler üzerinde nucleofected ve replated hücrelerin küçük öbekler içine tripsinize ROCK inhibitörü ¹¹ ile ön tedavi edilirhücre kurtarma geliştirmek için orta. Transgen ifade eden insan iPSCs 6 saat sonra elde edilebilir. Antibiyotik seçimi 24 saat stabil transgenik hatları 1 hafta içinde görünür sonra uygulanır. Tüm protokol, sağlam ve bu hücrelerin pluripotency değiştirmeden, insan IPSC hatları için röprodüksiyon özelliğine sahiptir.

Protokol

Tüm protokol GeneJuice (EMD) ve bir AMAXA nuclefector cihazı kullanılarak insan iPSCs arasında nucleofection kullanılarak insan iPSCs transfekte etmek için protokoller takip besleyici içermeyen kültür, insan iPSCs adapte etmek için bir yöntem ile başlar.

Not: Aşağıdaki prosedürler steril bir laminer akış kaputu yapılmaktadır. Tüm ortamlar ve çözümler 37 ° C'de veya başka bir şekilde belirtilmediği sürece, başlamadan önce oda sıcaklığına gelmesi vardır.

1. Besleyici-free sistem insan iPSCs Kurulması

Önceden besleyici hücreler üzerinde muhafaza İnsan iPSCs Geltrex kaplı çanak aktarılır ve önceki besleyici ücretsiz transfeksiyon iki pasajlar için muhafaza, bölünebilir.

1. 4 ° C'de gece boyunca Geltrex çözülme Geltrex kaplama hazırlamak için, soğuk DMEM çözülmüş Geltrex 01:50 sulandırmak. Yavaşça çözümleri karıştırın.

Not: Geltrex, Matrigel gibi bazal membran MATR bir çözünür biçimidirmurin gelen ix saflaştırılmış Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) tümör hücreleri. Alternatif olarak, Matrigel besleyici içermeyen insan IPSC kültürlerinin kurulması için bir hücre dışı matris olarak kullanılabilir.

2. Geltrex çözüm (35 mm de için 1 ml) ile kültür kuyuların tüm yüzeyi kaplayın. 37 Geltrex ile kaplayın kuyuları ° C de 1 saat inkübatör.
3. Geçit insan iPSCs için, başına iyi accutase 1 ml ekleyin ve çoğu hücreleri ayırmak başlayana dek ° C 1 dakika 37 inkübe.

Geçit insan iPSCs için, başına iyi accutase 1 ml ekleyin ve çoğu hücreleri ayırmak başlayana dek ° C 1 dakika 37 inkübe.

4. Hücreleri ve yavaşça girdap plakası 10-15 cam boncuk ekleyin. KnockOut DMEM / F12 2 ml ekleyin ve hafifçe çiğnemek. 10 ml lik santrifüj tüpüne hücre süspansiyonu aktarın.
5. Oda sıcaklığında 3 dakika için 800 rpm'de hücreleri Spin.
6. İnsan IPSC pelet zedelemeden, tüpten süpernatant aspire. Yavaşça tüp fiskehücre pelletini dağıttı.
7. Kaplamalı kuyudan Geltrex çıkarın.
8. Yavaşça STEMPRO uygun bir hacim içinde insan IPSC pelet tekrar süspansiyon. ) Proliferasyon hızına bağlı olarak, besleyiciler kuyuları arasındaki dağıtın. İnsan iPSCs 1:02-1:06 arasında bölünmüş bir oran içinde pasajlanmağa devam edilebilir.
9. Dikkatle yerde% 5 CO ₂ inkübatör, dikkatle girdap plakası kuyuların genelinde hücreler eşit bir şekilde dağılımını sağlamak için içine.
10. Hücreler kadar günlük Yem hücreleri tekrar Bölünecek hazır (hücrelerin% 80 confluency ulaştığınızda).
11. 1:2 bölünmüş oranı yeni Geltrex kaplı sıra üzerine Passage insan iPSCs (adım 1,3-1,9). Küçük koloniler kurdu ve iyi Geltrex kaplı transfeksiyon öncesinde üzerinde eşit dağıtılmalıdır.

2. GeneJuice ile insan iPSCs transfeksiyonu

Hücreler (6 oyuklu plakalar üzerinde yetiştirilen) optimum transfeksiyon verimliliği elde etmek için transfeksiyon gününde konfluent yaklaşık olarak% 40 -50 olmalıdır. It isdeğil ertesi güne kadar hücre orta değiştirmek için gereklidir.

1. Steril bir 1,5 ml Eppendorf tüp 100 ul KO-DMEM/F12 hazırlayın. 27 ul GeneJuice transfeksiyon reaktif ekleyin. İyice karıştırın. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
2. 4 ug plazmid DNA ekleyin. 15 dakika süre ile oda sıcaklığında inkübe tüp. Plazmid tercih optimum transfeksiyon etkinliği için kritik önem taşır. Bu promotör ⁵ (pCAG-eGFP) CAG tarafından tahrik edilen bir geliştirilmiş yeşil flüoresan protein (eGFP) sahip bir plazmid kullanır. Promotörü CAG insan iPSCs içinde transkripsiyonel olarak etkin ve bu nedenle, bu hücrelerde transgen ekspresyonu sürmek için kullanılan güçlü bir kurucudur. Bizim ellerde, plazmid doğrusallaştırma transfeksiyon verimliliği etkileyecek görünmüyordu.
3. Hücreler ve girdap plaka GeneJuice-DNA karışımı ekleyin. Kuyu insan iPSCs ile transfeksiyon karışımı temasını artırmak için 5 dakika için 1200 rpm ('spinoculation') yöntemini de plaka Spin.
4. 37 & adresindeki hücreleri inkübedeg; C gecede.
5. Bir sonraki gün transfeksiyon etkinliği için izler.
6. Kararlı transfeksiyon için, taze STEMPRO ile ertesi gün ortam değişir. 48 saat - 24 saat sonra uygun antibiyotik seçimi ekleyin.

3. Insan iPSCs arasında Nucleofection

Besleyiciler veya Geltrex üzerinde yetiştirilen insan iPSCs nucleofection için de kullanılabilir. Ancak, güçlü fare embriyonik fibroblast (MEF) ya da insan sünnet fibroblast (HFF) yüksek hücre canlılığı ve iyileşme sağlamak için besleyiciler üzerine nucleofected insan iPSCs replating öneririz. En az 2 milyon hücre nucleofection takiben yüksek hücre canlılığı elde etmek için kullanılmalıdır.

1. Gecede besleyici hücreler ile Serum Değiştirme (KOSR) medya, insan IPSC KnockOut bekletilmeleri ile besleyici hücre klimalı ortam (CM) hazırlayın. CM 24 saatte toplayın.

Not: besleyici tabakalar (örneğin, BLK6, CF1 ve MF1 gibi) hazırlanması için kullanılan herhangi bir fare suşu fo kullanılmaya uygundurr CM yapma.

2. Nucleofection gününde, en az 1 saat için 10 uM ROCK inhibitörü olan insan iPSCs ön-tedavi.
3. Steril bir 1,5 ml Eppendorf tüp, insan kök hücre nucleofector çözümü 82 ul hazırlayın. 18 ul takviyesi 1 ekleyin. İyice karıştırın. 5 dakika için 37 ° C sıcaklıkta çözelti inkübe edin.
4. Pre-sıcak besleyici hücre klimalı ortam (CM) ve% 0.25 tripsin / EDTA 37 ° C'ye kadar Kaputun altında, prelabel tek steril 15 ml konik tüp.
5. Dikkatle nucleofected edilmesi için insani IPSC kültür ortamı çıkarın. Yavaşça kuyu başına 2 ml 1X fosfat tamponlu çözelti (PBS) ile yıkayın hücrelerini. PBS aspire. Kuyu başına% 0.25 tripsin 1 ml ekleyin. 3 dakika için 37 ° C 'de hücreler inkübe edin.
6. Yavaşça 1000 ml pipet ile hücreleri çiğnemek. Tüm insan iPSCs tamamen müstakil emin olmak için kuyunun dibinde yıkayın. Etiketli 15 ml konik tüp hücre süspansiyonu aktarın.

Not: tek c içine trypsinizationarşın kesinlikle kaçınılmalıdır. Hücrelerin yaklaşık olarak tripletler oluşan Hücreler tek hücre küçük öbekler halinde uzaklaştırılabilir olması gerekmektedir. Hücrelerin küçük öbekler (hücre üçe) hücrelerin daha sonraki kullanım sırasında tek bir hücre içine ayrılmış olacaktır.

7. Tripsin inaktive 9 ml MEF ortam ekleyin. 3 dakika için 800 rpm'de hücreleri Spin. Dikkatlice süpernatant aspire ve hücre pelet gibi bırakabilirsiniz.
8. Adım 3.3 insan kök hücre nucleofector çözümü önceden ısıtılmış 100 ul hücreleri yeniden süspanse edin.
9. Bir 1 ml pipet kullanarak nucleofector küvetine hücreleri aktarın.
10. Küvet içinde hücre süspansiyonu içine plazmid DNA 4 ug ekleyin. Nazik bir döndürme hücreleri ve DNA karıştırın. Kaputun yüzey üzerinde iki küvet dokunun.
11. Nucleofector tutucu içine küvetini takın. Programları B-016 kullanın. Düğmesine X. basarak Nucleofect hücreleri

< Nucleofection işlem komple olduğunda> gösterilired (genellikle 1-5 saniye sürer). Diğer nucleofection programları kullanımı (A-023, A-033 ve U-023) insan iPSCs dan eGFP-pozitif hücrelerinin% 10'undan daha az bulunmuştur.

12. Sağlanan Pasteur plastik pipet kullanarak küvet gelen nucleofected hücreler al. Steril bir 1,5 ml Eppendorf tüp içine önceden ısıtılmış CM ve ROCK inhibitörü bunları resuspending hücreleri kurtarın. Hücreler kurtarmak izin vermek için 10 dakika için 37 ° C 'de hücreler inkübe edin.
13. 1 ml pipet kullanarak besleyici tabakalar üzerine açılan bilge Transferi hücreler. 37 ° C'da gece boyunca hücreler inkübe edin.
14. Bir sonraki gün transfeksiyon etkinliği için izler. Transgenik insan iPSCs istikrarlı klonları türetmek için stabil CM ve ROCK inhibitörleri ile ertesi gün orta değiştirmek, transgen ifade. 48 saat - 24 saat sonra uygun antibiyotik seçimi ekleyin.

4. Temsilcisi Sonuçlar:

Şekil 1. pCAG-eGFP ile transfekte Riv1 insan iPSCs arasında fotomikrograflarıdır. (A) eGFP-Salgılayan hücrelerin Riv1 Geltrex 12 saat sonrası transfeksiyon üzerinde GeneJuice kullanılarak transfekte. Riv1 insan iPSCs kolonileri kaplama ve B-016 (B) ve A-023 (C) programını kullanarak nucleofection takip besleyiciler üzerinde oluşmuş. (D) her yerde bulunan bir eGFP ifade ile stabil eGFP ifade eden insan IPSC kolonileri GeneJuice türetilmiştir. (E) stably transfekte Riv1 insan iPSCs embriyoid vücudu farklılaşması esnasında bünye eGFP ifade korudu.

Tartışmalar

Basit, sağlam ve son derece tekrarlanabilir teknikleri Bizim protokoller sonucunda belirgin toksik etkisi ve hücre ölümüne olmadan insan iPSCs transgenlerin tanıtmak. İnsan iPSCs hücrelerin daha küçük kümeleri (5-10 hücreleri) içine pasajlandı ve çok sayıda küçük koloniler optimum transfeksiyon etkinliği sağlamak için yüksek yoğunluklu (1:2) de Geltrex üzerinde kaplanacaktır. Farklılaşma ve hücre ölümü daha yatkın insan IPSC hatları için, insan iPSCs yüksek sayıda (en fazla 4 X 10 ⁶ hücre) tek bir nucleofection deney için kullanılmalıdır. Geçici transfeksiyon deneyinde 1 gün içinde transgen ifade eden insan iPSCs çok sayıda üretir. Stably transfekte IPSC klonlar genellikle 7 gün içinde ortaya çıkar ve bu transgenik koloniler üç hafta içinde iade için hazır olmalıdır. CAG organizatörü kullanımı eGFP muhabirin her yerde ifade edilmesini sağlayacaktır burada açıklanan. Bu tür gelişmeler altında, bizim protokolleri ekspresyonu, c dahil olmak üzere, diğer uygulamaların içine beslenebilironditional indüksiyon, soy özgü muhabiri hatları, shRNA veya siRNA knockdown türetilmesi, gen hedefleme ve homolog rekombinasyon.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
EDTA ile% 0.25 tripsin	Invitrogen	25200056
2-merkaptoetanol	Invitrogen	21985-023
3 mm cam boncuklar	Fisher Scientific	11-312A	Cam boncuklar, sodyum hidroksit (NaOH) ve saf su ile durulanır gece boyunca hidroklorik asit (HCl) ile yıkandı, ve kullanımdan önce otoklav ile sterilize edilmesi gerekir.
Accutase hücre ayrışma reaktifi	Invitrogen	A11105-01
Temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF)	Invitrogen	PHG0263
DMEM (yüksek glukoz)	Lonza	12-741 F
Fetüs buzağı serumu	Invitrogen	16000044
Geltrex	Invitrogen	12760013	Büyüme faktörü azalır
GeneJuice transfeksiyon reaktif	EMD Biosciences	70967
Glutamax-I (100X)	Invitrogen	35050061	L-Glutamin (Invitrogen, 25030081) de yerine kullanılabilir.
İnsan IPSC KOSR medya			500 ml insan ES ortam 390 ml KnockOut DMEM / F12, 100 ml KnockOut serum Replacer, 5ml Glutamax I (100X), 5ml NEAA (100X), 500 ul 2-merkaptoetanol (55 mm) oluşan ve 10 ng / ml bFGF ile desteklenmiş .
KnockOut DMEM/F12	Invitrogen	12660-012
KnockOut Serum Değiştirme (KOSR)	Invitrogen	10828-028
Fare embriyonik fibroblast medya			EMB ortam% 90 FBS, 1X NEAA, 1X Glutamax I ve DMEM içinde 1X sodyum piruvat (yüksek glikoz) oluşmaktadır
Sigara esansiyel amino asit, NEAA? (100X)	Invitrogen	11140050
İnsan kök hücre nucleofector solüsyonu 1 takviyesi ile	Lonza	VAPH-5012
Fosfat Ca 2 olmadan + ve Mg 2 Tamponlu Salin +	Invitrogen	10010023
Sodyum piruvat (100X)	Invitrogen	11360070
STEMPRO orta kiti	Invitrogen	A1000701	500 ml STEMPRO ortam 454 ml Knock oluşmaktadırÇıkış DMEM / F12, 10 ml serum içermeyen STEMPRO büyüme ek (50X), 5ml Glutamax I (100X), 5ml NEAA (100X), 36 ml BSA (bovin serum albumin, 25%), 909 ul 2-merkaptoetanol (55mm ) ve 10 ng / ml bFGF ile desteklenmiş.