Voltaj-kapılı potasyum Kanal mRNA gösterilmeden Tek hücreli RT-PCR teknikleri kullanarak Nigral Nöronlar

Özet

Nöronlar ilk elektrofizyolojik karakterizedir. Ardından kaydedilen nöron sitoplazma aspire ve nörotransmitter sentezi enzimler, iyon kanalları ve reseptörler mRNA'ların ifade algılamak için ters transkripsiyon-PCR analizi tabi.

Özet

Memeli santral sinir sistemi, nöronların farklı moleküler ve fonksiyonel özellikleri ile farklı türleri birbirlerine ayırmak için zor ve aynı zamanda kolaylıkla morfolojisi tarafından belirlenen iç içe. Böylece, belirli bir nöron türü gen ekspresyonu analiz etmek genellikle zordur. Burada önemli nigra nöronlarının farklı tipte profil mRNA tek hücreli ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (scRT PCR) ile tam hücreli yama kelepçe kayıt teknikleri birleştiren bir prosedür belge. Elektrofizyolojik teknikleri ilk bireysel nöronların nörofizyolojik ve fonksiyonel özellikleri kaydetmek için kullanılır. Sonra, elektrofizyolojik karakterize tek nigral nöron sitoplazma aspire ve nörotransmitter sentezi enzimler, reseptörler ve iyon kanalları için mRNA profillerini elde etmek için scRT-PCR analizine tabi tutulur. Yüksek seçicilik ve duyarlılık immünohistokimya, uygun antikor ya da protein ekspresyon seviyesi düşük eksikliği nedeniyle kullanılamaz zaman bu yöntem özellikle yararlı olun. Bu yöntem aynı zamanda diğer beyin bölgeleri nöronların için geçerli.

Protokol

1. Beyin dilim hazırlık

1. Genç (15-40 gün eski), erkek ve dişi Sprague-Dawley sıçan kullanılmıştır. (Biz de bu aynı protokolü fareler kullanın.) Derin üretan anestezisi altında, hayvanlar dekapite ve beyin hızlı bir şekilde disseke edilir. Leica vibratome (VT-1200S) substantia nigra midrostral kısmını içeren sonra 300 mikron kalınlığında koronal beyin dilimleri kesilir. 220 sakaroz, 2.5 KCl 1,25 NaH ₂ PO _4, 25 NaHCO _3, 0.5 CaCl _2, 7 MgCl _2, 10 D-dilim kesme işlemi (mM) içeren bir çözüm kesen bir buz-soğuk, yüksek oksijenli sakaroz yapılır: glikoz. % 95 oksijenli tutmak ve pH 7.4 'de korumak için O ₂ /% 5 CO ₂ karışımı ile kabarmış. Kesim çözüm prosedürü boyunca buz tutun.
2. 125 NaCl, 2.5 KCl, 1.25 NaH ₂ PO _4, 25 NaHCO _3, 2.5 CaCl _2, 1.3 MgCl _2, 10: beyin dilimleri içeren oksijenli bir yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) (mM) ile dolu bir kuluçka odasında inkübe edilir D-glukoz. % 95 oksijenli tutmak ve pH 7.4 'de korumak için O ₂ /% 5 CO ₂ karışımı ile kabarmış. Inkübasyon sıcaklığı beyin dilim kayıt odasına transfer ° C 45 dakika kadar oda sıcaklığında 34.

2. Nigral nöron Elektrofizyolojik parmak izi

1. Bir beyin dilim 32 oksijenli aCSF ile perfüze sürekli bir yama kelepçe kayıt odasına ° C aktarılır
2. Patch pipetler otoklava borosilikat (KG-33) PC-10 çektirmesi (Narishige, Tokyo, Japonya) kullanılarak cam kapiller tüp (1.10 mm id, 1.65 mm od, Kral Hassas Cam, Claremont, CA) çıkardı ve hücre içi çözeltisi ile doldurulur DNaz-RNaz içermeyen su (Fisher Scientific) (135 mM KCl, 0.5 mM EGTA, 10 mM HEPES, 1.5 mM MgCl _2, 7.3 pH değeri ayarlanmış içeren) ile hazırlanmıştır. Yama pipetler, banyo M 2-3 dirençleri var.
3. Substantia nigra farklı anatomik konumu (Şekil 1A1-2) göre tespit edilir. Nomarski optik ve substantia nigra pars compacta (SNC) ve substantia nigra 60X suya daldırma objektif, geniş hücreler ile donatılmış bir video mikroskobu (Olympus BX51W1) görsel rehberliği altında (SNR) (mümkün DA nöronların ve GABA nöronlar) reticulata seçilen pars kayıt için. Konvansiyonel giga ohm sıkı bir mühür tam hücreli yapılandırma (Şekil 1B1) elde edilir. Şu kelepçe ve gerilim kelepçe analizleri yapılabilir. MRNA bozulması en aza indirmek için, elektrofizyolojik kayıt (≤ 5 dk) kısa olmalıdır. Bir seçenek, çıkarlarını nöron (Şekil B2-3) elektrofizyolojik parmak izi sağlamak için sadece membran ve spiking özellikleri kaydetmek için . Bu kısa kaydı sadece 1 dakika sürer.

3. Sitoplazma aspirasyon

1. SNR GABA ve DA nöronları elektrofizyolojik parmak izi ve karakterizasyonu sonra, nazik ağız emme sitoplazma aspire uygulanır. Hücre çekirdeğinde de genomik DNA kirlenme sonucunda aspire edilebilir. Sıkı mühür kırık olmamalıdır, aksi ekstrasellüler enkaz mRNA da dahil olmak üzere, yama pipet içine emilir ve hücre içeriğini kirletmiş olabilir. -70 MV holding akım arttıkça sürece sıkı mühür bütünlüğünü iyi 100 pA aşmamaktadır.
2. Daha sonra aspire hücre içeriğini pipet ucu ve küçük bir pozitif basınç kırarak 0,2 ml PCR tüpü içine atılır. Bir hücrenin içeriğini bir PCR tüpünün içine toplanır. Hücre içeriğini kabul ettikten sonra, PCR tüpü toplayarak, buz üzerinde önceden soğutulmuş hemen -20 ° C derin dondurucuya konur.
3. MRNA'ların içerebilir ekstrasellüler enkaz kontaminasyonu ekarte etmek için, yama pipet aslında sitoplazma aspire dokusu içine düşürülür ve sonra RT-PCR pipet içerik tabi tutulur.

4. Ters transkripsiyon (RT)

1. Nöronların, genellikle 10-20 makul bir sayıda hücre içeriğini topladıktan sonra, RT mRNA'ların bozulması en aza indirmek için hemen başlamalıdır.
2. Tek bir nöron hücre içeriğini miktarı çok küçük olduğundan, RNA izolasyon prosedürü uygulandı değildir. Potansiyel kirlenmesine neden olan genomik DNA kaldırmak için, aspire hücre içeriğini ilk DNaz I (5 mcL DNaz I ve 1.6 mcL DNaz I Tampon, 5 dakika 25 ° C) tarafından sindirilir. Sonra DNaz 1.2 mcL 25 mM EDTA ekleyerek 5 dakika için 75 ° C'de inkübe inaktive olur.
3. cDNA Üst Simge III ters transkriptaz tabanlı Hücreler-Doğrudan cDNA Sentezi kiti (Invitrogen, Tablo 1) kullanılarak sentezlenir. CDNA İlk iplikçik, 50 sentezlenmiş ° C de 50 dakika sonra reaksiyon 85 ° C 5 dakika ve 1 mcL RNaz H ekleyin kuluçka tarafından inaktive olured mRNA (37 ° C 20 dk) sindirmek için. Tek telli cDNA daha sonra PCR için -20 ° C'de saklanır.
4. Genomik DNA tamamen çıkarılması, diğer tüm reaksiyon bileşenlerini tam olarak aynı iken ters transkriptaz ihmal edildiği RT-eksi kontrolü ile doğrulanır.

5. İki aşamalı PCR

1. Astarlar GenBank dizileri, göre dizayn edilmiştir. Mümkün olduğunca, intron kapsayan primer çiftleri yardım genomik DNA kirlenme tespit kullanılmıştır. Primer çiftinin dizilimini Tablo 2'de listelenmiştir. Primer çiftlerinin etkinliğini ilk pozitif ürün veren tüm beyin mRNA'ların tarafından kontrol edilmelidir. Bütün primerler Entegre DNA Teknolojileri (Coralville, Iowa, ABD) tarafından sentezlenen.
2. İlk aşamada, 30 mcL cDNAs 5 mcL varlığında primer çifti (Tablo 2) 35 döngü için yükseltilir. Termal cycler termal bisiklet protokolü (Mastercycler, Eppendorf, Tablo 1), 2 dakika 94 ° C, ilk denatürasyon 94 15 sn sonra 35 döngü ° C doğasını, 30 s: 55 ° C tavlama için 45 s ve 72 ° C, son uzatma için 7 dakika takip uzatmak için. PCR süper mix (Invitrogen, Tablo 1) Taq DNA polimeraz, deoksinükleotid trifosfatlar (dNTP) ve PCR için gerekli tüm diğer bileşenler tarafından sağlanan
3. Ikinci aşamada PCR, ^1. Aşama PCR 1 mcL ürün şablon olarak kullanılır ve ilk aşamada kullanılan aynı primer çifti kullanılmıştır (Tablo 2). 30 kısaltılmış uzatma süresi ile 40 döngü çalıştırılır s Aynı PCR süper karışımı kullanılır.
4. ^2. aşama amplifikasyon PCR ürünleri% 2.5 agaroz jel elektroforezi ile ayrılmış, UV ışığı altında etidyum bromür (0.05 mg/100 ml jel) veya gelgreen tarafından görüntülendi ve fotoğraflandı (B4 Şekil). Pozitif bantlar sonra kesip, bir Qiagen ekstraksiyon kiti (Tablo 1) ve sıralı kullanarak ayıklanır ve hedef genlerin yayınlanan dizileri ile karşılaştırıldı.

6. Temsilcisi sonuçları:

Substantia nigra pars compacta ve reticulata pars ve substantia nigra komşu GABA projeksiyon nöronlar dopamin (DA) nöronlar pars reticulata farklı elektrofizyolojik karakteristikleri (Ding ve ark 2011. Zhou ve ark 2006). Şekil. 1B2, SNR GABA nöronlar 10 Hz etrafında yüksek frekanslı spontan spike sergilerler. Ani, etrafında bir baz süresi 1 ms var. Mevcut enjeksiyon hiperpolarizan üzerine, bu nöronların akımı I _h (Şekil 1B2) zayıf bir ifade gösteren SNR GABA nöronlar, mevcut enjeksiyon hiperpolarizan yanıt zayıf bir depolarizan sarkma gösterir. Buna karşılık, nigral DA nöronları (2 Hz etrafında) 3 ms etrafında bir baz süresi kendiliğinden ani düşük frekanslı sergilerler. DA nöronlar _saat akımı (Şekil 1B3) (Ding ve ark 2011, Zhou ve ark 2006) güçlü bir ifade de, mevcut enjeksiyon hiperpolarizan tepki gösteren belirgin bir sarkma gösterir .

scRT-PCR elektrofizyolojik tespit SNR GABA nöronlar glutamik asit dekarboksilaz 1 (GAD1 GABA nöronların GABA sentezi ve bir işaretleyici için anahtar enzim) mRNA algılandı, ancak DA nöronları (Şekil 1B4, 5). Aksine, scRT-PCR elektrofizyolojik tespit SNC ve SNR DA nöronları tirozin hidroksilaz (TH, DA nöronlar dopamin sentezi ve bir işaretleyici anahtar enzim) için mRNA tespit ancak GABA nöronlar (Şekil 1B4, 5). Yani scRT-PCR sonuçları elektrofizyolojik nöron kimlik onaylayın. Sonra, scRT-PCR voltaj aktive Kv3 kanal alt birimden, Kv3.1, Kv3.2 Kv3.3 ve Kv3.4 ifade profil kullanılmıştır. Bu alt birimden voltaj kapılı K oluşturmak için katkıda ⁺ altbirim kompozisyon (Ding ve ark 2011) bağlı olarak farklı özellikleri kanallar. SNR GABA nöron örnekte Şekil. Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 ve Kv3.4 1B4, mRNA'ların tespit edildi. Örnekte SNR DA nöron, Fig.1B5 gösterilen sadece Kv3.2 Kv3.3 ve Kv3.4 tespit edildi. Bizim toplanmış veriler, Kv3.1 daha sık, hızlı spike SNR GABA nöronlar (Ding ve ark 2011) Kv3.1 daha yüksek bir ifadesi seviyesi gösteren SNR GABA nöronlar nigral DA nöronları daha tespit edildi.

Şekil 1. SNR GABA nöronlar ve nigral DA nöronları Elektrofizyolojik kimlik: nigral alanlarda farklı anatomik konumunu tespit edilebilir. A1 1X amacı ile çekilen koronal Nissl lekeli bir bölümünde, SNC ve SNR yerini gösterir . Kutulu alan captur10X objektif ve orta görüntülenen ed ok ile gösterilen. Hücre zengin SNC ve hücre-fakir SNR açıkça göze çarpıyor. A2 4X bir hedefi ile yakalanan canlı, lekesiz koronal bölümünde SNC ve SNR yerini gösterir. Hücre zengin SNC ve hücre-fakir SNR de açıkça tanımlanabilir. Tüm hücre modunda kenetli bir SNR GABA nöron yama gösterir. VTA, ventral tegmental alan. B1, B2 mevcut kelepçe kayıt modunda SNR GABA nöronların tipik elektrofizyolojik özelliklerini gösterir . Bu nöronlar yangın kendiliğinden yüksek frekanslı eylem, kısa bir süre potansiyel ve mevcut enjeksiyon hiperpolarizan zayıf bir _{I h-aracılı} sarkma tepki var. B3 geçerli kelepçe kayıt modunda nigral DA nöronların tipik elektrofizyolojik özelliklerini gösterir . Onlar, uzun süren spontan düşük frekanslı aksiyon potansiyelleri ateş ve belirgin _{bir h-aracılı} sarkma (ok başı) mevcut enjeksiyon hiperpolarizan tepki var . Böylece, SNR GABA nöronlar ve nigral dopamin nöronları açıkça. Elektrofizyolojik tespit B4 bir elektrofizyolojik tespit SNR GABA nöron scRT-PCR ürünleri bir jel resmi gösterir. Glutamat dekarboksilaz 1 (GAD1) ​​mRNA ancak Tirozin hidroksilaz (TH) mRNA tespit edildi. Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 ve Kv3.4 mRNA'ların bu SNR GABA nöron tespit edildi. B5 SNR DA nöron nöron Kv3 kanal mRNA'ların scRT-PCR gösterir. TH mRNA ancak GAD1 mRNA elektrofizyolojik tespit SNR DA nöron tespit edildi. Kv3.2, Kv3.3 ve Kv3.4 mRNA'ların bu SNR DA nöron B6 toplanmış verileri gösterir tespit edildi.

7. Olası yanlış negatif ve yanlış pozitif sonuçlar

Edindiğimiz deneyimlere dayanarak, çeşitli faktörler, yanlış negatif scRT-PCR sonuçlarına yol açabilir. Bu faktörler, yeterli miktarda sitoplazma pipet tıkanma, RNaz kirlenme ve verimsiz PCR primerleri yama nedeniyle aspire yetersizlik sayılabilir. Patch pipet tıkanma genellikle video monitörde görülür ve daha fazla erişim direnci ile gösterilir. RNaz kirlenme doğru hareket ettirilir ve eldiven ile önlenebilir. Bir beyin doku yumruk toplam RNA PCR primer etkinliği test edilmelidir (Zhou ve ark 2008;. Ding ve ark 2011).

RT öncesinde ilk örnekleri tedavi etmek için her zaman DNaz kullanmak zamandan beri, biz yalancı pozitif sonuç ile karşılaşmadım. Teorik olarak, DNaz sindirim olmadan, genomik DNA kontaminasyonu ve böylece gen intronsuz veya primer çifti yanlış pozitif algılama ortaya çıkabilir intron bölgesi yayılabilir değildir.

Tartışmalar

ScRT-PCR ile beyin dilim yama kelepçe kayıt kombinasyonu burada iyon kanalları, reseptörleri ve ayrı ayrı karakterize nöronlar nörotransmitter sentezi için önemli enzimler için mRNA ekspresyon profilleri araştırmak için mükemmel bir yöntem sağlamak gösterdi. (Zhou ve ark 2009. Surmeier ve ark 1996), söz konusu proteinin tespit edilir ve düşük ekspresyon seviyesi ve / veya uygun antikor eksikliği nedeniyle immünohistokimya gibi diğer yöntemleri kullanarak lokalize edilemez zaman yararlıdır. Sc...

Malzemeler