MİSYON Hedef Kimliği Kütüphane Kullanımı miRNA Hedefler için genom Ekran

Özet

Hedef Kimliği Kütüphane miRNA hedefleri belirlemek için kullanılan klonlanmış cDNA bir plazmid tabanlı, genom koleksiyondur. Burada kullanımı ve uygulama göstermektedir.

Özet

Hedef Kimliği Kütüphane mikroRNA keşif ve kimlik (miRNA) hedeflerine yardımcı olmak için tasarlanmıştır. Hedef Kimliği Kütüphane çift seçimi füzyon proteini, timidin kinaz-zeocin (TKzeo) den 3'UTR aşağı klonlanmış bir plazmid tabanlı, genom cDNA kütüphanesi olduğunu. Seçimin ilk turunda, istikrarlı transformantlar için bir ilgi miRNA tanıtımı ile takip, ve nihayet, miRNA hedefi içeren cDNAlarının için seçimi olduğunu. Seçilen cDNAlarının sıralama (Hedef Kimliği Kütüphane İş Akışı ve ayrıntılar için bkz. Şekil 1-3) ile tanımlanır.

Insan transcriptome geniş kapsama sağlamak için, Hedef Kimliği Kütüphane cDNAlarının birden fazla insan doku ve hücre hatları hazırlanan toplam RNA havuzu kullanarak oligo-dT astar ile oluşturulmuştur. 1.2 kb arasında bir ortalama boyutu olan, 0.5 ile 4 kb için cDNA aralığı çıkan ve (plazmid haritası için bakınız Şekil 4) p3TKzeo ikili seçme plasmid içine klonlandı. Li temsil gen hedefleribrary Sigma-Aldrich web sayfasında bulunabilir. Illumina sekanslama (Tablo 3), elde edilen sonuçlar, kütüphanesi UCSC RefGene içinde 21.518 eşsiz genlerin 16.922 (% 79), ya da 10 ya da daha fazla okur (% 66) ile 14.000 genler dahil olduğunu göstermektedir.

Protokol

1. Kararlı Hücre Hatları için Hedef Kimliği Kütüphane ve Seçim ile transfeksiyon

1. Zeocin kill Eğrisi

Zeocin sabit olarak transfekte edilmiş hücreleri seçmek için kullanılır. Bununla birlikte, en fazla zeocin hücre tiplerinde in arzu edilmeyen fenotipik yanıtları neden olur. Bu nedenle, bir öldürme eğrisi analizi az ölümcül bir doz kurmak için gerçekleştirilmesi gerekir.

1. Levha 1.6 x 10 ortam 120 ul içinde 96-kuyulu plakanın kuyularına ⁴ hücreleri.
2. Ertesi gün 50 ug / ml 'den 1 mg / Uygun kuyucuklara ml arasında değişen konsantrasyonlarda artan zeocin ekleyebilir.
3. 2 gün bütün canlılığı inceleyin.
4. Her 3 günde zeocin içeren medya değiştirin. İstenilen bir süre sonra tam hücre ölümüne neden olur seçimi reaktifin az konsantrasyon hücre türüne ve deney için kullanılmalıdır. Bu sonuçlar 500 ug / ml zeocin, A549 için HeLa ve MCF7 hücreleri uygun olduğunu gösterir.

2.Nucleofection ve Seçim yoluyla Kütüphane Transfeksiyon

1. Ya ifade ya da ilgi miRNA düşük seviyelerde ifade vermeyen bir hücre seçin. MiRNA sağlanır Hedef Kimliği Kütüphane kararlı ifadesinden sonra hedef seçimi için Bölüm B tanıtılacak.
2. Kültür / hücre genişletin. Biz kütüphane transfeksiyon başına 2 x 10 ⁷ hücreleri ile mükemmel sonuçlar elde edilmiştir.
3. >% 80 konfluense altındadır hücreleri Trypsinize ve 15 ml steril vida tepesinde tüplere 2 x 10 ⁷ hücre aktarın.
4. Pelet 5 dakika boyunca 200 x g'de hücreler tripsinize.
5. Orta çıkarın ve HBSS veya 1X PBS ile hücre pelletini yıkayın.
6. 5 dakika boyunca 200 xg'de santrifüjleyin ve yıkama aspire.
7. Hücre pelletini adım yıkayın tekrarlayın.
8. 37 de tam medyum 2 ml ile ön-ılık 6 oyuklu plakalar ° C.
9. Her transfeksiyon için 0.5 ml tüp başına Hedef Kimliği Kütüphanesi 2 mikrogram (10 ul geçmeyecek şekilde) ekleyin.
10. 2 x 10 hücre başına ⁶ Amaxa Nucleofection Çözelti 100 ul (hücreye spesifik) ile üstten 15 ml tüp içinde Pastör pipetiyle hücreleri. Örneğin, 10 Nucleofections için reaktif 1 ml ekleyin.
11. Her seferinde bir reaksiyon, plazmid 2 ug hücre 100 ul ilave edin. Pipet yardımıyla karıştırın.
12. Bir Nucleofector küvetine karışımı aktarın.
13. Nucleofector araç haline küvet yerleştirin ve hücre hattı (Hücre canlılığı tercih Yüksek Verimlilik) için uygun optimize programı çalıştırın.
14. Önceden ısıtılmış orta transferi pipet doldurun. Aynı pipet ve 6-iyi plaka transfer hücreler toplanır. Her Nucleofection iyi başına bir tekrarlayın.
15. Gece inkübasyon için büyüme odasına geri dönün.
16. Ertesi gün, orta ve hücreler yerine 3-5 gün süreyle geri izin verir.
17. Olarak kill eğrisi analizleri ile belirlenen zeocin uygun düzeyde içeren komple orta ile orta değiştirin.
18. Mozeocin seçimi için nitor hücreler (ölüyor).
19. 2-3 gün her zeocin orta değiştirin.
20. Bir kez 6-iyi plaka, pasaj, havuzda birleşik ve daha büyük şişeler hücre genişletin.
21. Hücrelerin genişlemesi için zamanın uzunluğu kullanıcı ve bağımlı hücre hattıdır, ama oldukça ileride tarama için cryo stokları oluşturmak için zeocin dirençli hücreleri genişletmek için tavsiye edilir (~ 2-3 hafta; hücre hattı olarak).

2. MiRNA-İfade Construct ile transfekte Kütüphane Hücreleri, Ahır Hücre Hattı için seçin ve miRNA Hedefler Seçin

Not: Zeocin seçimi artık gerekli veya arzu edilir. MiRNA ifade ve gansiklovir (hedef) seçimi sırasında zeocin hücrelerin Pozlama miRNA hedefleri kaybına neden olabilir.

3. Puromycin, G418 ve Gansiklovir kill Eğrileri

1. Yabani türü için hücreleri ile gansiklovir stabil Hedef Kimliği Kütüphane ifade ve puromycin veya G418 ile bir kill eğrisinihücreler.
2. Plaka 1,6 x 10 120 ul taze medya ile 96-plaka kuyulara ⁴ hücreler. Bir sonraki günde 0.1 ila puromycin/G418, ya da 2 olan 10 ug / ml seçilen kuyucuklara gansiklovir 32 uM kadar eklemek.
3. 2 gün bütün canlılığı inceleyin. Her 3 günde bir seçim reaktifi içeren medya değiştirin. İstenilen bir süre sonra tam hücre ölümüne neden olur * seçimi reaktifin minimum konsantrasyonu, bu hücre türüne ve deney için kullanılmalıdır. Bu sonuçlar 0,25-1 mg / ml puromycin, A549 için HeLa uygun olan, ve MCF7 hücreleri, gansiklovir 0.3 ug / ml MCF7 hücrelerin G418 ile 8-16 uM A549 için uygun olan, HeLa ve MCF7 hücreleri göstermektedir.
   
   * Not: gansiklovir seçimi ile, yavaş ya da hiç hücre büyümesi tam hücre ölümü olmaksızın görülebilir. Aktif olarak bölünmesi değildir doğrulamak için birkaç günlük tedavi boyunca hücreleri gözlemleyin. Bu durumda daha sonra ortam içinde fenol kırmızısı kırmızı kalır. Aynı zamanda, bir Ki gerçekleştirmek için gerekli olabilirduyarlılık bir değişiklik oluşursa Hedef Kimliği kütüphane ll eğrisi analizi hücreleri transfekte. Bununla birlikte, bu, bir hücre tipinde belirli bir bazında tespit edilmesi gerekir.

4. Nucleofection ve Hedef Seçimi ile miRNA Transfeksiyon

1. 2 x 10 ⁷ hücre elde etmek için Target ID Kütüphane hücre genişletin ve hücrelerinin>% 80 konfluense konusu olduğunda trypsinize / büyütün.
2. Transferi 2 15 ml steril vida x 10 ⁷ hücre 5 dakika boyunca 200 xg'de tüp ve pelet tepesinde.
3. Orta çıkarın ve HBSS veya 1X PBS ile hücre pelletini yıkayın.
4. 5 dakika boyunca 200 xg'de santrifüjleyin ve yıkama aspire.
5. Hücre pelletini adım yıkayın tekrarlayın.
6. 37, çukur başına tam medyum 2 ml ile ön-ılık 6 oyuklu plakalar ° C.
7. Her transfeksiyon için miRNA ifadesi plazmid (10 ul geçmeyecek şekilde) başına 0.5 ml tüp 2 mikrogram ekleyin. Origene mikroRNA İfade Plazmidler (Neomisin - G418 seçimi) veya pBABE-Puro (1764 Plazmid kendine klonlanmış miRNA genler; Addgene) başarıyla kullanılmaktadır. Ikincisi için, iki tarafında ~ 200 bp ile miRNA saç tokası PCR insan DNA'sı kopyalandı.
8. 2 x 10 hücre başına ⁶ Amaxa Nucleofection Çözelti 100 ul (hücreye spesifik) ile üstten 15 ml tüp içinde Pastör pipetiyle hücreleri. Örneğin: 10 Nucleofections için, reaktif 1 ml ekleyin.
9. Her seferinde bir reaksiyon, plazmid 2 ug hücre 100 ul ilave edin. Pipet yardımıyla karıştırın.
10. Bir Nucleofector küvetine karışımı aktarın.
11. Nucleofector araç haline küvet yerleştirin ve hücre hattı (hücre canlılığı tercih Yüksek verimlilik) için uygun optimize programı çalıştırın.
12. Önceden ısıtılmış orta transferi pipet doldurun. Aynı pipet ve 6-iyi plaka transfer hücreler toplanır. Her Nucleofection iyi başına bir tekrarlayın.
13. Gece inkübasyon için büyüme odasına geri dönün.
14. orta değiştirin ve hücreler 3-5 gün kurtarmak için izin verir.
15. MiRNA inşa ile transfeksiyon önce yapılan kill eğrisi testi ile belirlenen puromycin veya G418 uygun düzeyde içeren komple orta ile orta değiştirin.
16. Puromycin / G418 seçimi (hücreler ölüyor) için hücreler izleyin.
17. Puromycin / G418 her 2-3 günde bir orta değiştirin.
18. Bir kez 6-iyi plaka, pasaj, havuzda birleşik ve daha büyük şişeler hücre genişletin.
19. Hücrelerin genişlemesi için zamanın uzunluğu kullanıcıya bağlı olmakla beraber, oldukça ileride tarama için cryo stokları oluşturmak için puromycin / G418 dirençli hücre genişletmek için tavsiye edilir (~ 2-3 hafta; hücre hattı olarak).
20. Olarak miRNA inşa ile transfeksiyon önce yapılan kill eğrisi testi ile belirlenen uygun gansiklovirin düzeyleri (GCV) ve puromycin / G418, orta değiştirin.
21. Seçimi için hücreler (ölmesinden Monitörg) hedefleyen ve TK-ZEO ile devirme miRNA.
22. GCV ve puromycin / G418 varlığında hücreleri Expand.
23. GCV seçilen hücrelerin genomik DNA hazırlayın.
24. PCR kiti primerler (PCR bakınız) uçlar yükseltmek.
25. Standart sıralama veya derin sıralaması için PCR ürün göndermek için TOPOTA vektör (Invitrogen) içine Klon.

3. PCR-Amplify Seçilen Kütüphane Uçlar ve Sırası

Not: Bu işlem için yapılır gansiklovir seçim hayatta kütüphane hedefler PCR yükseltmek.

5.. Bir GenElute Memeli Genomik DNA Miniprep Seti (Katalog Numarası G1N10) veya eşdeğeri kullanılarak kromozomal DNA hazırlamak için gansiklovir seçili hücreleri toplayın. Biz PCR hedef-Seçili hücrelerin DNA ile karşılaştırılması için bir negatif kontrol olarak kullanmak için Hedef Kimliği Kütüphane içermez ana hücre DNA hazırlanması öneririz.

1. PCR AmAmplifikasyon Primer 1 ve 2 ile Amplifikasyon Primer genomik DNA teren bir yönerge hazırladık. PCR (Katalog Numarası P0982) için - Başarılı amplifikasyon JumpStart REDTaq Readymix Reaksiyon Karışımı ile elde edilmiştir. Başka bir polimeraz kullanılması durumunda koşullarının optimize gerekli olabilir. PCR bisiklet koşulları için bir örnek PCR kurulum ve Tablo 2 Tablo 1'e bakınız.
2. % 1 agaroz jel üzerinde, PCR ürün 2-5 ul gidermek. Beklenen ürün bazı görünür DNA bantlama ile bir smear olmalıdır. Hedef Kimliği Kütüphane olmadan hücrelerinden genomik DNA PCR ürünü kontrol karşılaştırın.
3. Klonlama ve / veya PCR ürün derin sıralama ile devam edin. Herhangi bir amplifikasyon ürünü gözlemlenen veya DNA kontrol etmek için aynıdır edilirse, PCR koşulları (örneğin, primer konsantrasyonu, tavlama sıcaklığının ve döngü) optimize eder.

6. Klonlama ve Sıralama

Not: Biz son derece klonlama tavsiye PCR ürünüs ve sonra kiti içinde sağlanan Amplifikasyon primerler kullanılarak klonlar, en azından 96 gelen standart sekanslama gerçekleştirmek. Bu prosedür, başarılı bir şekilde 96-kuyucuklu bir gece boyunca kültürler ve plazmid arındırma sistemleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Derin sıralama isteniyorsa bile, klonlama ve standart sıralama ilk sonuçlarına derin dizileme ekstra masraf garanti olup olmadığını belirlemek için bir kalite kontrol olarak kullanılabilir.

1. Klonlama PCR ürünleri (yukarıda) ile TA klonlama kiti üretimi protokolünü uygulayın.
2. Yetkili bakteri hücrelerinin içine klonlar Dönüşüm ve antibiyotik içeren ortam üzerinde gecede seçin.
3. Uygun antibiyotik içeren sıvı kültüründe bireysel koloniler izole etmek ve büyümek.
4. Plazmid DNA arındırın. 6.5. Amplifikasyon Astarlar ile sıralama reaksiyonlar gerçekleştirin.
5. (Roman tr insan transcriptome (bilinen transkript) ve insan genomu ile dizilerinin ŞOK uyumu ile gen hedefler belirleyinanscripts). *

* Klonlama giderme: sıralama gelen ekler yüksek sayıda plazmid dizisi iseniz gibi klonlama / sıralama koşulları optimize:

• PCR ürünü (insert) nitelik ve nicelik
• Ligasyon reaksiyonu
• Plazmid hazırlanması (kalite ve miktar)
• Reaksiyon koşulları sekanslama

4. Temsilcisi Sonuçlar

MiR-373 hedefler için Kitaplık ekranında
Misyon Hedef Kimliği Kütüphanesi performansını değerlendirmek için, miR-373 hedefler MCF-7 kütüphane salgılayan hücre seçilmiştir. Çok az ifade ya da saptanabilir hiçbir miR-373 (veriler gösterilmemiştir), çünkü MCF-7 seçildi. miR-373 biyolojik ilgi için seçildi. miR-373 ifadesi MCF-7 tümör invazyonu ve metastaz teşvik, normal olmayan bir metastatik hücre hattı [2]. Ayrıca, miR-373 orthologues fareden miR-290 küme fare embriyonik kök olarak katılıyorHücre bakım [3] ve miR-373 aile üyesi, miR-372, uyarılmış pluripotent kök hücreleri [4] yeniden programlama fibroblast teşvik etmektedir. Son olarak, çinko parmak kurucu miR-373 ifadesi MCF-7 hücrelerinde AAVS1 site içine inşa bir PGK eklemek için nükleazlar kullanılan ve RNA mikroarray analizi (veriler gösterilmemiştir) tarafından potansiyel miR-373 hedeflerin bir listesi oluşturulur.

Hedef ID Kütüphane MCF-7 hücreleri içine transfekte edildi, ve hücrelerin stabil bir nüfusu seçilmiştir ve zeocin ihtiva eden bir ortamda amplifiye. Elde edilen hücreler (MCF-7 Library) stabil bir miR-373 ifade yapı ile transfekte edilmiş ve miR-373 hedef hücreler için ifade zenginleştirmek için gansiklovir ihtiva eden bir ortamda seçilmiştir. Biz negatif kontrol MCF-7 Kütüphane hücreleri (miR-373 olmadan) ayırmak ve ölü hücreler beklenen yuvarlak haline getirmediği gözlemlendi. Ancak, fo gözlemlediği gibi fenol kırmızısı içeren orta turuncu-sarı dönmedi, çünkü kolayca tespit edildiği, büyüme durur yaptımiR-373 ifade eden hücrelerin r (Şekil 5). Hücreler gansiklovir içeren ortamda genişletildi ve hedef dizileri kalan hücrelerinden hazırlanan Hedef Kimliği Kütüphane cDNA ekler ve DNA yan primerler ile PCR ile izole edilmiştir. PCR ürünleri Illumina dizilenmisti.r.

Tablo 4'te gösterildiği gibi, 11.076 benzersiz genler eşleştirilir 17740719 cDNA okuma, elde edilmiştir. Bu özel genlerin, 2898 40'dan fazla okuma ile tespit edilmiş, ve bundan dolayı, güvenilir Bulunmuş olarak kabul edildi. CDNA uçları yükseltmek için kullanılan PCR primerleri, 40 ve 300 bazlar uzaklıkta yerleştirilmesi sitesinden çünkü okur 13106469 vektörü beklenmiştir. Bunun gibi, bu en sonuçta elde edilen genomik dizisi malzeme daha fazla geleneksel derin sekanslama aksine vektöründen olacaktır beklenmektedir. Ondört yüzde vektör veya cDNA ya eşlemek yoktu, ama NCBI-dışı gereksiz nükleotid veritabanı (yani, NR hit) uyum yoktu ve sadece% 1 hayır cDNA'nın vardı.

Bir başlangıç ​​karşılaştırma Hedef Kimliği Kütüphanesi ile özdeşleşmiş benzersiz genler 10 TarBase önceden tespit miR-373 hedefler (Tablo 5) listesinde de olduğunu bulundu. Bu 10 miR-373 hedeflerinin daha önce geçici bir sentetik miR-373 [5] taklit ile transfekte HeLa hücrelerinden RNA ile mikroarray tespit edilmiştir. Ayrıca, AAVS1 sitesi (veriler gösterilmemiştir) miR-373 ifade MCF-7 hücrelerinde aşağı-regüle bu aynı 10 gen tespit edildi. Bu nedenle, bu 10 miR-373 olasılıkla geçerli hedeflerdir. İş potansiyel hedefler ve RT-qPCR, Western blot ve lusiferaz reporter assay tarafından deneysel olarak seçilen hit doğrulamak için girişimde listesini karakterize etmek sürüyor.

Şekil 1. Hedef Kimliği Kütüphane için iş akışı. Bölümler AC: yordam bölümlere bakın. Her bir adım gösterildiği ve ayrıntılı olarak tarif edilmektedir Şekil 2 ve 3.

Şekil 2. Transfeksiyon ve Zeocin seçimi. Hedef ID Kütüphane plazmid bir havuz (A), a-timidin kinaz zeocin füzyon proteini (; Şekil 4 TKzeo) sonra, 3'-UTR takılan bir insan olan her bir cDNA. Hücreler Hedef Kimliği Kütüphanesi (B) ile transfekte ve 3-5 gün kurtarmak için izin verilir. Yapıları bu iyileşme dönemi (C) sırasında genomu entegre ve kodlanmış transkript (D) ifade edebilirim. İyileştikten sonra hücreler zeocin (E) maruz kalmaktadır. Stabil entegre Hedef Kimliği yapılardan TKzeo füzyon proteini salgılayan hücrelerin zeocin seçimi (F) hayatta. Untransfected hücreleri (G) ölmektedir. Buna ek olarak, herhangi bir hücre, bir endojen miRNA için hedef olan bir yapı ya da herhangi bir oth içerener faktör yapı ölecek Hedef Kimliği (H) den TKzeo ifade inhibe hücre olarak ifade edilmiştir.

Hedef Kimliği Kütüphanesi (yani, zeocin-seçili hücreler) içeren Şekil 3. MiRNA transfeksiyon ve gansiklovir seçimi. Hücreler seçilebilir mikroRNA ifadesini oluşturmak (A) ile transfekte edilir. Kurtarma sırasında, miRNA ifadesi yapı (B) bütünleştirmek ve miRNA inşa kodlanmış seçilebilir işaretleyici ifade edebilirim. Kararlı entegrasyonu (C) ve hücre genişlemesi için seçimden sonra, hücreler gansiklovir (D) ile tedavi edilir. Gansiklovir varlığı (yani, hücreler TKzeo miRNA tarafından hedef değil oluşturur ifade) içinde timidin kinaz (TK) üreten hücreler (E) Diğer taraftan ölecek, miRNA hedef s Kütüphane yapıları içeren hücreler ites TK üretmek değildir ve bu nedenle, gansiklovir seçimi (F) koruyacaktır. Yaşayan hücreler, gDNA izole yetiştirilen edilebilir ve cDNA içeren miRNA hedef siteleri Hedef Kimliği Amplifikasyon primerler kullanılarak PCR-çoğaltıldı. PCR ürünleri miRNA hedefler tanımlamak için insan genom ile dizilemesi ve hizalanabilir.

Şekil 4. Plazmid Harita ve Amplifikasyon Astarlar yeri. Sfi Ben cDNA klonlama ile sitelerdir.

Astar Diziler

MİSYON Hedef Kimliği Amplifikasyon Astar 1

5 ACGACGTGACCCTGTTCATC 3

MİSYON Hedef Kimliği Amplifikasyon Astar 2

5 TAAAACGACGGCCAGTGAAT 3

ig5.jpg "alt =" Şekil 5 "/>
Şekil 5. Hücre büyümesi üzerine Gansiklovir etkisi. Yirmi dört kuyucuğu ikiyüz binlere MCF-7 hücreleri veya Hedef ID Kütüphane içeren MCF-7 hücreleri ile ekildi. Yirmi dört saat sonra, orta gansiklovir 0 8, veya, 16 uM içeren ortamla değiştirilmiştir. 15 gün sonra, plaka (6 üst kuyu) fotoğrafını edildi, daha sonra Brilliant Blue R Boyama Çözelti (B6529) (6 düşük kuyu) ile HBSS ve lekeli ile yıkanmış, kuyu. Onlar timidin kinaz (TK) ifade yok çünkü gansiklovir Kütüphane olmadan MCF-7 hücreleri üzerinde hiçbir etkisi olmadığını unutmayın. Diğer taraftan, MCF-7 hücreleri ifade kütüphanesi TK yapmak ancak Brillinat Blue aldıktan canlı hücreler tarafından gösterildiği gibi, tamamen, 8 veya 16 uM azından gansiklovir öldürüldü değildir. Ancak, Kütüphane hücreler ortamda fenol kırmızı boya rengi ile kanıtlandığı üzere, gansiklovir büyüyen durdurabilirim. Tutuklandı hücreler orta asitleştirmek yoktur ve renk yerine veya değiştirme kırmızımsı kalırange-sarı.

Reaktif	Cilt / Reaksiyon
Jumpstart REDTaq Readymix Reaksiyon karışımı	10 ul
Amplifikasyon Primer 1 (25 uM)	0.2 ul
Amplifikasyon Primer 2 (25 uM)	0.2 ul
Genomik DNA	50-200 ng
Su, Moleküler Biyoloji	20 ul kadar

Tablo 1.

Adım	Temp.	Zaman	Döngüler
İlk Denatürasyon	95 ° C	5 dak.	1
Denatürasyon	95 ° C	30 sn.	pan = "3"> 40 döngü
* Tavlama	62 ° C	30 sn.
Uzatma	68 ° C	2 dk.
Final Uzatma	68 ° C	5 dak.	1
Tutmak	4 ° C	Tutmak

Tablo 2.

* Tavlama sıcaklığı değişebilir, ancak biz 53 ve 64 arasında değişen tavlama ile iyi amplifikasyon ürünleri gözlemledik ° C

Illumina sekanslamasıyla Tablo 3. Hedef Kimliği Kütüphane içerik.

Tablo 4. Illumina sekanslamasıyla miR-373 seçilen hedefler.

les/ftp_upload/3303/3303table5.jpg "alt =" Tablo 5 "/>

Tablo 5. Önce RNA mikroarray tarafından belirlenen 10 hedef.

Tartışmalar

microRNA inhibe mRNA çeviri post-transkripsiyonel gen ekspresyonu düzenleyen ve sık sık, hedeflenen mRNA ([6] Yorumlar) istikrarsızlaştırma 20-24 nükleotid RNA'lar vardır. Tek miRNA gelişimsel ve çevresel sinyallere bir hücre tepkisi kontrol etmek için birçok yüz mRNA'ların düzenleyebilir. Belirlenmesi ve hedef mRNA doğrulayarak bu yolları bir miRNA rolü ve fonksiyonu belirlemede önemlidir. Hayvanlarda, miRNA'lar ve hedef siteler tamamen tamamlayıcı değildir, çünkü Ancak, hedef tespit kolay değildir. "Tohum" bölge, miRNA ve 5'-ucundan 2 ile 7 arasındaki dayandırır, genelde hedeflerini tamamlayıcısı oluyor. Ancak, tohum kuralın pek çok istisnası vardır ve taban-eşleştirme aşağı bir kusurlu tohum maçı telafi edebilir. Bilgisayar algoritmaları Bir çok tohum eşleştirme ve mansap tazminat, hedef yapısına dayalı miRNA hedefleri tahmin etmek geliştirilmiştird konumu, sıra korunması ve deneysel olarak doğrulanmış hedefler ([7] Yorumlar) için gözlenmiştir diğer çeşitli parametreler. Öngörüleri uygun olan ve tanımlamaya pek çok geçerli miRNA hedefleri do silico iken, en genler deneysel doğrulama testleri başarısız ve birçok gerçek hedefleri tahmin edilmiyor öngördü. Bilgisayar algoritmaları önceden belirlenmiş hedef özelliklere dayalı Dahası, bunlar zaten bilinen sapan hedeflerin keşfi izin vermez.

Deneysel sistem bir dizi canlı hücrelerin işlevsel miRNA hedefleri belirlemek veya keşfetmek için başarıyla kullanılmaktadır. Bu küresel tarama yöntemleri mikroarrayler ve RNA sıralama, RNA co-immünopresipitasyon (RIP), ve Hücre kültüründe Amino asitler ile Kararlı İzotop Etiketleme (SILAC), bir proteomik yöntemi ([7] 'de gözden) içerir. Her yöntemin avantajları ve dezavantajları vardır. Hedefleme miRNA genellikle mRNA oynattığını ve onun bozulması, kaybolması o yol açar yanaBir miRNA sırasıyla, taklit ya da inhibitör tanıttıktan sonra mRNA düzeyinde r kazanç, miRNA hedefler belirleyebilir. MRNA Bu kaybı veya kazancı kolaylıkla mikroarray veya derin sekanslama tarafından tespit edilir. MRNA algılama yöntemleri basit ve protein tespit yöntemleri daha duyarlı iken, mRNA algılama bozulmuş olmayan herhangi bir miRNA hedefleri özleyeceğim. SILAC gelenler RNA algılamayı miRNA hedef sonuçlarını karşılaştırarak Bartell laboratuvar gelen son haberler [8] veya ribozom profilleme [9] memeli miRNA'lar ağırlıklı hedef mRNA düzeylerini azaltarak etki gösterir. Ancak, bireysel miRNA hedefleri ile çalışan diğer birçok laboratuvarlarında protein değişir ama mRNA düzeyinde herhangi bir değişiklik tespit ettik. Saptanabilir mRNA kaybı ile translasyonel düzenlemesi için ne görünür Raporları şunlardır: miR-10b HOXD10 [10] p27kip1 üzerine, miR221/222 [11] Pdcd4 üzerine, miR-21 [12], miR-126 p85β üzerinde [13] , SIRT1 üzerine miR-34 [14] PTEN [15], miR-302d Arid4b [16], miR-200C JAG1 [17], ve miR-299, 297, 567, bir üzerine, miR-21VEGFA üzerine nd 609 [18]. Ayrıca, Clancy ve ark [19] yakın let-7 hedef sitesi içeren bireysel mRNA izoformları seçici tespit edildiğinde let-7 tarafından translasyonal yönetmelik sadece tespit edildiğini bildirdi. Tüm mRNA izoformları bir mRNA olarak tespit edildiğinde yani, - - kadar mikroarray ve sekans analizi ile elde edilen ikinci en azından bazı durumlarda, translasyon düzenlemesi, bir kompozit profili göz ardı edilebilir, göstermektedir. Argonaute (genellikle ago2) veya başka bir ilişkili protein (RNA immünopresipitasyon veya RIP) ile miRNA-mRNA komplekslerinin Co-immünopresipitasyon bağımsız regülasyon mekanizması miRNA hedefleri izole olacaktır. Ayrıca, RIP, etkileşimleri endojen ve muhtemelen biyolojik ilgili algılar. Ancak, tüm miRNA-mRNA etkileşimleri fonksiyonel olup, RIP, yalnızca geçici ilişkilendirmek veya hızla bozulmuş olan herhangi bir mRNA hedefleri kaçıracağı olup olmadığı bilinmemektedir. Ayrıca, özel miRNA-mRNA ortakları bioinformati varılabilir gerekirTüm miRNA-mRNA çiftleri birlikte co-çöktürülmüş Cally çünkü. Son olarak, SILAC doğrudan miRNA düzenlemesi, protein kendisinin son ürün tanımlar, fakat duyarsız olduğunu ve bu nedenle nadir proteinler ve protein düzeyleri küçük değişiklikler kat bahsi.

Mevcut miRNA hedef belirleme yöntemleri ile sınırlamalar ışığında, biz alternatif bir mekanizma ile fonksiyonel miRNA hedefleri belirlemek için ek bir küresel analiz ihtiyaç hissettim. Bu ihtiyacı karşılamak üzere, Joop Gaken ve King s College London Azim Mohamedali tarafından icat edilmiş bir teknoloji lisanslı. Bunların buluş, bir çift seçimi füzyon proteini olup, özellikle, bir timidin kinaz-zeocin füzyon, onun 3'UTR potansiyel miRNA hedef dizilerinin bir cDNA kütüphanesi düzenlenir. Şekil 2 de gösterildiği gibi, stabil bir şekilde TKzeo-yapıları cDNA ile transfekte edilmiş ve eksprese eden hücreler, zeocin seçilebilir. Bir ilgi miRNA ifade ettikten sonra, bu miRNA hedefleri wi seçilebilirth gansiklovir, Şekil 3 'de gösterilmiştir. Gansiklovir, herhangi bir hücre ilgi miRNA için bir hedef yoksun TKzeo-cDNA ifade edilir timidin kinaz, Salgılayan hücrelerin öldürür. Hedeflenen cDNA kanadını cDNA ve PCR ürünleri hedefleri tespit etmek için diziliş edilebilir gansiklovir kullanılarak hayatta primerler hücrelerinden DNA'nın PCR amplifikasyonu ile izole edilebilir.

MİSYON Hedef Kimliği Kütüphane - Fonksiyonel insan miRNA hedeflerinin küresel kimlik ve keşif için yeni bir araç haline King 's College teknolojisi geliştirdi. Hedef Kimliği Kütüphane ile kullanıcılar, memeli hücre kültürü transfeksiyon ve ilaç seçimi bir dizi adım tarafından miRNA hedefleri ayırabilirsiniz. Kütüphane kapsamlı olduğunu ve insan genlerinin% 66-79 içerir. İlk sonuçlar, hem daha önce keşfedilen yanı sıra yeni hedefler MİSYON Hedef Kimliği Kütüphane izole edilebileceğini göstermektedir.

Protokolü, bazı uzunluğunun olmasına rağmenmemeli hücre kültürü, transfeksiyon, ilaç seçimi, PCR ve sıralama - - Hedef Kimliği Kütüphane kullanımı standart moleküler laboratuvar teknikleri gerektirir ve bu yüzden biyologların çoğu, araçlarının içinde de olmalıdır. Biz yeterince ilgi kültür koşullarının optimize, uygun deneysel tasarım için para ve en önemlisi, Hedef Kimliği Kütüphanesi ile başarı sağlamak için seçim adımları (kill-eğrileri) için optimum ilaç düzeylerini belirlemek için her yeni hücre tipi ön test edilmesini önerme.

Tüm miRNA hedef tanımlama yöntemleri olduğu gibi, son derece Hedef Kimliği Kütüphane eleme tarafından belirlenen hedefler gibi mikroarray, QRT-PCR, reporter assay (yani, lusiferaz) veya Batı analizi gibi ikinci bir yöntem ile doğrulanması önerilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı	Şirket	Katalog Numarası	Yorumlar
JumpStart REDTaq Readymix	Sigma-Aldrich	P0982
Gansiklovir	Sigma-Aldrich	G2536
G418	Sigma-Aldrich	G8168
Puromycin	Sigma-Aldrich	P9620
Topo TA	Invitrogen	KNM4500-01
Memeli Genomik DNA Miniprep Takımı GenElute	Sigma-Aldrich	G1N10
Hücre Özgül Nucleofection ko	Lonza
Nucleofector	Lonza	AAD-1001
Zeocin	Invitrogen	R250-01
Hedef Kimliği Kütüphane	Sigma-Aldrich	MREH01