MİSYON LentiPlex Memeli Hücreleri shRNA Kütüphane Tarama Pooled

Özet

Burada hücre sağkalım teşvik gen hedefleri belirlemek için sıralama yöntemlerini bir insan LentiPlex toplanmış kütüphane ve geleneksel kullanın. Biz kurmak ve deconvolute bir LentiPlex ekran ve sonuçları doğrulamak nasıl göstermektedir.

Özet

RNA enterferans (RNAi), içsel bir hücresel gen ekspresyonunun düzenlenmesi için mekanizmadır. Harnessing bu sistemin doğuştan gelen güç, gen fonksiyon testleri kaybı demonte gen ekspresyon düzeyleri sağlar.

RNAi performans için iki ana yöntem vardır. Ilk kimyasal olarak sentezlenmiş küçük müdahale RNA'lar (siRNA) kullanımı, ikincisi ise ¹ plazmid içinde kodlanmış kısa saç tokası RNA'lar (shRNAs) kullanır. İkincisi doğrudan hücre içine transfekte veya çoğaltma beceriksiz lentiviral parçacıklar halinde paketlenmiş olabilir. Lentiviral shRNAs kullanmanın ana avantajı hücre tipleri, stabil bir şekilde, uzun vadeli bir gen demonte ve seçim için genom entegre yeteneklerini ve fonksiyon ekranlar yüksek verimlilik kaybı yürütülmesinde etkinliği geniş bir yelpazede içine giriş kolaylığı. Bunu kolaylaştırmak için toplanmış LentiPlex shRNA kütüphane oluşturduk.

MISSION LentiPlex İnsan shRNA Pooled Kütüphane özel bir işlem kullanılarak üretilen bir genom lentiviral havuzu. Kütüphane, 75.000 'den fazla 15.000 hedef TRC toplama shRNA yapıları + insan ^genleri 2 oluşur . Her kitaplık ürün yayınlanmadan önce shRNA temsili için sağlam bir kütüphane kapsama sağlamak için test edilir. Kütüphane p24 tahlil ile en az 5 x 10 ⁸ TU / ml titrelerinde kullanıma hazır lentiviral formatında ve öncesi bölünmüş yaklaşık 8.000 shRNA on alt havuzlar içine her oluşturur. Amplifikasyon ve sıralama primerler aynı zamanda mansap hedef tanımlama için verilmektedir.

Önceki çalışmalar A549 hücreleri, bir insan akciğer kanseri hücre hattında ^{3, 4} paklitaksel ile kombine edildiğinde sinerjik bir antitümör aktivitesi TRAIL kurdu. Bu çalışmada, havuzlu bir LentiPlex shRNA kütüphane uygulaması hızla sitotoksisite o genler için olumlu bir seçim ekranı yapmak göstermekf A549 hücre TRAIL ve Paklitaksel maruz. Bir bariyer yüksek verimli ekranlar sıklıkla karşılaşılan maliyet ve deconvolution güçlük; biz de ayrıntılı bir maliyet-etkin poliklonal bir yaklaşım geleneksel sıralama kullanan.

Protokol

LentiPlex Pooled Ekranı

Ilgi shRNA dizileri tanımlamak için, bu hücrelerin büyük çoğunluğu sadece bir shRNA inşa aldığınız ekran kurmak için kritik öneme sahiptir. (Enfeksiyon çokluğu) İçişleri Bakanlığı düşük kullanarak, hücre başına birden fazla integrants olasılığı büyük ölçüde azalır. Ancak, transdüksiyon verimliliği ve bu nedenle istenilen Mois, hedef hücre tipine çok bağlıdır. Bu nedenle, optimal İçişleri Bakanlığı belirlenmesi, yeni bir hücre tipi ekran başlamadan önce gerçekleştirilen olduğunu zorunludur.

1. Misyon LentiPlex hedef hücrelerin İletimi shRNA Kütüphane Pooled

1. Farklı hücre tipleri için kullanılan İçişleri Bakanlığı gerçek değişecektir. Istenen çoğaltır Eğer plaka sayısı buna göre artmış olmalıdır. Buna ek olarak, genellikle farklı alt havuzlar birleştirmek için avantajlı olmaz. Alt havuzlar ayrı tutulması deconvolution sürecinde yardımcı olacaktır. Prope oluntransdüksiyon sırasında uygulanan alt havuzudur numarası ile her doku kültürü çanak r etiketleme. İçişleri düşük bir hücre başına birden fazla integrants olasılığını azaltmak için tavsiye edilir.
2. 1. Gün - 60 mm yemeklerin ertesi gün (toplam = 30 yemekler toplam üç nüsha olarak yapılan her 10 havuzları,) ~ 70% confluency elde etmek için yeterli hücreleri ile Tohum uygun sayıda. Çalışma için, 60 mm yemekleri önce transdüksiyon% 70 confluency ulaşmak için 6 x 105 A549 hücreleri ile ekilirler. Bu hücreleri hala üstel büyüme aşamasında olmasını sağlar. Büyüme oranları hücre tipine göre değişir ve ekran başlamadan önce tespit edilmelidir.
3. Hücreler 37 geceleme kuluçka ° C,% 5 _CO 2 atmosferinde nemlendirilmiş bir inkübatör uyması izin verin .
4. (Opsiyonel), negatif kontrol shRNAs transdüksiyon için iki ek 60 mm yemekler ekleyin. Bulaşıkları Label "Kontrol" SHC001H ve "Denetim B" SHC002H için.
5. 2. Gün - Transduce inciLentiPlex viral parçacıkları ile e hücreleri. Iletimi gününde, buz lentiviral parçacıkları çözdürün.
6. Laminer akış kaputu çözülmüş parçacıkları aktarın ve kullanıldıktan hemen değilse buz üzerinde tutmak.
7. Hesaplayın ne kadar, tüm hücre kültürü yemekleri arasında İçişleri Bakanlığı 1 hücrelere eklemek için her bir viral alt havuzu.
   1. Örnek: 1 x 10 ⁶ hücre / çanak, Viral titresi = 5 x 10 ⁸ TU / ml; istenen İçişleri Bakanlığı 1. i.) 1 x 10 ⁶ hücre / çanak x (İçişleri Bakanlığı 1) = 1 x 10 ⁶ transducing birimi (TU) gerekli ii) 1 x 10 ⁶ TU / (5.0 x 10 ⁸ C elde TU / ml) lentiviral stok solüsyonu A = 2 mcL uygun çanak eklenmelidir. Hücre kültürü çanak virüsün daha iyi dağılımını sağlamak amacıyla tam bir medya 100-300 mcL virüs hesaplanan miktar seyreltilir.
8. Öncesi numaralı seribaşı hücreleri medya çıkarın. Eksiksiz bir medya contaHer çanak ining hexadimethrine bromür çözüm. Medya hexadimethrine bromür önerilen nihai konsantrasyonu 8 mg / ml. Eğer hedef hücrelerine toksik bulursanız hexadimethrine bromür daha az kullanın.
9. Önceden belirlenmiş bir deney tasarımı uyarınca uygun yemekleri shRNA lentiviral parçacıkları ekleyin. Yavaşça girdap plakalar eşit hücreler boyunca virüs dağıtmak için.
10. 37 az 18-20 saat inkübe ° _C,% 5 CO2 bir atmosfer nemlendirilmiş bir inkübatör .
11. (Opsiyonel) A ve Kontrol Bulaşık B. SHC002H (shRNA kontrolü şifreli) aynı deney boyunca deneysel yemekleri bu yemekleri davranın Kontrol Bulaşık (boş vektör shRNA Kontrolü) SHC001H ile İçişleri Bakanlığı aynı tekrarlayın 3-8.
12. 3. Gün - medya değiştirin. Aspire virüs içeren medya ve taze eksiksiz bir medya (hexadimethrine bromür olmadan) ekleyin. ° C gecede 37 hücreleri inkübe edin.

2. Kaplama davranınterapötik bileşen / reaktif hücreler

1. 4. Gün - kuyulardan aspire medya ve optimum konsantrasyonda tedavi bileşeni içeren taze medya ekleyebilirsiniz. Kültür koşullarında olduğu gibi, tedavi değişecektir ve uygun konsantrasyonları ve süreleri önceden tespit edilmelidir. Bizim çalışmamızda, TRAIL ve 1 mcM Paklitakselin 100 ng / ml kullanılır. Hücreler 48 saat süreyle tedavi edildi.
2. T75 şişeler içine Surviving hücreleri yeniden numaralı seribaşı ve neredeyse% 100 konfluent kadar genişletmek için izin olmalıdır.
3. (İsteğe bağlı) seçim sonunda, A ve Kontrol Bulaşık B. Bulaşık A ve B Bulaşık her toplanmış kütüphane yemekleri en az biri daha az koloniler olmalıdır Bulaşık Kontrol inceleyin. Bulaşık koloniler beklenmedik şekilde yüksek bir sayı varsa, ya transdüksiyon süreci istenilen fenotip veya seçici basınç ile ilgili bir yol etkiledi daha testinin yeterince güçlü ve yeniden optimizasyon gerekli olabilir. Bulaşık B, pek çok koloniler içeriyorsaRNAi yolun shRNA ve nişan ifade ilgi fenotipi üzerinde güçlü bir etkiye sahip olabilir. Bu etkisi SHC002H özgü olmadığından emin olmak için SHC001H durumda tekrar.

3. Poliklonal bir hücre popülasyonu gelen deconvolution

1. Her bir alt havuzudur hücreleri heterojen nüfus Hasat ve genomik DNA izole. Çalışmada, hücreler PBS içinde kısaca yıkanmış ve GenElute Memeli Genomik Miniprep kiti ve temin protokolü (Sigma-Aldrich, G1N70) kullanılarak genomik DNA izole önce tripsinize. Alternatif olarak, şu anda piyasada bulunan herhangi bir diğer genomik arıtma kitleri DNA izolasyonu için kullanılabilir. Kültür hücrelerinin başlangıç ​​değeri için protokol tavsiyelerini takip etmek önemlidir.
2. PCR hedefleri. ShRNA şablonu kurtarma yordamı shRNA ekler seçilen hücre popülasyonu tüm havuzun amplifikasyon, ya da vermemek alınmasını sağlartek tek aldı ve genişletildi koloniler çift shRNA şablonları. ShRNA kontrolü ve seçilen hedef hücreleri ekler amplifikasyon sonra, PCR ürünleri sıralı olabilir.
3. Bu PCR adım Sigma Readymix, Katalog No P2893 kullanılarak optimize edilmiştir. Diğer reaktifler amplifikasyonu için kullanılan, ancak bisiklet koşullar ve / veya magnezyum konsantrasyonu başarılı amplifikasyon için modifiye edilmesi gerekebilir. Konsantrasyonu 20 mM Amplifikasyon primerler LentiPlex kiti ile yer almaktadır.
4. Tablo 1'de açıklandığı gibi PCR ayarlayın. Listelenen sırada bileşenleri ekleyin. Açıklanan tutarlar 50 mcL reaksiyon için. Daha fazla reaksiyonlar için istenen reaksiyonlar sayısına göre master miks bileşenleri ölçekli ve% 10 tutarı düşmek. Tavsiye DNA örneğinin miktarı 50-100 ng.
5. Bu güçlü bir reaksiyon için şablon appropr seyreltilmiş MİSYON shRNA İnsan Pozitif Kontrol Vektör oluşur tavsiye edilirkonsantrasyon iate. Bu şablonu ile başarılı amplifikasyon PCR bileşenleri ve bisiklet koşulları yeterli olduğunu gösterir. NOT: deneysel numuneler ve reaktifler kontaminasyon önlemek için, pozitif kontrol sonraki PCR reaksiyonları yerden ayrı bir yerde seyreltilmiş olması tavsiye edilir.
6. PCR içine Tablo 2'de listelenen PCR programı kaydedin.
7. Her bir örnek için, DirectLoad 5 mcL yanında boya ve electrophorese 1 mcL ile 3 mcL PCR ™ PCR 100 baz puan (bp) Düşük Merdiven, Katalog Numarası D3687% 1 agaroz jel üzerinde 309 bp Amplikon varlığını doğrulamak için birleştirir.
8. PCR amplikonlarının Subcloning: PCR ürünleri TOPO (Invitrogen, K4575-01), üretici protokolü takip TOPO-TA klonlama kiti kullanarak klonlanmış. Sonuç, bir PCR ürünü her vektör bulunan olmasıdır.
9. 250 Bireysel bakteri kolonileri izole (her bir birey PCR Amplikon içeren) ve büyümeye edildin, 100 mg / ml ampisilin ile 2 ml LB kültürlerde. Plazmid DNA GenElute Plazmid Miniprep kiti (Sigma-Aldrich, PLN70) kullanılarak elde edildi.
10. Saf EcoRI plazmid DNA ile sindirilir ve eklemek varlığını doğrulamak için electrophoresed.
11. Plazmid DNA örnekleri daha sonra sıralı ve shRNA eklemek LentiPlex kütüphanesi ile sağlanan LentiPlex shRNA Sıra Ara veritabanı kullanılarak belirlendi.

4. Hedef Belirleme ve Doğrulama

1. ShRNA GAAACACCGG-5'-3 'dizisini başlatır. Arama kutusuna sorgu sırası kapalı shRNA Sıra Arama Access veritabanı form üzerinde en az 10 Bundan sonraki ama en az 21 nükleotidler girin.
2. Toplanmış shRNA türler seçin. İsteğe bağlı olarak, alt havuzudur dizisi bulundu seçin.
3. Şimdi arama yapmak için "Potansiyel Hitler Bul" butonuna tıklayın. Bu th eşleşen ilgili TRC shRNA dizi (ler) tanımlamak gerekire veri sıralama. TRC shRNA dizisi hakkında daha fazla bilgi (ler) inin ve ilgili gen hedefleri Sigma-Aldrich En Gen kolayca bulunabilir: http://www.sigma.com/yfg
4. Belirlenen hedef genler orijinal TRC klon artı 1 shRNA 1 kuyusunda formatında kullanarak aynı genin hedef en az iki ek shRNAs orijinal tarama testinin tekrar valide edilmelidir. Gerçek tıklama kuyuların çoğunda aynı fenotipi gösterecektir.

5. Temsilcisi Sonuçlar

LentiPlex toplanmış ekran iş akışı bir örnek Şekil 1'de ayrıntılı olarak verilmiştir. TRAIL ve Paklitakselin huzurunda çoğaldı ki Transduced hücreleri şişeler konfluent kadar genişletmek için izin verildi. Genomik DNA hasat ve PCR ve klonlama tabi Şekil 1'de gösterildiği gibi, sıralama ve shRNA kimlik sunulmadan önce figu açıklananre 1 C. 250 klonları bu 25, sıralı birden fazla klonları tarafından temsil edildi ve geri kalan 225 sadece 1 klon tarafından temsil edildi ve şu anda takip değildi.

Şekil 2'de görüldüğü gibi, TBX3, PPP2CA ve AKT2 dahil olmak üzere birçok aday genler birden fazla klonları tarafından temsil edilmiştir. T-box transkripsiyon faktörü, TBX3 toplam dört klonların ortaya çıktı ve ⁵ tümör göç suçlanmıştır. PPP2CA baskılanması androjen yoksunluğu ile indüklenen hücre döngüsü tutuklama giderici ve ⁶ apoptozis önlenmesi androjen eksikliği koşullarında kültür LNCaP hücrelerinin büyümesini sürdürmek için kanıtlanmıştır. AKT2 kanser gelişimi ^{7, 8} birkaç rol oynadığı gösterilmiştir RAC-beta serin / treonin protein kinaz ve varsayılan onkogen.

* Final konsantrasyon Mg ^{2 +} çözümü 3 mM olacak;Taq Readymix ve Magnezyum klorür solüsyonu 1.5 mM 1.5 mM katkıda bulunulmuştur.
(Tablo 1). Lentiplex PCR Reaksiyon Koşullar

(Tablo 2). Lentiplex PCR Amplifikasyon Programı

Şekil 1. (A) LentiPlex, ekran havuzlu (B) Poliklonal deconvolution iş akışı, (C) ve shRNA hedeflerin belirlenmesi.

A. LentiPlex ekran toplanmış, Tohum hücreleri, daha sonra (toplam 10 havuzları, her üç nüsha olarak yapılan, toplam 30 yemekleri için), shRNA alt havuzlar ekleyin. Sonra, tedavi bileşen / reaktif (bizim durumumuzda, TRAIL ve Pa ile tedavisırasıyla clitaxel). Sonra hayatta kalan hücreler, matara kalkarlar ve genişletilmesine izin verir. Hasat her bir alt havuzudur hücreleri heterojen nüfus ve genomik DNA izole.

B. Poliklonal deconvolution. ShRNA eklemek içeren DNA yükseltmek için PCR gerçekleştirin. Şablon gDNA da poliklonal beri PCR ürününün boyutu, üniforma, ama sırayla poliklonal. PCR ürünü vektör klonlanmış ve daha sonra yetkili bakteri dönüştü.

C. shRNA hedeflerin belirlenmesi. Bireysel koloniler izole edilir ve plazmid DNA elde edilir. Her klon, tek PCR parçası ile klonlama vektörü içerir. Plazmid DNA ekleme ve sıralı varlığını doğrulamak için sindirilir. ShRNA eklemek LentiPlex shRNA Sıra Ara veritabanı kullanılarak belirlendi.

Şekil 2. Can Belirlenendidate Genler 25 aday genler birden fazla isabet ettiğini tespit edildi. 225 aday genler sadece 1 isabet etti ve takip değildi. Ek Tablo 1 aday gen tek başına klonların bir arıza için bakınız.

Ek Tablo 1. Bireysel TRC Kütüphane klonlar Poliklonal Sıralama Gen ID itibaren Belirlenen Algılandı Klonlar Hits

Tartışmalar

Bu çalışmada, paklitaksel / TRAIL tedavisi aşağıdaki A549 hücreleri sitotoksisiteye ilgili genleri tanımlamak için bir genom-geniş ekran mevcut. Havuzlu bir genom-geniş ekran bir yaklaşım, zaman, maliyet ve normalde geleneksel dizilmiş ekranlar ile ilişkili ekipman yatırımı azaltır. Ekran başarısı için kritik, önceden yapılan optimizasyon deneyler. İletimi koşulları ve İçişleri Bakanlığı ampirik olarak tespit edilmelidir.

Seçim yöntemi, istenilen fenotip (örneğin, hayatta kalma, yüzey protein ekspresyonu, vb.) Hücrelerinin sağlam seçimi için izin vermelidir. Bu parametrelerin optimizasyonu tespit yanlış pozitiflerin sayısını azaltacaktır.

Burada, seçili hücrelerin toplu nüfus gDNA hasat edildi ve ardından TOPO bireysel shRNA ekler tanımlamak için klonlanmış. Bu deneme için olası bir iyileşme sağlamak için FACS kullanarak canlı hücreler için seçim olurdusadece canlı hücreler toplanır. Belirlenen hedeflere özel bir tarama testinin hedef shRNAs transdüksiyon tarafından doğrulandığı olacaktır. Gerçek tıklama kuyuların çoğunda fenotipi gösterecektir.

LentiPlex Pooled Kütüphane uygulaması esnektir. Downstream uygulamaları geniş bir dizi ile uyumlu ve pozitif veya negatif seçim stratejileri ile birlikte kullanılabilir. ShRNA ekler deconvolution PCR / klonlama, mikroarray, ya da yeni nesil sıralama ^{9, 10} üzerinden gerçekleştirilir tarama koşullarına bağlı olarak, güç ve hız RNAi ekranlar deconvolute için bu tekniklerin iyi kurulmuş olmasına rağmen, bir mikroarray ile ilgi ve nesil sıralama yöntemleri biyoinformatik kaynaklarını ve bilgi deneysel sonuçlar doğru analiz etmek ve yorumlamak gerekiyordu durumu. Bu teknikleri ile ilişkili maliyetler, çoğu kez genom ekranlar girişim için bir engel olabilir. APCR / klonlama dayalı bir yaklaşım, mikroarray'ler ve yeni nesil sıralama gibi while gibi güçlü değil, etkili ve düşük maliyetli bir alternatif.

Agilent LentiPlex ekranlarda daha fazla yardım için TRC shRNA kütüphane dayalı özel bir dizi sunuyor. Bu seçenekler, araştırmacılar çeşitli hücresel fonksiyonların bir çalışma LentiPlex kullanmak için izin verir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktifi Adı	Şirket	Katalog Numarası
LentiPlex Pooled Array	Sigma-Aldrich	SHPH01
A549 Hücreleri	ATCC	CCL-185
TRAIL	Sigma-Aldrich	oductDetail.do? lang = tr & N4 =% T5694 7CSIGMA & N5 = SEARCH_CONCAT_PNO% 7CBRAND_KEY & F = SPEC "> T5694
Paklitaksel	Sigma-Aldrich	T7402
Topo TA Klonlama Kiti	Invitrogen	K4575-01
HızlıBaşlangıç ​​Taq Readymix	Sigma-Aldrich	ONCAT_PNO% 7CBRAND_KEY & F = SPEC "> P2893
GenElute Plazmid Miniprep kiti	Sigma-Aldrich	PLN70
EcoR1	New England Biolabs	R0101
hexadimethrine bromür	Sigma-Aldrich	H9268