Embriyonik Farelerde damarları Etiketleme Bir Yöntem

Özet

Bu makale, embriyonik deri ve timüs kan damarlarının etiketlenmesine yönelik bir yöntem açıklanmaktadır.

Özet

Fonksiyonel bir damar ağının kurulması organogenez önemli bir parçası olduğunu ve optimal organ fonksiyonları için gereklidir. Örneğin, timüs uygun damar oluşumu ve dokusunda organ ve çevre için olgun T-hücresi çıkışında içine timosit giriş için gereklidir. Timus kan damarlarının mekansal düzenleme yerel mikroçevrede, yani timik epitel hücreleri (TEC) gelen sinyalleri bağlıdır. Birkaç yeni raporlar timus damar kusurları ^1,2 bu sinyallerin sonuçları bu bozulma göstermektedir. Önceki çalışmalarda yenidoğan ve yetişkin timus damar ^1,2 etiketlemek için kullanılan teknikler tarif var. Biz burada embriyonik timus kan damarlarının etiketlenmesine yönelik bir tekniği göstermek. Yüz damar enjeksiyonu ve CD31 antikor boyama timüs va tespit etmek - bu yöntem simplicifolia lektin I (isolectin B ₄ GSL 1) FITC-dekstran ya da Griffonia (Bandeiraea) kullanılması birleştirirscular yapıları ve PDGFR-β timik perivasküler mezenşimi ^3-5 etiketlemek için. Cryosections veya vibratome bölümleri kullanma seçeneği de sağlanır. Bu protokol, timüs kan damarı oluşumuna TEC-türetilen molekülleri rollerin tanımlanması için kritik olan timus damar bozuklukları, belirlemek için kullanılabilir. Yöntemi, tüm damar etiket olarak, aynı zamanda deri ve kalp ^6-10 içeren embriyo boyunca birden fazla organ ve dokularda damar ağları analiz etmek için de kullanılabilir.

Protokol

1. Flöresein dekstran ve GSL I-isolectin B ₄ yüz ven enjeksiyonlar embriyonik damar etiketlemek için etiketlenmiş

1. Fosfat içinde FITC-dekstran (50ug/mL) hazırlayın Tamponlu Tuz (PBS) veya GSL 1 - isolectin B, bir 1,5 mL Eppendorf tüpü içinde PBS içinde ₄ (20ug/200uL) ve 37 ° C'de sıcak Yeşil / PBS GSL 1. Yeşil / PBS FITC-Dekstran solüsyonunun (toplam hacmi 1 ml) ve stok 1.25mm Fast 180uL stok 1.25mm Fast 100ul Ekle - isolectin çözümdür böylece B ₄ (toplam hacim 200ul), gözle görülür mavi.
2. Allantoik sapı (umblikal arter ve ven) zedelemeden, birlikte E14.5-E18.5 embriyo ve yolk kesesi teşrih.
3. Yeni bir Petrie tabak (60 X 15 mm) kadar embriyo transferi ve oda sıcaklığında PBS içinde sokmaktan.
4. Baş / yüzün sagittal bir görünüm sağlamak için embriyo yerleştirin. Yavaşça başında embriyo kavramak için mikro diseksiyon forseps kullanın.
5. Bir 30G iğne kullanarak, 50uL FITC-dekstran (50ug/mL) veya GSL enjekte1 - isolectin başın arkasına doğru iğne işaret fasiyal vene B ₄ (200ul PBS 20ug).
6. Boya umbilikal ven görünür olduğunda, iğne kaldırmak ve allantoik sapı (umbilikal arter ve ven) gelen embriyo ayırın.
7. Enjeksiyonu takiben, embriyo boya dolaşır embriyo böylece 2-3 dakika için oda sıcaklığında PBS içinde kalmasını sağlamaktadır.

2. Deri vaskülatürü Tüm montaj analizi

1. Boya embriyo boyunca dolaşmaya izin verdikten sonra, sırt, bacakların bölgelerinden alınan deri örnekleri kaldırmak ve mide, vb ^8,9.
2. Soğuk PBS içinde deri örneği yıkayın ve 2 saat ^8,9 için% 4 PFA / PBS düzeltin. 10 dakika 2mL soğuk PBS ile 4 mL berrak flakonda her biri için 3 kere yıkayın.
3. Bir mikroskop yerleştirin deri örneği her slayt ve kapak cam montaj medya 100 ul kaydırın ve ekleyin.
4. Slaytlar karanlık bir depolama alanında kurumasını bekleyin.
5. P2 'Image Acquisition' bölümüne Adım roceed.

3. Timus ve kalp damar ve cryosections için perivasküler hücrelerin Çok renkli etiketleme (Bölüm 1, Adım 7 Devam)

1. Sıvı azot 'Flaş don' bütün embriyo. Embriyolar olması ve -80 ° C'de analize kadar saklanır olabilir.
2. Alternatif olarak, timus dışarı incelemek 4 ° C'de PBS ile yıkanır ve 2 saat boyunca 2mL% 4 paraformaldehit (PFA) / PBS içinde çözmek. -80 Kullanıma kadar soğuk PBS, OCT yer thymi ve dondurma ve mağaza ile 10 dakika boyunca 3 kez yıkayın ° C
3. Cryosectioning için bir bölüm 'blok' üzerinde Ekim yaymak ve kesit için embriyo veya disseke organ / dokuların monte.
4. 10 mikron kalınlığında kesitler halinde dondurulmuş doku Kes ve slaytlar üzerinde toplamak.
5. 5-10 dakika aseton bölümler düzeltildi. Soğuk TBS içinde 3 kere yıkayın.
6. Oda sıcaklığında bir nem odası içinde% 10 eşek serum / TBS içinde engelleme.
7. Primer 100 ul ile 1 saatlik gecede için bölümler inkübe4 bir nem odası antikorlar ° C: Bu örnekte, biz etiket endotele Sıçan anti-fare CD31 (1:100) ve keçi anti-fare perivasküler hücreler etiketlemek için PDGFR-β (1:100) kullanın. Bu antikor düzgün bölümüne yayılmış olduğundan emin olmak için ayrı ayrı kesilmiş Parafilm şeritler ile slaytlar karşılamak için yararlıdır.
8. Primer antikor ile inkübasyondan sonra, soğuk TBS bölümler 3 kere yıkayın. En az 30 dakika için uygun sekonder antikor 100 ul ile inkübe edin.
9. Soğuk TBS içinde 3 kere yıkayın. Her slayt ve kapak cam montaj medya 100 ul ekleyin.
10. Slaytlar karanlık bir depolama alanında kurumasını bekleyin.
11. 'Image Acquisition' bölümüne geçin.

4. Timus ve damarsal vibratome bölümleri için perivasküler hücrelerin Çok renkli etiketleme (Bölüm 1, Adım 7 Devam)

1. Embriyodan timus lobları dışarı inceleyin ve soğuk PBS içinde yıkayın.
2. 2 saat için oda sıcaklığında% 4 PFA / PBS içinde timus saptamaks.
3. PBS-Triton X (0.15%) 3 kez, 10 dakika ve erime düşük 4% küçük bir plastik kartuş ve batığın yerini thymi yıkayın agaroz / PBS (~ 4 ° C). Timus kartuşun dibi ile temas halinde olmalıdır.
4. Agaroz buz (3-5 dakika) katılaşmaya bırakın. Aşırı agaroz kesmek için jilet kullanın. Vibratome blok tutkal ekleyin ve blok numune uygun.
5. Örnek ve bıçak batırılır kadar vibratome su banyosuna soğuk PBS ekleyin.
6. Hız ve genlik (yüksek genlikli ve düşük-orta hızda yumuşak timus bölümleri için idealdir) ayarlayın. Bölümlerde aşırı ajitasyon nedeniyle break up genliği azaltılmalıdır.
7. 50 um bölümleri kesiniz.
8. Bir fırça kullanarak, soğuk PBS içinde 24-kuyu mikroplak bölümler toplamak.
9. 30 dakika boyunca PBS-Triton X (% 0.15) içinde% 10 eşek serum ve 500 ul içinde blok bölümleri.
10. Bu tür anti-CD31 ve anti-PDGFR-β gibi birincil antikor ile bir gece 8 saat için bölümler için, inkübe, Kapalı bir 24-çukurlu bir mikrolevhadaki.
11. 4 ° C'de 8 saatlik bir toplam boyunca PBS-Triton X (% 0.15) içinde 3 kere yıkayın
12. 30 dakika boyunca PBS-Triton X (% 0.15) içinde% 10 eşek serum içinde blok bölümleri.
13. 8 saat bölümler inkübe 4 gecede ° C uygun ikincil antikor ile.
14. 4 ° C'de 8 saatlik bir toplam boyunca PBS-Triton X (% 0.15) içinde 3 kere yıkayın
15. Re-fix örneklerinde% 4 PFA / buz üzerinde 30 dakika süreyle PBS.
16. Buz üzerinde 30 dakika PBS-Triton X (0.15%) 3 kez yıkayın.
17. % 25 MeOH,% 50 MeOH,% 75 MeOH, ve her adım için 10 dakika sonra% 100 MeOH: bir aşamalı MeOH / PBS-Triton X dizi örnekleri kurutmak. 10 dakika sonra taze MeOH ile% 100 MeOH değiştirin ve oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edilir.
18. Bir cam kapta, mix Babb (Benzil Alkol: Benzil Benzoat) 1:2 oranında. Babb% 50 ve% 50 MeOH bir nihai konsantrasyon için MeOH ile Babb birleştirin. 10-15 dakika MeOH: Babb örnek inkübe edin.
19. Transferi sa10-15 dakika için% 100 Babb ve inkübe ile bir cam kap için mple veya kadar oda sıcaklığında, temizlenir.
20. Tarafı taze% 100 Babb ve transfer örneği ile depresyon slayt (0.7mm derinlik) doldurun. Cam (No 1.5) kapak ve oje 2-3 kat ile mühür ekleyin. Oda sıcaklığında karanlıkta sertleşmesine oje bırakın ve daha sonra 4 ° C'de örnek saklamak
    Not: Slaytlar tamamen konfokal görüntü alımı öncesinde kapatılmalıdır. Floresan boyalar Babb fade gibi Görüntüler, 12-24 saat içinde satın alınmalıdır.
21. 'Image Acquisition' bölümüne geçin.

5. Görüntü edinimi

1. Görüntü 10 488 ile Plan-Apochromat 20X/0.8 nesnel (512 X 512 piksel) kullanarak bir konfokal mikroskop ile mikron frozen - (FITC-dextran/GSL 1 - B ₄ isolectin), 543 - ve 633-nm lazer çizgiler.
2. Plan-Apochroma kullanarak bütün montaj cilt ve 50 mikron agaroz-gömülü kesitlerin konfokal z bölümler Edinme t 10X/0.4 488 ile nesnel (512 X 512 piksel) - (FITC-dextran/GSL 1 - B ₄ isolectin), 543 - ve 633-nm lazer çizgiler. Seri Z bölümleri ilgili her kanal için 1 mikron sıralı olarak toplanmalıdır.
3. Seri Yeniden İnşa Zeiss Axiovision 4.6 ya da diğer görüntü analiz yazılımı kullanılarak Z-bölümler.

6. Temsilcisi Sonuçlar:

Embriyonik damar Verimli etiketleme embriyonik farelerde kan damarı kusurları değerlendirmek için önemlidir. Şekil 1, sırasıyla sağ ve sol ventrikül (1E-F) arasında boyama ek olarak, özel E16.5 timüs kan damarlarının etiketleme (1A-B) ve CD31 (1B) ile birlikte etiketleme, göstermektedir. Gibi bölümlere 1, 3 içinde belirtilen cryosections ve 5 için GSL I-isolectin B ₄ protokol bu deneylerde kullanılmıştır. Bütün monte edilir, E16.5 fareler üzerinde cilt kan damar ağının bölümleri etiketleme 1, 2 içerisinde tarif edilen protokoller kullanılarak, ve 5, şekil 1C-B 'de gösterilmiştir.

ntent ">
1. Legend Şekil. FITC GSL I - E16.5 fare embriyolarına isolectin B ₄ yüz ven enjeksiyonlar. embriyonik kalp e enjeksiyonu takiben embriyonik Timus bir. Cryosection. b. isolectin B ₄ CD31 ko-etiketleme Birleştirme. c. ve d. embriyonik deri vaskülatürü aşağıdaki enjeksiyon Tüm montaj. e. ve f. Cryosection. (sağ ventrikül) f. (sol ventrikül) aşağıdaki enjeksiyon.

Tartışmalar

Bölümlerde Tüm-mount ve PECAM-1 (CD31) boyama embriyonik farelerde damar etiketleme için geleneksel yöntemler vardır. Bu yöntemler doğrudan ve / veya dolaylı immunfloresan ve deterjan kullanımı fare doku geçirgenliği gerektirir. Bu oldukça zamanında süreç olduğunu kanıtlıyor. Burada, FITC-dekstran ya isolectin B ₄ yüz damar enjeksiyonu doğrudan böylece antikor etiketleme adımlar için ihtiyacı ortadan kaldırarak, embriyonik damar etiketlemek için istihdam var. 'Sızdıran' f...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası
FITC-dekstran	Sigma	FD150S-1G
Flöresein GSL 1 etiketli - B 4 isolectin	Vektör Laboratuvarları	FL-1201
Fast Green	MP Biomedicals	195178
PFA	Fluka	76240
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biyolojik	S11550
Optimal Kesme Sıcaklık Bileşik (OCT	VWR	25608-930
Aseton	JT Baker	9006-33
Eşek Serum	Jackson	017-000-121
Sıçan anti-fare CD31,	BD Pharmingen	558736
keçi anti-fare PDGFR-β	R & D Systems	AF1042
eşek anti-fare CD31 Alexa 647 (Invitrogen)	Biolegend	102516
eşek anti-keçi Alexa 594 (Invitrogen)	Invitrogen	A11058
Triton X -100	Sigma-Aldrich	X-100
Düşük erime agaroz / PBS	Sigma-Aldrich	A9414-25G
Metanol	Fisher Scientific	A413-4
Benzil Alkol	Acros Bilimsel	148390010
Benzil Benzoat	Acros Bilimsel	105860010
Depresyon slaytlar	Fisher Scientific	S175201
Fluorogel	Elektron Mikroskopi Bilimleri	17985-10
Cam (22x22) -1.5 Kapak	Termo Scientific	152222
Zeiss LSM 510 Meta Konfokal Mikroskop	Zeiss
Mikro diseksiyon forseps	Roboz	RS-5135
Parafilm No OM992	Fisher Scientific	13-374-16
12 ve 24 de mikroplaklar	Evergreen Bilimsel	222-8044-01F
Superfrost / Artı Mikroskop Slaytlar	Fisher Scientific	12-550-15
4 mL berrak şişeleri	Ulusal Bilimsel	B7800-2