Morfolojik analiz Drosophila Larvaların Periferik Duyusal Nöron Dendritler ve Aksonlar

Özet

Dendritik arborization duyusal nöronlar Drosophila Larva periferik sinir sisteminin genel ve nöron nöron farklılaşma sınıfa özel mekanizmaları aydınlatmak için faydalı model vardır. Biz dendritik arborization nöron genetik mozaikleri oluşturmak ve analiz etmek için pratik bir rehber sunuyoruz.

Özet

Sinir sistemi gelişimi doğru nöron sınıfa özel dendritik gelişim ve aksonal kablo takip nöron konumu ve kimliği, doğru özellikleri gerektirir. Son zamanlarda Drosophila larva periferik sinir sistemi (PNS) dendritik arborization (DA) duyusal nöron nöron farklılaşma iki genel ve özel sınıf mekanizmaları aydınlatmak için güçlü bir genetik model haline gelmiştir . Dört ana DA nöron sınıfları (I-IV) ¹ vardır. Dendrit çardak karmaşıklığı artan sırasına göre adlandırılır ve kendi farklılaşma ^2-10 genetik kontrol özel sınıf farklılıkları vardır. 1) DA nöron dendrit çardak yayılır meyve sineği güçlü genetik araçlar, 2) yararlanmak: Çünkü DA duyusal sistem dendritik morfoloji ^11-13 kontrol arkasındaki moleküler mekanizmalarının araştırılması için pratik bir model bir optik cle altında sadece 2 boyutlu olarakar larva manikür) kolay in vivo yüksek çözünürlüklü, 3 görselleştirmek için sınıfa özel çeşitliliğin dendritik morfoloji) basit vs yüksek dallı dendritik ağaçlar oluşumunu kontrol anahtar öğeleri bulmak için karşılaştırmalı bir analizini kolaylaştırır ve 4 basmakalıp dendritik çardak şekilleri farklı DA nöronlarının morfometrik istatistiksel analizler kolaylaştırır.

DA nöron aktivitesi, larva lokomosyon merkezi desen ^jeneratör 14-16 çıkış değiştirir . Farklı DA nöron sınıfları farklı duyusal yöntemleri var ve bunların aktivasyon ^14,16-20 farklı davranışsal tepkiler ortaya çıkarır. Ayrıca farklı sınıflar, ventral sinir kablosunu Drosophila larva merkezi sinir sistemi ^(VNC) 21 basmakalıp aksonal projeksiyonlar gönderir . Bu tahminler, dendritik ^alanında 7,22 vücut duvarı DA nöron duyusal yöntemidir ve pozisyon hem topografik gösterimleri ile sona erdirme, 23. DA aksonal projeksiyonlar Bu nedenle muayene topografik harita ^7,22,23 yanı sıra, basit bir devre modüle larval ^lokomosyon 14-17 kablolama altında yatan mekanizmaları aydınlatmak için kullanılabilir .

Biz burada MARCM (Mozaik Repressible Hücre Marker Analizi) ^1,10,25 ve ^Flp-22,26,27 teknikleri (Şekil 1 özetlenmiştir) ile ²⁴ işaretleme DA nöronlar oluşturmak ve genetik mozaikler analiz için pratik bir rehber sunuyoruz.

Protokol

Reaktiflerin, 1.Preparation

1. Ca ^{+ +} ücretsiz HL3.1 tuzlu su ²⁸ hazırlayın.
   1. MM: 70 NaCl, 5 KCl, 20 MgCl _2, 10 NaHCO _3, 5 Hepes, 115 sakkaroz ve 5 trehaloz; pH 7,2. Sterilize Filtre ve 4 saklamak ° C
      Not: Ca ^{+ +} ücretsiz bir çözüm diseksiyonu sırasında kas kasılması önler.
2. Poli-L-lisin (PLL) lamelleri olun.
   1. 100mg PLL, -20 ° C'de 4.2ml suda çözülür ve 300μl alikotları Eppendorf tüpleri ve dondurma yapmak
   2. Kaplama lamelleri, ilk çözülme bir kısım, GKD ₂ O 10ml getirmek ve Kodak Photo-Flo 20μl eklemek önce son PLL konsantrasyonu 0.7 mg / ml;
   3. Batmak lamelleri, 30 dakika için PLL çözüm çıkarın ve kuru, kısa bir süre sonra su ve kuru yıkayın. Iki kez tekrarlayın. Arıtılmış lamelleri son yaklaşık bir ay.

2. Genetik haçlar

1. To MARCM klonlar oluşturur. İşte bir örnek çapraz bir pan-DA sürücü ^11,27 kullanarak:
   FRT2A x hsFLP Gal4 ^{109 (2) 80,} UAS-mCD8: GFP, küvet-Gal80 FRT2A/SM5-TM6B
2. Klonlar Flp-out oluşturmak için. Burada bir sınıf IV-özel sürücü ⁸ kullanarak bir örnek çapraz:
   PPK-Gal4 x yw, hsFLP UAS-FRT-CD2, y ^{+-stop-FRT-mCD8:} GFP

3. Embriyoların toplanması

1. Drosophila haçlar tutun bir koleksiyon şişesi 25 ° C ve maya yapıştırın ^30,31 ince bir tabaka ile bir elma suyu agar plaka ²⁹ yayılmasını embriyolar toplamak.

4. Isı şok tedavi embriyoların

1. Embriyoların atılmış, bunun üzerine elma suyu agar plaka muhalefet boş bir tabak yerleştirin. Parafilm (Şekil 2) ile bu iki tabak etrafında Seal.
2. Isı şok sırasında, batığın incie su banyosu plaka ve bir metal ağırlık kullanarak basılı tutun.
3. MARCM embriyolar
   1. 2s için embriyolar toplayın ve çevrili bir 10cm petri inkübe ek bir 2 saat için 25 ° C'de doku nemlendirilmiş.
      Not: ısı şok protokolü ayarlama klonları oluşturulur hangi frekans değiştirir.
   2. 38 1s için su banyosu tek izole nöronların, daldırın ve ısı şok amaçlayan bir klon daha az sayıda ° C için
   3. Klon daha büyük bir sayı için, 45 dakikaya için ısı şoku 38 ° C, ek bir 30 dakika daha sonra RT 30 dakika, ısı çarpması kurtarmak.
4. 24 saat embriyolar Flp toplamak ve 38 1s için ısı şok ° C

5. Klonlar için tarama

1. Isı şok sonra, su geçirmez bir düzenlemenin kapağını kaldırın ve elma suyu agar plaka 10cm petri nemlendirilmiş dokuları ile çevrili bir yerde. Kültür dolaşmak kadar embriyo ve sonraki larva 25 ° Cing ^3. instar.
   Not: kültür koşulları, beslenme, özellikle DA dendritik çardak morfolojisi ^32,33 değiştirmek için ortaya konmuştur. Büyüyen larva, her zaman maya yapıştırmak için erişimi olduğundan emin olun; gerektiği gibi yapıştırın maya izlemek ve yenilemek.
2. Bu noktadan itibaren protokol itibaren, larvaları hafifçe böcek forseps kullanarak işleyebilirsiniz.
3. Kısaca ve yavaşça, musluk suyunda larvaların yıkayın ve sonra agar bir tabağa koyun.
   Not: Bu adım, arka planda otomatik floresan larva yüzeyinde yiyecek veya kirden azaltır.
4. Güçlü bir floresan diseksiyon mikroskobu altında larvaları inceleyin. Larvaların vücut duvarı GFP pozitif nöronlar / hücreleri ile tanımlayın.

Dendritler 6 in vivo görüntüleme

1. Larva küçük bir damla% 80 gliserol ile depresyon slayt bardağın içine yerleştirin. Larva hareketsiz bir slayt lamel yerleştirin. Herhangi bir hava larva ve coversli arasında kalmasını sağlamaks.
2. Ilgi nöron görselleştirme izin vermek için larva rulo lamel yavaşça itin. MCD8: konfokal mikroskobi ile GFP etiketli dendritik mili.

7. Larvaların diseksiyonu

Başlamadan önce Not: DA nöron dendritler diseksiyon başladıktan sonra hızla zayıflar. Iyi dendrit morfolojisi sağlamak için daha az 5dk her bireyin larva parçalara ayır.

1. ^3. instar larvaları dolaşıp, aşağıdaki değişiklikler ile daha ^önce 34 açıklandığı gibi bir Sylgard plaka üzerinde teşrih :
   1. DA nöron akson Termini görüntüleme için, merkezi sinir sistemi sağlam ve segmental sinirler kırık olmadığını garanti eder. Larvaların açtıktan sonra, ilk önce vücut duvarı dikkatle trakeal bağlantıları kesmek ve daha sonra yavaşça tüm bağırsak kaldırmak.
   2. Eğer dendritler yalnız görüntüleme, düz bir montaj sağlamak için MSS çıkarın.

8. Fixatlarva filetosu iyon ve engelleme

1. Hala Sylgard plaka tutturulmuş larva ile yavaşça dönen çalkalayıcı RT 20mins için PBS içinde% 4 PFA sabitleyin.
2. Fiksasyon sonra larva dokularının izleri (yağ vücut, trakea, vb.) Çıkarın.
3. Sylgard plaka ve çalkalayıcı üzerinde 3x 10mins (% 0.1 Triton X-100 ile PBS) PBST yıkayın. Akson terminallerini inceleyerek varsa fileto, Sylgard plaka üzerinde tutun. (Boyama dendritler Eğer bu adımı ³⁴ larva filetosu 0.5 ml tüp aktarmak mümkün)
4. RT 20mins larvaları çalkalamalı PBST% 5 normal eşek serum (NDS) engelleyin.

9 - Larva filetosu boyanması

1. Primer antikor engelleme çözümü ve inkübe çevrili küçük bir Tupperware konteyner ° C dokuların nemlendirilmiş 4 geceleme (NDS / PBST% 5) çıkarın.
2. 4 ° C tüpler çıkartın ve oda sıcaklığında bir saat inkübe edin.
3. PBST 6x 10mins yıkayın. Ikincil antib ekleody (NDS / PBST% 5) ve kapak fluorofor fotoğraf beyazlatma ³⁴ engellemek için.
4. Ya iki saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin, ya da bir gecede 4 ° C oda sıcaklığında bir saat izledi.
5. PBST larvaları 6x 10mins yıkayın ve montaj devam.

10. Dendrit çardak muayene için larva filetosu montajı

1. Mount diseksiyon makas veya baş (ağız kanca da dahil ^olmak üzere) ve 34 (spiracles dahil) posterior kesmek için bir neşter kullanılarak mümkün olduğu kadar düz, her larva fileto.
2. % 80 gliserol monte slayt aşağı manikür-yan larva fileto yerleştirin ve 'hızlı' mount ³⁴ oje ile lamel iki mühür.
3. Kalıcı bir montaj ve daha net bir görüntü için
   1. PLL lamel PBS bir damla üzerine disseke larva fileto kas tarafı aşağı gelecek şekilde yerleştirin, hızla lamel uyacaktır.
   2. Howeve, monte edildikten sonra mümkün olduğunca fazla sıvı olarak Kaldırr tamamen kurumasına izin vermeyin.
   3. % 35 etanol,% 50,% 70,% 95, ve her biri 10 dakika (2.% 100 EtOH çözüm sık değiştirilmesi olmalıdır nihayet 2x% 100 etanol: etanol bir dizi lamel (ekli larva fileto) atın ); nihayet, 2-3x Ksilen 10mins yıkayın.
   4. DPX mountant (Distyrene Plastifiyan Ksilen) temiz bir slayt üzerinde bir damla koyun ve üstüne dikkatlice lamel fileto tarafı aşağı yatıyordu. Karanlıkta tutun ve görüntüleme önce ayarlamak için DPX için bir gün bekleyin.

11. Akson Termini muayene için larva filetosu montajı

1. Segmental sinirler diseksiyonu, fiksasyon sırasında sağlam PNS ve MSS arasında çalışan ve periferik duyusal nöron hücre gövdesi VNC aksonlar izleme izin boyama tutun.
2. Bir depresyon slayt% 80 gliserol her larva fileto manikür tarafı yere monte edin. DA hücre gövdesi aksonlar İzKonfokal mikroskop altında VNC. Not: VNC cognate segmentine her vücut duvarı segmentinde projesi PNS nöronlar.

12. Temsilcisi Sonuçlar:

Temsilcisi sonuçları rakamlar 3-5 gösterilmiştir. Şekil 3 konfokal mikroskop altında in vivo olarak yakalanan bir sınıf IV da nöron, tüm mili gösterir. Şekil 4 doğru morfolojisi korumak için sabit olmuştur immünohistokimyasal etiketli bir sınıf III nöron dendrit çardak bir parçası kadar yakın gösterir. Ilişkili içerlek (anti-GFP antikor ile hem boyanmış), başarısız bir diseksiyon ve fiksasyon sonra oluşabilir bozulma gösterir. Şekil 5 MSS tek bir sınıf IV akson terminus (anti-GFP, yeşil), tüm sınıf IV Termini anti-CD2 (kırmızı) ile birlikte lekeli.

Şekil 1 Protokolü genel bakış. a) toplayın ve sonra ısı-şok embriyolar. b) Canlı larva sonra bir GFP pozitif DA nöron klon ile larva, ve görüntü GFP etiketli dendrit çardak seçin. c) larva ayır ve sonra immünohistokimyasal fileto leke. d) Mount lekeli fileto ve ardından görüntü, dendritik mili ve aksonal projeksiyonlar DA nöron klonlar.

Şekil 2 elma suyu agar plaka ısı şok Hazırlık. Plaka (beyaz ok, ab) (kırmızı ok b) üstüne atın, ikinci bir petri ekleyin ve Parafilm (mavi ok, b) ile mühür.

Bir mCD8 dendrit çardak in vivo görüntü Şekil 3: ^3. instar larva bir sınıf IV (v'ada) nöron temsil GFP etiketli MARCM klon (2.1 olarak genotip). Ölçek çubuğu 50μm.

d/3111/3111fig4.jpg "/>
Şekil 4 mCD8: başarılı diseksiyon ve fiksasyonun (yeşil) sonra iyi morfoloji gösteren anti-GFP antikor ile boyandı sınıf III nöron (ddaA), GFP etiketli MARCM klonu. Başarısız diseksiyonu ve sabitleme (kırmızı) sonra ortaya çıkan içerlek gösterir dendrit bozulması (beyaz ok). Ölçek çubuğu 25μm.

Şekil 5 ^3. instar larva VNC. Tek bir sınıf VI (vdaB) akson terminus (2.2 olarak genotip) bir Flp-out klonu anti-GFP antikor (yeşil) kullanarak tespit edilmiştir. Anti-CD2 tüm sınıf IV Termini (kırmızı) etiket. Ölçek çubuğu 25μm.

Tartışmalar

Drosophila larva DA nöron modeli mekanizmalarının araştırılması için mükemmel bir genetik sistem sağladığı kontrolü nöron morfolojisi ve devre oluşumu. MARCM genel etiketleme ve mutant DA nöron klonları üretmek için kullanılır. MARCM için bir pan-nöral (örneğin Gal4 ^C155) ya da nöron spesifik bir sürücü kullanır . Bir pan-nöral sürücüsü kullanarak doğrudan kamu stok merkezlerinde yaygın olarak çeşitli stokları kullanmak mümkündür. MSS işar...

Malzemeler

Reaktifi Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar (isteğe bağlı)
SZX16 floresan diseksiyon mikroskobu (GFPHQ filtre ile)	Olympus	SZX16
Canlı Böcek Forseps	FST	26030-10
26mm x 76mm depresyon slayt cam	Toshinriko Co.	T8-R004
Sylgard 184 (veya Silpot 184)	Dow Corning	3097358-1004
Poli-L-lisin	Sigma	P-1524	Bu ürün en etkili olduğu kanıtlanmıştır
DPX montaj orta	Sigma	44581
Tavşan, anti-GFP	Invitrogen	A-11122	Seyreltme 1:500
Sıçan, anti-CD8	Caltag	5H10	Seyreltme 1:200
Fare, anti-CD2	AbD serotec	MCA443R	Seyreltme 1:700
Fare, anti-Fasciclin2	DSHB	1D4	Seyreltme 01:10