Küçük Molekül İndüksiyon Pluripotent İnsan Embriyonik Kök Hücreleri İnsan Nöronal atalarıdır ve Nöronlar Verimli türetilmesi

Özet

Biz insan nöronal atalarıdır ve sinir onarımı için gelişmekte olan MSS nöronal hücre tipleri büyük bir arz türetme sağlayan küçük moleküller ile tanımlanan koşullar altında tutulan pluripotent insan embriyonik kök hücreleri doğrudan neuroblasts indüksiyonu için bir protokol kurduk.

Özet

Onarım veya rejenerasyon hasarlı santral sinir sistemi (MSS) yapısı ve günümüz sağlık sektöründe devresi için klinik olarak uygun insan nöronal hücre kaynağı için büyük bir karşılanmamış ihtiyaç vardır. Hücre bazlı tedaviler CNS rahatsızlıkları için kayıp bir sinir dokusu ve işlevi geri yüklemek için büyük umutlar tutun. Ancak, MSS elde edilen sinir kök hücreleri üzerinde hücre tedavileri arz kısıtlaması ve klinik ortamda kullanılmak üzere sınırlı genişleme yeteneği, geniş ^{Pasajlanması} 1-3 sonra kültür ve başarısız plastisite nedeniyle zorluk yaşadık . CNS-kökenli insan sinir kök hücrelerinin (hNSCs) bazı yararlı sonuçlara rağmen, trofik ve nöroprotektif molekülleri ile endojen hücreler ^1-3 kurtarmak için öncelikle bunların non-nöronal yavrularıyla terapötik etkiler görünmektedir. Alternatif olarak, nörolojik bozukluklar supplyin geniş bir yelpazede pluripotent insan embriyonik kök hücreleri (hESC) teklif tedavilerig rejenerasyon ^1,4-7 için gelişmekte olan MSS insan nöronal hücre tiplerinin çeşitliliği. Ancak, istenen bir fenotip pluripotent hESC geniş bir farklılaşma potansiyelinin verimli ve öngörülebilir bir kanal nasıl gelişim çalışma ve klinik çeviri için önemli bir sorun olmuştur. Geleneksel yaklaşımlar genellikle fenotipik heterojenite ve istikrarsızlık, dolayısıyla Tümör Gelişimi ^7-10 riski yüksek takip verimsiz ve kontrol edilemeyen bir soy-taahhüt, pluripotent hücrelerin spontan germ tabakası farklılaşma ile çok soyundan eğim güveniyor . Buna ek olarak, tanımsız / yabancı hayvan biyolojik takviyeleri ve / veya ^11-13 sorunlu hastalarda hücre uzman greftler genellikle izolasyon, genişleme ve farklılaşma hESC için kullanılan besleyiciler doğrudan yararlanabilirler. Bu engelleri aşmak için, biz gerekli ve yeterli s için belirli bir kültür sistemi elemanları çözmüşhESC epiblast pluripotence ustaining klinik uygun hESC de novo türetme için bir platform olarak hizmet veren ve etkili bir şekilde küçük moleküller ¹⁴ (Şekil şematik bir bakın 1) tarafından klinik olarak ilgili soy doğru düzgün gibi hESC yönetmenlik. Retinoik asit (RA), ^{bakımı, besleyiciler 1,} 14 farklılaşmamış hESC nöronal farklılaşma yol açmaz. Ve fare EKH aksine, sadece biraz hESC diferansiye embriyoid organları (EBS) tedavisinde nöronlar ^{1, 14, 15} düşük verim artar. Ancak, küçük moleküller ve büyüme faktörleri çeşitli tarama sonrasında, söz konusu tanımlanmış koşullar retinoik asit (RA), daha fazla insan nöronal atalarıdır ve nöronların neuroblasts ilerledikçe pluripotent hESC doğrudan neuroectoderm belirlenmesine ikna etmek için yeterli hale bulundu yüksek verimlilik ile gelişmekte olan santral sinir sistemi (Şekil 2) . Biz nöro indüksiyonu için koşulları tanımlanmışpluripotent hESC insan nöronal hücrelerin hücre tabanlı tedavi için gelişim evreleri yelpazesinde büyük bir arz-kontrollü verimli türetme sağlayan bir multi-dizi embriyoid vücut sahne olmadan, doğrudan patlamalar.

Protokol

1. Çözüm ve Medya Hazırlık

1. Jelatin kaplama çözümü:% 0.1 (w / v) 4 GKD ₂ O, otoklava jelatin ve mağaza ° C
2. Matrigel kaplama çözümleri. Stok çözelti: 4 ° C gecede, 10 ml buz DMEM veya DMEM/F12 ekleyin, iyice karıştırın ve kısım 1 ml / tüp, steril doku kültürü kaputu altında -20 mağaza ° C. yavaş çözülme Matrigel (10 ml) Çalışma çözüm: yavaş çözülme 1 ml Matrigel kısım, 4 ° C 14 ml soğutulmuş DMEM veya DMEM/F12 1-2 saat, transferi ve kaplama hemen önce steril doku kültürü başlık altında iyice karıştırın.
3. İnsan laminin kaplama çözümü: seyreltik 1 ml insan laminin çözüm buz DMEM veya DMEM/F12 için (Tris 0.5 mg / ml -80 mağaza, NaCl Tamponlu ° C, 1-2 saat 4 ° C yavaş çözülme) 12.5 ml çalışma solüsyonu (40 mg / ml) steril doku kültürü başlık altında yer kaplama hemen önce.
4. Büyüme faktörü stok solüsyonları (500-1000X): 10 mg büyüme faktörü çözülürSteril tampon / ml (% 0.5 BSA, 1.0 mM DTT,% 10 gliserol, 1XPBS) ve -80 ° C 50-100 ul / tüp alikotları olarak depolamak
5. All-trans retinoik asit solüsyonu (1000X): -80 DMSO, mağaza alikotları mM 10 ° C
6. HESC medya: DMEM/F12 veya KO-DMEM (% 80), KO, serum değişimi (% 20), L-alanyl-L-gln 'ya da L-gln (2 mM), MEM aminoasitlerin (MNAA 1X) ve β-mercaptoethanol (100 mcM), filtre edilmiş ve 4 mağaza ° C, kullanmadan önce 20 ng / ml bFGF ile desteklenebilir. Veya tanımlanan bileşenler "(KO) serum değiştirme knock out" yerine: DMEM/F12 veya KO-DMEM (% 100), L-alanyl-L-gln 'ya da L-gln (2 mM), MNAA (1X), MEM temel amino asitler (MEAA 1X) ve β-mercaptoethanol (100 mcM), filtrelenmiş ve mağaza, 4 ° C ile desteklenmiş bFGF (20 ng / ml), insan insülini (20 mg / ml), askorbik asit (50 mg / ml), insan aktivin A (50 ng / ml), insan albümin / Albumax (10 mg / ml), ve insan transferrin (8 mg / ml) Kullanmadan önce.
7. MGK medya: DMEM/F12 (% 100), N-2 supplement (1X), heparin (8 mg / ml).

2. Plakası Kaplama

1. Coat tabak-jelatin: add ml / 6 kuyucuğu jelatin çözüm 2.5 ve 37 ° C nemlendirilmiş inkübatör bir gece inkübe edin.
2. Coat laminin plakalar: chill jelatin kaplı plakalar ve jelatin kaldırmak, 2.5 ml / pre-soğuk, iyi Matrigel ya da insan laminin kaplama çalışma çözeltisi 4 ° C gecede 6 kuyucuğu ve inkübe jelatinize.

3. Tanımlanmış koşullar altında ayrım yapılmamış hESC Pasajlanması ve Yayımlamak

1. HESC kolonileri 5-7 gün eski büyümesine olanak ve diseksiyon mikroskobu (önceden sıcak sahne diseksiyon 37 ° C) sterilize kaput diseksiyon altında hESC kültür plaka almak.
2. HESC koloniler bölünebilir seçin. Morfolojik, bu koloniler tanımlanan kenar un genellikle hafif opak>% 75 farklılaşmamış hESC (küçük kompakt hücreleri), (beyaz tüylü-up hücreleri, açık diferansiye hücreler) olmalıdırdiseksiyon mikroskobu derneath. Dikkatle seçilen koloniler anahat ve P2 steril pipet ucu kenarı ile koloni veya cam kapiller çekti (varsa) koloni çevreleyen farklılaştırılmış fibroblast tabakası ve tüm farklılaşmış parçaları kaldırmak. (Lütfen dikkat, pluripotent hESC diseksiyon mikroskobu altında% 100 farklılaşmamış tercih olsa da, bu tespit tezler hücrelerin zor bulunuyor, en uygun koşulları altında bile kendiliğinden farklılaşma geçmesi, bir geçici aşama olan>% 75 farklılaşmamış genellikle geçiş noktası olarak kabul edilir. farklılaşmış hücreleri genellikle tohum ve Pasajlanması süreci ortadan kaldırıldı, büyümeye devam)
3. Aspire kayan müstakil farklılaşmış hücre içeren eski medya çıkarın. Bir kez hESC medya (bFGF olmadan) ile yıkayın. Ekle / 3 ml 20 ng / ml bFGF içeren taze hESC medya.
4. Farklılaşmamış hESC koloniler küçük parçalar halinde kesin, ve steril pipet veya kapiller çekti cam ile ayırmak.
5. 50 ml konik boru birlikte müstakil koloni parçaları içeren medya Havuzu. 1 ml / birlikte 20 ng / ml bFGF ve havuz içeren iyi hESC medya plaka ile bir kez yıkayın.
6. Taze kaplı plakalar Matrigel veya insan laminin çözüm aspire. 6 plaka koloni parçaları içeren kısım 4 ml / kuyu hESC medya. Hafifçe sallayarak inkübatör plaka transfer _ve% 5 CO2 atmosferi ile nemlendirilmiş bir 37 ° C inkübatör bozmadan koloni adet tohum gecede izin.

4. Retinoik Asit ile Tanımlanmış Kültür Sistem altında hESC Sinir İndüksiyon

1. Tohumlama sonra 3. günde, plakanın her kuyudan en eski medya kaldırmak ve hESC koloniler (hESC dışarı kuru asla izin) sokulmasına izin verecek kadar medya bırakın. 20 ng / ml bFGF ve 10 mcM retinoik asit içeren 4 / ml taze hESC medya ile değiştirin.
2. 20 ng / ml bFGF ve taze hESC içeren medya eski medya değiştirin.10 mcM her gün retinoik asit, sinir indüklenen hESC koloniler 7 veya 8 gün büyümeye izin verir. Koloni içinde tüm hücreler çoğalmaya devam edecek büyük bir farklılaşmış hücre morfoloji değişiklikleri uğrayacaktır. Koloniler Gün 7 veya 8 plaka kapağı boyutu artacak ve hücreleri bazı alanlarda koloniler yığmak başlayacak.

5. Süspansiyon Kültürü Sürekli Nöronal Farklılaşma

1. HESC kültür plakasına diseksiyon sterilize kaput altında mikroskop diseksiyon (ön-sıcak sahne diseksiyon 37 ° C) alın. Koloniler dikkatle anahat ve P2 steril pipet ucu kenarı ile koloni çevreleyen fibroblast tabakası (farklılaşmış hücrelerin koloni göç) kaldırmak veya cam kapiller çekti.
2. Aspire kayan müstakil fibroblast hücreleri içeren eski medya çıkarın. Bir kez hESC medya (bFGF olmadan) ile yıkayın. 3 ml / iyi taze hESC medya (bFGF olmadan) ekleyin.
3. Kes sinir-induced hESC, küçük parçalar halinde koloniler ve steril pipet ucu ile ayırmak ya da cam kapiller çekti.
4. 50 ml konik boru birlikte müstakil koloni parçaları içeren medya Havuzu. Plaka birlikte 1 ml / iyi hESC medya (bFGF olmadan) ve yüzme havuzu ile bir kez yıkayın.
5. Kısım 4 ml / 37 6-kuyu, ultra eklenti plaka ve inkübe koloni adet içeren serum serbest hESC medya ° C nemlendirilmiş inkübatör, yüzen hücre kümeleri (neuroblasts) 4-5 gün boyunca oluşturmak için izin vermek.

6. Yapıştırıcı Kültür Nöronal Fenotip Olgunlaşma

1. 50 ml konik bir tüp içinde yüzen neuroblasts bir arada içeren medya Havuzu. 1400 devirde 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Mümkün olduğu kadar çok eski medya aspire ve VEGF (20 ng / ml), NT-3 (10 ng / ml), BDNF (10 ng / ml) içeren taze MGK medya eşit miktarda ekleyebilirsiniz.
2. 4 ml / 6 kuyucuğu kayan neuroblasts ve kısım karıştırmak için pipet ve aşağı yukarı. Neuroblasts da selaminin / kollajen (Matrigel) ya da insan laminin polimerize VEGF (20 ng / ml), NT-3 (10 ng / ml), BDNF (10 ng / ml) içeren serum serbest MGK medya 3-boyutlu bir matris içinde eded . 37 plakalar transfer ° C nemlendirilmiş inkübatör neuroblasts gecede takmak için izin verecek.
3. MGK medya içeren VEGF (20 ng / ml), NT-3 (10 ng / ml), BDNF (10 ng / ml) her gün değiştirin. Neurite taşıyan nöron hücreleri ve pigment hücreleri geniş ağlar sürekli yetiştirme ve zamanla sayıları artış 2 hafta içinde ortaya çıkmaya başlar ve 3 ay boyunca sürekli olabilir.

7. Temsilcisi Sonuçlar:

Retinoik asit (RA), özel bir nöroektodermal fenotip (Şekil 2A) pluripotency geçiş için belirlenen kültür sistemi muhafaza hESC neden için yeterli oluşturulur . RA farklılaşmamış hESC maruz kalması üzerine, koloninin içindeki tüm hücreleri morfoloji değişikliklerepluripotency ilişkili belirteçlerin ifade ateşkes büyük farklılaşmış hücrelerin, Ekim-4 tarafından belirtilen ve çeşitli neuroectoderm ilişkili gibi HNK1 gibi belirteçler, AP2 ve TrkC (Şekil 2B) ifade başlamak. Bu büyük farklılaşmış hücreler çoğalmaya devam edecek ve koloniler erken nöronal belirteç β-III-tubulin (Şekil 2B) ifade etmek için kendiliğinden geçmeden, boyutu artacak. Daha olgun nöronal belirteç Harita-2 hücreleri (Şekil 2B) yığılı kolonilerin alanlarında belirmeye başlar. Nöroektodermal hücreleri ve nöronal farklılaşma görünümünü tesadüf, tirozin hidroksilaz (TH) geninin ¹⁶ dopaminerjik nöron farklılaşması ve aktivasyonu nöronal karıştığı özel transkripsiyonel faktörü Nurr1, çekirdeği (Şekil 2B) yerini değiştirmek. Müstakil sonra, RA tedavi hESC bir süspansiyon kült kayan hücre kümeleri (neuroblasts) oluşturacaknöral farklılaşma sürecinin devam etmesi ure. BFGF, ve neuroblasts, ß-III-tubulin ve Harita-2-ifade, neurite serum serbest tanımlanmış orta bir laminin / kollajen polimerize 3-boyutlu bir matris numaralı seribaşı doku kültürü plakası veya eklemek için izin sonra kaldırılması üzerine taşıyan hücreleri ve pigment hücreleri, aynı süre içinde tedaviye gerek kalmadan hESC spontan çok soyundan farklılaşma ile karşılaştırıldığında ciddi bir verimlilik artışı ile görünmesini başlayacak ve 3 ay boyunca (Şekil 2C) için sürekli olabilir .

Şekil 1'de şematik insan pluripotent kök hücrelerin sadece küçük moleküllerin basit bir hükmün belirli bir klinik ile ilgili soy iyi kontrollü verimli indüksiyon .

Şekil 2 Retinoik asit, sinir soy özellikleri ve tanımlanmış koşullar altında pluripotency doğrudan nöronal ilerlemesi neden olur. (A) hESC yönlendirilmiş nöronal farklılaşma protokol zaman çizgisi resmeden şematik . (B) tanımlanan kültür sistemi altında retinoik asit (RA) farklılaşmamış hESC maruz kalması üzerine, büyük Ekim-4 farklılaştırılmış koloni içinde (kırmızı) negatif hücrelerin kontrol mock-tedavi (DMSO) hESC göre, ortaya çıkmaya başladı . RA-bağlı Eki-4-negatif farklılaşmış hücreler ifade HNK-1 (kırmızı), AP2 (kırmızı), TrkC (yeşil) başladı ve sonra β-III-tubulin (kırmızı), erken nöroektodermal farklılaşma ile tutarlı. Bu hücreler, eninde sonunda, genellikle hücrelerin yığmak başladı alanlarda nöronal belirteç Haritası-2 (yeşil), ifade olgun devam etti. Nöroektodermal hücreleri ve nöronal farklılaşma görünümünü tesadüf, nöronal özel transkripsiyonel faktörü Nurr1 (yeşil), sorumludopaminerjik nöronal farklılaşma ve tirozin hidroksilaz (TH) gen aktivasyonu, çekirdeğin transloke. Tüm hücreler kendi çekirdeğinin DAPI boyama (mavi) ile gösterilir. (C) RA tedavisinde β-III-tubulin (kırmızı) ve Harita-2 (3-boyutlu bir matris gösterilen yeşil) ifade neurite taşıyan hücrelerin geniş ağlar tarafından değerlendirilen, yüksek verimlilik ile nöronal soy doğru farklılaşma neden olur . Oklar MSS tipik pigmentli hücreleri gösterir. Tüm hücreler DAPI parçalar kendi çekirdekleri boyama (mavi) ile gösterilir. Ölçek çubuklar: 0.1 mm.

Tartışmalar

Gelişimsel çalışma ve klinik çeviri için en büyük zorluklardan biri, verimli ve öngörülebilir bir insan pluripotent kök hücrelerinin istenen bir fenotip geniş bir farklılaşma potansiyeli nasıl kanal olmuştur. Bütün germ hücrelerine in vitro olarak bu hücreleri çok soyundan agrega sahne geçiyor kendiliğinden ayırt rağmen, hücrelerin yalnızca küçük bir bölümünü belirli bir soy ^1,4 sürdürmektedirler. Bu hESC kaynaklı agrega, eş zamanlı görünümü birbirinden çok farklı üç embriyonik germ ikamet istenmeyen hücre tiplerinde önemli bir miktarı genellikle verimsiz sadece istenilen fenotipleri ortaya çıkması yapar, ancak kontrol edilemeyen ve güvenilmez olarak iyi. Ancak, kalp ve sinir soy önceki raporlar elde olmasına rağmen, pluripotent hücreler mikrop tabakası-indüksiyon ve Tümör Gelişimi yüksek risk ile özel hücreler üreten verimsizlik transplantatio aşağıdakin ileri klinik çeviri engellemiştir.

HESC hatları başlangıçta büyüme tutuklandı fare embriyonik fibroblastlar (MEFS) ⁴ ile elde edilen ve ko-kültür muhafaza edildi. HESC ^11-13, çeşitli insan besleyici, besleyici ve kimyasal formüle kültür sistemleri için geliştirilmiş olmasına rağmen, insan pluripotent hücrelerin kendini yenileme sürdürülmesi için gerekli ve yeterli elemanları çözümsüz kalır . Bu eksojen besleyici hücreleri ve biyolojik reaktifler farklılaşmamış hESC uzun vadeli istikrarlı bir büyüme maske ise pluripotent hücrelerin gelişim sinyalleri cevap yeteneğini korumaya yardımcı. Farklılaşmamış hESC sadık genişleme ve kontrol edilebilir doğrudan farklılaşma sağlayan tanımlanmış bir biyolojik-kültür sistemi bakımı, terapötik programı ve potansiyel anahtarlarından biridir. RA önceden bildirilen Condit altında tutulan farklılaşmamış hESC nöronal farklılaşma ikna etmek için yeterli değildieksojen besleyici hücreler içeren iyonları. HESC diferansiye çok soyundan agrega (embriyoid organları) RA tedavisinde, sinir soy hESC farklılaşmasında nispeten erken bir aşamada görünmesine rağmen sadece biraz nöronlar ^{1, 14, 15} düşük verim arttı. Belirli bir soydan insan pluripotent kök hücrelerinin düzgün bir dönüşüm elde etmek için, biz, sadece klinik olarak ilgili soy belirli bir pluripotent hESC iyi kontrollü verimli indüksiyonu için koşulları tanımlamak için farklılaşmamış hESC yayılması sigortalanması yeteneğine tanımlanmış bir kültür sistemi istihdam küçük moleküllerin basit bir hükmün (Şekil 1, Şekil 2) . Gelecek çalışmalar, alternatif olarak rejeneratif tedaviler için klinik ile ilgili soy kaynaklanan küçük molekül aracılı hESC pluripotent kaderini doğrudan kontrolü ve modülasyon için önünü olabilir insan santral sinir sistemi gelişiminde genetik ve epigenetik kontrolü moleküller ortaya koyacaktır. RA tedavisinde, 1-5 olmadan% HESC nöronlar ^{1, 14, 15} spontan bir farklılaşma uğrayacaktır . RA tedavi ile, insan embriyonik gelişimi ¹⁴ taklit edebilecek bir süreç tanımlamak kültürün etkisi altında muhafaza hESC>% 95 embriyonik nöronal atalarıdır ve nöronlar oluşturmak mümkün olmuştur. Son zamanlarda, genlerin belirlenmesinde bilinen sinirsel kaderi 0.5-8% ^{17, 18} kadar düşük bir verimlilik ile yetişkin sinir atalarıdır ve nöron içine fare fibroblastlar transdifferentiate kullanılmıştır. Ancak, reprogrammed somatik hücre tarihsel anormal gen ekspresyonu ve engelli terapötik yarar ^19-21 ile hızlandırılmış yaşlanması ile ilişkili olmuştur. Son olarak, burada kurulan protokol, iç hücre kütlesinden (ICM) veya insan blastosist ⁴ epiblast elde edilen pluripotent hESC sınırlı morula önceki edilen hayvansal kaynaklı EKH, EKH (sekiz dahil olmak üzere diğer pluripotent hücreler için geçerli olmayabilir -cell)-dönem embriyoların ²² ve artificially reprogrammed hücreler ^23.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktifi Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar (isteğe bağlı)
Jelâtin	Sigma	G1890
Matrigel	Biyobilim BD	356231	Düşük büyüme faktörü
İnsan laminin	Sigma	L6274
all-trans retinoik asit	Sigma	R2625
DMEM/F12	Invitrogen	10565018
DMEM	Invitrogen	31053036
DMEM-KO	Invitrogen	10829018
Knock-out serum değiştirme	Invitrogen	10828028
MEM gerekli olmayan amino asit solüsyonu (MNAA, 100X)	Invitrogen	11140050
MEM birMino asitler çözüm (MEAA, 100X)	Invitrogen	11130050
ß-mercaptoethanol	Invitrogen	21985023
Albumax	Invitrogen	11020021
Askorbik asit	Sigma	A4403
İnsan transferrin	Sigma	T8158
İnsan bFGF	PeproTech	AF-100-18B
Insan insülini	Invitrogen	12585014
İnsan aktivin A	PeproTech	120-14E
İnsan BDNF	PeproTech	AF-450-02
İnsan VEGF	PeproTech	AF-100-20
İnsan NT-3	PeproTech	450-03
Heparin	Sigma	H5284
N-2 ek (100X)	Invitrogen	17502048
6-sıra, ultra eklenti plaka	Corning	3471
6-plaka	Corning	3516