Kan örneklerinden Bakteriyel Patojen Algılama ve Antimikrobiyal Direnç Testi için bir günlük iş akışı şeması

Özet

Bakteriyel patojen teşhis için basit bir günlük akışı düzeninin tasarım enfeksiyonu kan hızlı tanıma sağlar. Sekiz klinik bakteriyel hedefleri ve antibiyotik direnç profilleri dahil olması daha uygun tedaviye yol açabilir aynı gün klinisyen bir ilk fikir sunuyor.

Özet

Kan dolaşımı enfeksiyonları nedeniyle sepsis muhtemel tezahürü, ağır sepsis ve septik şok ¹ yüksek mortalite oranları ile ilişkilidir. Bu nedenle, yeterli bir antibiyotik hızlı bir idare kan dolaşımı enfeksiyonlarının tedavisinde önemli bir öneme sahiptir. Bu süreçte kritik unsur bakteri tanımlama ve antibiyotik duyarlılık testi sonuçlarının büyük ölçüde bağımlı zamanlaması vardır. Bu parametreler her iki rutin zaman alıcı ve ortalama 24-48 saat ^{2, 4} alır kültürü bazlı testi ile elde edilir. Bu çalışmanın amacı, DNA bazlı enfeksiyonu kan hızlı bir şekilde tespit için testler, hem de hızlı bir antimikrobiyal duyarlılık test geliştirmektir. İlk testi tür veya cins-spesifik problar ⁵ ile tamamlanmaktadır rDNA tabanlı gerçek zamanlı PCR testi bir eubacterial 16S olduğunu. Bu sondalar, Pseudomonas dahil Gram-negatif bakteriler kullanma., Pseudomonas aeruginosave Escherichia coli gibi Staphylococcus spp., Staphylococcus aureus, Enterococcus spp., Streptococcus spp. ve Streptococcus pneumoniae dahil olmak üzere Gram-pozitif bakterilerin ayırt edilebilir. Bu multiprobe deneyi kullanılarak, etken mikro-organizma bir ilk kimlik 2 saat sonra verildi.

İkincisi, S. antibiyotik duyarlılık testi için yarı-moleküler testi geliştirdi aureus, Enterococcus spp. ve (fakültatif) aerob Gram-negatif çubuklar ^6. Bu test PCR bakteri ⁷ büyüme ölçmek için kullanılan hangi bir çalışmaya dayanıyordu. Kan kültürlerinde doğrudan hasat bakterilerin antibiyotiklere bir seçim ile 6 saat süreyle inkübasyona ve SYBR Green-tabanlı gerçek zamanlı PCR testi sonrasında büyümesini engellediği tespit edilmiştir. Bu iki yöntem birlikte aynı gün (Şekil 1) uygun bir antibiyotik tedavisinin seçimi yönlendirmek olabilir. Sonuç olarakTanımlama ve antibiyotik duyarlılık hem de, moleküler analizi patojen tespiti için daha hızlı bir alternatif sunar ve kan dolaşımı enfeksiyonu tanısı iyileştirebilir.

Protokol

BÖLÜM I: Patojen TANIMLANMASI

1. Numune Hazırlama

Not: aşağıdaki protokol açıklandığı gibi tüm moleküler iş akışı moleküler tanı kalite güvencesi ³ önerileri doğrultusunda yapılmalıdır.

1. A 1:10 seyreltilmiş örnek olmak için 1.5 ml'lik tepkime tüp içine% 0.9 NaCl 0.9 ml kan bir kültür 0.1 ml bir örnek ekleyin. (Seyreltilir qPCR inhibisyonu önlemek için).
2. Pelet 5 dk bakteriyel DNA 13400 xg'de örnek santrifüjleyin.
3. 100 ul steril demineralize H ₂ O bakteri pelletini
4. 4 ° C ye kadar daha fazla kullanımda DNA örneği saklayın.

2. Tanımlama Testi: Real-time PCR 16s rDNA

1. Aşağıdaki gibi reaksiyon karışımı hazırlayın. Assay numune başına dört ayrı reaksiyonlar meydana gelir. Her karışım 12.50 ul ana içerirkarışım, 0.9 uM ileri astar (5-TCCTACGGGAGGCAGCAGT-3) ^7, 0.6 uM ters astar (5-GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3) ⁸ ve probları bir panel. Prob miktarı aşağıda yer alan dört ayrı reaksiyonların her biri için verilmiştir.
2. İlk tepki içerir:
   • 0.2 uM evrensel bir sonda (5-FAM-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3-BHQ1) ⁸
   • 0.2 uM P. aeruginosa prob (5-JOE-CCAAAACTACTGAGCTAGAGTACG-3-BHQ1)
3. İkinci reaksiyon içerir:
   • 0.2 uM E. coli prob (5-JOE-GGAGTAAAGTTAATACCTTTGCTCATT-3-BHQ1)
   • 0.2 uM Pseudomonas spp. Sondaya (5-NED-CCTTCCTCCCAACTTAAAGTGCTT-3-MGBNFQ)
4. Üçüncü reaksiyonu içerir:
   • 0.2 uM Staphylococcus spp. Sondaya (5-NED-AATCTTCCGCAATGGGCGAAAGC-3-MGBNFQ)
   • 0.2 uM S. aureus prob (5-FAM-AGATGTGCACAGTTACTTACACATAT-3-BHQ1)
   • 0.2 uM Enterococcus spp. (5-JOE-TCCTTGTTCTTCTCTAACAACAGAG-3-BHQ1)
5. Dördüncü reaksiyonu içerir:
   • 0.2 uM evrensel bir sonda (5-FAM-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3-BHQ1)
   • 0.3 uM Streptococcus spp. Sondaya (5-NED-CCAGAAAGGGACSGCTAACT-3-MGBNFQ)
   • 0.2 uM S. pneumoniae prob (5-JOE-CCAAAGCCTACTATGGTTAAGCCA-3-BHQ1)
6. 20 ul toplam hacimde ulaşmak için steril demineralize _H2O ekleyin. Bir 96-kuyulu plakanın PCR kuyucuklara Her reaksiyon karışımı 20 ul ekleyin.
7. Her bir kuyucuğa örnek 5 ul ekleyin.
8. 96-PCR plakanın damgalanması yapışkan film kullanın.
9. Aşağıdaki en iyi termal siklus koşullarını kullanarak ABI PRISM 7900HT Real Time PCR Sistemi plaka çalıştırın:
   • 10 dakika süre ile 50 ° C de ön-ısıtma
   • 15 dakika boyunca 95 ° C'de ön denatürasyon
   • 42 döngü
     • 15 sn 95 ° C 'de denatürasyon
     • 1 dakika boyunca 60 ° C'da tavlama

3. Sonuçların Analizi

1. Sekmesi Analiz Ayarlar 0.1 Ct Analiz eşiği ayarlayın. 6 ve End (Cycle): 15 Başlat temel yapılandırmaları (Cycle) daraltın.

2. Tüm numuneler için döngüsü eşiği (Ct) değerini kaydedin. Pozitif bir PCR sonucu dikkate cut-off değeri 35 bir Ct-değere ayarlanabilir. Kan kültürlerinde mevcut bakteri miktarı Ct-değerleri 35 altında üreten, 10 ⁷ 10 ¹¹ CFU / ml arasında değişmekteydi.

BÖLÜM II: ANTİBİYOTİK DUYARLILIK TESTİ

4. Pozitif Kan Kültürleri ⁹ Bakteri İzolasyonu

1. Pozitif kan kültürü şişe suyu 5 ml aspire ve serum ayırıcı tüpüne aktarın.
2. 10 dakika boyunca 2000 x g'de santrifüje serum ayrıştırıcı tüp.
3. Serum ayırıcı tüpten atılır.
4. Transferi bacTeria steril pamuklu ile tüp jel tabakası den% 0.9 'luk tuzlu su içine bir 0,5 McFarland standart bir süspansiyon elde edilinceye kadar.

5.. Mikro Titre Tabaklar Aşılanması

1. 5 x 10 ⁵ CFU / ml 'lik bir süspansiyon oluşturmak üzere çift konsantre Mueller Hinton II çorbasındaki 0,5 McFarland süspansiyonu ile seyreltilir.
2. Antibiyotikler (Tablo 1) bir seçim içeren bir mikro titre plakanın kuyularına Bu süspansiyon ekleyin.
3. 6 saat süreyle 37 ° C 'de mikro titre plakası inkübe.
4. 4 ° C (negatif büyüme kontrolü gibi) de süspansiyon bir kısım saklayın.
5. İnkübasyonun 6 saat sonra, steril bir tüp içinde, her sıra bir içerik transfer gibi olumsuz büyümesini kontrol örneği 4 ° C de muhafaza edildi olduğu
6. 5 dakika boyunca 16.000 g'de santrifüje borular.
7. Dikkatle bakteriyel pelet bozmadan, süpernatant kaldırın.
8. Steril demineralize H pelletini _{2 O.}
9. Steril demineralize H ₂ O 10 kat örnekleri sulandırınız

6. Real-time PCR 16'lar rDNA ¹⁰

1. Aşağıdaki gibi PCR karışımı hazırlandı:
   • 12.50 ul iQ SYBR Green Supermix
   • İleri 0,5 uM astar 16S-1 (5-TGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3) ¹¹
   • 0.25 uM ters primer 16S-2 (5-TACCGCGGCTGCTGGCAC-3) ¹¹
   • 20 ul toplam hacme steril demineralize _H2O
2. Bir 96-kuyulu plakanın PCR kuyucuklara PCR karışımı 20 ul ekleyin.
3. Her bir kuyucuğa örnek 5 ul ekleyin.
4. 96-PCR plakanın damgalanması yapışkan film kullanın.
5. Aşağıdaki optimum ısı bisiklet şartları kullanarak, MyiQ Tek Renk Real-Time PCR Algılama Sistemi plaka çalıştırın:
   • 4 dakika boyunca 95 ° C'de ön denatürasyon
   • İlk ° C'de 30 saniye 65 tavlama
   • 35 döngü
     • 9 denatürasyon15 sn için 5 ° C
     • 1 dakika boyunca 60 ° C'da tavlama
   • (° C 0.57 ° C lik artışlarla birlikte 20 dakika içinde 60-95 arası) eğrisi analizi eritin

7. Sonuçların Analizi

1. Aşağıdaki formül (antibiyotik türüne bağlı olarak) birini kullanarak kesme Ct değeri hesaplanır.
   • Genel olarak:
     Cut-off Ct değeri = Ct değeri pozitif büyüme kontrolü + 0.5 x (Ct değeri negatif büyüme kontrolü - Ct değeri pozitif büyüme kontrolü)
   • Piperasilin, piperasilin / tazobaktam ve Gram-negatif çubuklar seftazidim; Amoksisilin, oksasilin ve trimetoprim / sulfametoksazol S.aureus, Enterococcus spp Amoksisilin:. Cut-off Ct değeri = Ct değeri pozitif büyüme kontrolü + 0.25 x (Ct değeri negatif büyüme kontrolü - Ct değeri pozitif büyüme kontrolü)
2. Pozitif büyüme kontrol olarak steril demineralize H ₂ O ile inkübe örnek kullanın.
3. Mikroorganizma bağlı olarak, uygun negatif büyüme kontrolü kullanın:
   • Gram-negatif çubukları örnek antibiyotik karışımı ile inkübe
   • Enterococcus spp. Örnek 4 ° C'de saklandı
   • S.aureus Örnek 4 ° C'de saklandı
4. Duyarlılığı (S) ya da aşağıdaki gibi test antibiyotik için suşunun direnç (R) belirleyin:
   • Cut-off Ct değeri daha yüksek bir Ct değeri duyarlılık gösterir
   • Cut-off Ct değeri daha düşük bir Ct değeri direnç gösterir

8. Temsilcisi Sonuçlar

İki model organizmalar, Gram-negatif E. yani coli ve Gram-pozitif S. aureus, bakteriyel patojenler ve bunların antimikrobiyal profilinin belirlenmesi algılama ve tanımlama için kombine prosedür görselleştirmek için seçilir. Protokolünün birinci bölümü patojen bir tanıtımım içerir. Specific probları sekiz klinik mikroorganizmaların saptanması için tasarlanmıştır. Bakteriyel paneli dahil bir hedef varlığında, amplifikasyon eğrileri olarak oluşturulur ve Ct değerleri (Şekil 2) hesaplanır. Pozitif bir PCR sonucu dikkate cut-off değeri 35 bir Ct değeri ayarlanır. Şekil 2A, bir E.coli-enfekte kan kültür tanımlama profili gösterilmiştir. 16S evrensel prob iki ayrı reaksiyon karışımlarının içerdiği ve dolayısıyla iki amplifikasyon eğrileri (25.20 ve 25.95 Ct) üretir. Üçüncü sinyal E. için belirli bir prob türetilmiştir coli (27.04 Ct). Bir S. tanımlama aureus-enfekte kan kültürü Şekil 2B 'de gösterilmiştir. 16S evrensel prob 33.35 ve 33.71 amplifikasyonu sinyalleri vardır. Kalan iki sinyalleri Staphylococcus spp için özel problar türetilmiştir. ve S. aureus (32.48 ve 30.59 Ct).

protokolünün birinci bölümü sonra etken mikroorganizmanın bilinmektedir ve antimikrobiyal profili tespit edilebilir. Şekil 3 de gösterilmiştir E.coli strain temsil eden bir antibiyotik duyarlılık testi amplifikasyon plot, örnek olarak Şekil 2A. Her bir hat bakteriyel örnek ile inkübe edildi olduğu bir antibiyotik temsil eder. Düşük bir Ct değeri ile bir örnek büyüme test antibiyotik için bir antibiyotik, direnç gösteren varlığında oluştu olduğu bir örnektir. Tersine, bir yüksek CT değeri, herhangi bir gelişme, çünkü test antibiyotiğe antibiyotik, hassasiyet gösteren etkili bir çalışma ile meydana gelmiş olan bir örneği gösterir. Tablo 1, E. antimikrobiyal profilini gösterir belirlenmesi coli ve S. aureus izolatlarının. Tüm Ct değerlerini bildirdi ve protokol metni (7.1) 'de belirtilen formülleri kullanarak, iki kesme Ct değerlerini hesaplanan vardır edilirdirenç ve duyarlılık ayırt yonunun. Bildirilen CT değeri hesaplanmıştır cut-off CT değeri (ya da tam tersi) 'den daha düşük olması durumunda deformasyon antibiyotiğe dirençli.

RDNA PCR gerçek zamanlı 16S kullanarak patojen tanımlanması ve antibiyotik duyarlılık testi prosedürü Şekil 1. Akış çizelgesi.

Şekil 2 Tanımlama testi:. Amplifikasyon araziler ve döngüsü eşik değerleri (Ct değerleri) spesifik problar nedensel patojenin tanımlanması için kullanılan ise pozitif kan kültürü, evrensel 16S rDNA sensörü tarafından algılanır.. Kan kültürü A. amplifikasyonu arsa E. içeren coli, S. içeren kan kültüründe B. amplifikasyonu arsa aureus; Pseu ae, Pseudomonaeruginosa gibi; uni, 16S evrensel probu; ecoli, Escherichia coli probu; Pseu sp, Pseudomonas spp. probu; S. pneumoniae, Streptococcus pneumoniae probu; Strep sp, Streptococcus spp. probu; Entero, Enterococcus spp. probu; S. aureus, Staphylococcus aureus probu; Staph sp, Staphylococcus spp. prob.

Bir E. antibiyotik duyarlılık testi Şekil 3. Amplifikasyon arsa coli (örnek 1) izole eder. Her eğrisi şekil değiştirme ile inkübe edildi olduğu bir antibiyotik temsil eder. Erken bir sinyal suşu test antibiyotik varlığında büyümüş ve antibiyotiğe dirençli ve böylece anlamına gelir yüksek bir bakteri yükü, kaynaklanır. Geç sinyalleri suşu antibiyotik varlığında yetiştirilen olmadığını göstermektedir, diğer bir deyişle, bu hassastır.

Örnek 1: E. coli			Örnek 2: S. aureus
AST	Ct	R / S	AST	Ct	R / S
Amoksisilin 8 mg / L	16,83	R	Amoksisilin 0.25 mg / L	21,03	R
Amoksisilin-klavulanat 8/4 mg / L	17,36	R	Oksasilin 2 mg / L	25,80	S
Piperasilin 16 mg / L	16,67	R	Vankomisin 2 mg / L	25,20	S
Piperasilin-tazobaktama 16 /4 mg / L	24,15	S	Gentamisin 4 mg / L	25,86	S
Ciprofloxacin 1 mg / L	29,72	S	Trimetoprim-sulfametoksazol 2/38 mg / L	24,62	S
Seftazidim 1 mg / L	24,03	S
Seftazidim 8 mg / L	26,58	S
Gentamisin 4 mg / L	29,83	S
Trimetoprim-sulfametoksazol 2/38 mg / L	27,60	S
Negatif büyüme kontrolü (antibiyotik karışımı)	30,41		Negatif büyüme kontrolü (örnek 4 ° C'de saklanır)	27,42
Pozitif büyüme kontrolü	16,90		Pozitif büyüme kontrolü	20,22
Cut-off Ct-değeri 1 *	21,76		Cut-off Ct-değeri 1 ***	23,82
Cut-off değeri Ct-2 **	18,75		Cut-off Ct-değeri 2 ****	22,02
* Amoksisilin, amoksisilin-klavulanat, siprofloksasin, gentamic içintrimetoprim-sulfametoksazol, içinde ** Piperasilin, piperasilin-tazobaktama, seftazidim için			Vankomisin ve gentamisin için *** **** Amoksisilin, oksasilin ve trimetoprim-sulfametoksazol için

Tablo 1. İki örnek (E.coli ve S.aureus) antibiyotik duyarlılık testi belirlenmesi. PCR testinin Ct değerleri otomatik olarak protokol metninde gösterilen formüller kullanılarak, pozitif ve negatif büyüme kontrolü gelen iki kesim Ct alues ​​hesaplar hangi olarak, bu excel dosyası kopyalandı. Bir antibiyotik cut-off Ct değerinden daha düşük bir değere Ct gösterirse CT değeri cut-off 'den daha yüksek ise, suşu, antibiyotiğe dirençli, strain hassastır.

Tartışmalar

Burada açıklanan protokol patojenlerin hızlı bir şekilde tespit sağlar ve böylece kan akımı enfeksiyonu olan hastaların prognozu iyileştirmek yeterli antibiyotik erken verilmesinin yol açabilecek fonksiyonel bir antimikrobiyal profili sunmaktadır. Bir test talep koşullarına bağlı olarak, az yani düşük maliyet, yüksek verim, geri-dönüş süresi, test koşulları ayarlanabilir. Tüm bu işlemleri bir iş günü içinde yapılabilir. Dahası, protokol, iki parça önemli ölçüde dönüş süresine azaltır, eş zamanlı olarak gerçekleştirilebilmektedir. Burada sunulan gibi, tanımlama paneli hastanemizde klinik olarak en uygun bakteri bir seçimdir. Temel ilkesi 16S geninin hedef bölgede olduğundan, diğer mikroorganizmalar için özel olarak tasarlanmış probları ile tahlil eklenebilir. Tüm deney başlangıçta kan kültürlerinin hızlı analiz için amaçlanmıştır, fakat, aynı zamanda o işlenmesi için de kullanılabilirtermal örnek malzemeleri. Bu aynı zamanda antibiyotik duyarlılık testi için kullanılan antibiyotikler için böyledir: Daha fazla veya diğer antibiyotikleri yerel direniş kalıpları ve yönergelere göre eklenebilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Sodyum Klorür (NaCI)	Merck Kimyasallar	106404	Su içinde% 0.9
Vacutainer SST Serum ayrıştırıcı tüp 5 ml	BD Diagnostic Systems	367986
Mueller Hinton II broth	BD Diagnostic Dystems	212322	44 g / L su içinde
Rotixa 50 rs santrifüjleyin	Andreas Hettich GmbH & Co KG	4910
5415 D Santrifüj	Eppendorf	Durduruldu
Astarlar	Sigma-Aldrich	na
Probları	Sigma-Aldrich/Applied Biyosistem	na
TaqManEnvironmental master miks 2.0	Applied Biosystems	4396838
iQ SYBRGreen Supermix	Bio-Rad Laboratories BV	170-8880
Mikroamper Optik 96-Well Reaksiyon Plaka	Applied Biosystems	N8010560
Mikroamper Optik Yapıştırıcı Film	Applied Biosystems	4311971
iQ 96-Well PCR Tabaklar	Bio-Rad Laboratories BV	223-9441
Microseal B Yapıştırıcı Contalar	Bio-Rad İşçiatories BV	MSB-1001
Real-time PCR Algılama Sistemi	Applied Biosystems	ABI PRISM 7900HT
Real-Time PCR Algılama Sistemi	Bio-Rad Laboratories BV	MyiQ Tek Renk