Yaşayan Hücreler ubikitin-proteozom Faaliyet Monitoring Degron (DGN)-destabilize Yeşil floresan proteini (GFP) tabanlı Muhabir Protein Kullanımı

Özet

Canlı hücreler içinde ubiquitin-proteasome etkinliğini izlemek için bir yöntem tarif edilmektedir. A degron-İstikrarsızlaşmış GFP-(GFP-DGN) ve bir sabit GFP-dgnFS füzyon proteini oluşturulur ve bir lentiviral ifade vektörü kullanılarak hücre içine transdüksiyon ile uygulanır. Bu teknik, ubiquitin-proteasome etkinlik kolaylıkla Epifloresans ya da akış sitometrisi kullanılarak ölçülebilir hangi bir sabit GFP-dgn/GFP-dgnFS eksprese eden hücre soyu üretmek için olanak sağlar.

Özet

Proteazom anormal, katlanan hasar görmüş ya da oksitlenmiş proteinler ^{1, 2,} proteolitik bozulması ile ilgili ana hücre içi organel olup. Proteazom faaliyet Bakım hücrenin stres yanıtı ^3, hücre döngüsü kontrolü ve hücresel farklılaşma ⁴ veya bağışıklık sistemi yanıtı ^5, gibi birçok temel hücresel süreçler karışmıştı. Ubiquitin-proteasome sistemi fonksiyon bozukluğu tümörler ve nörodejeneratif ^{hastalıklar, 4, 6} ve gelişimi ile ilgili olmuştur. Buna ek olarak, proteazom aktivitesinde bir azalma hücresel yaşlanma ve organizma yaşlanma ^{7, 8, 9, 10} bir özellik olarak tespit edildi. Burada, bir GFP-DGN füzyon proteini kullanarak canlı hücrelerde ubikuitin-proteazom aktivitesini ölçmek için bir yöntem mevcut. Birincil hücreler canlı ubikuitin-proteazom etkinliğini izlemek edebilmek için, tamamlayıcı DNA (yeşil floresan protein (GFP)-DGN füzyon proteini kodlayan inşa GFP-DGN, kararsız) ve bir çerçeve kayması mutasyon (GFP-dgnFS, kararlı ¹¹⁾ taşıyan bir varyant lentiviral ekspresyon vektörleri içine yerleştirilir. Bu hücre tipi ya da donör yaşı bağımsız çok yüksek transfeksiyon verimliliği garanti çünkü geleneksel transfeksiyon teknikleri üzerinde bu tekniği tercih. GFP-dgnFS (kararlı) protein ve protazom inhibitörünün yokluğunda veya varlığında istikrarsız protein (GFP-DGN) tarafından gösterilen floresan arasındaki fark, her bir hücre soyu içinde ubiquitin-proteasome aktivitesi tahmin etmek için de kullanılabilir. Bu farklılıklar Epifloresans mikroskopi ile takip edilebilir ya da akış sitometrisi ile ölçülebilir.

Protokol

1. Plazmid İnşaat

1. Sipariş özel oligo-nükleotidler DGN (ACKNWFSSLSHFVIHL ¹¹⁾ ve dgnFS (HARTGSLACPTSSSICE) için kodlama ve DGN / dgnFS (Şekil 1) ile GFP füzyon elde etmek için pEGFP-C1 vektör içine Arter.
2. Pentr Yönlü TOPO Klonlama Kit protokol ve pLenti6/V5 Yönlü TOPO Klonlama Kiti (Şekil 6) ile devam göre PCR ile GFP-DGN ve GFP-dgnFS için kodlama sırasını yükseltin.

2. Virüs Üretimi

1. Onlar transfeksiyon gününde 90-95% konfluent olacak böylece T75 şişeler HEK 293FT hücrelerin transfeksiyon önceki gün (Gün 1) tohum.
2. Aktarılmasının günü serum ve 15 ml falcon antibiyotik olmadan DMEM 1.5 ml lipofektamin 2000 Reaktif 36 ul sulandırmak. Başka bir 15 ml falcon kullanın ve ya GFP için tamamlayıcı DNA inşa taşıyan 3 mikrogram pLenti6/V5 sulandırmak -DGN veya GFP-dgnFS, serum ve antibiyotik kullanmadan DMEM 1.5 ml 2.5 mikrogram zarf kodlama plazmid pMD2.G ve 7.5 mikrogram vektör omurgası psPAX2. 5 dakika sonra seyreltik sulandırılmış DNA lipofektamin 2000 reaktifi ile kombine edilmiştir.
3. Form için DNA-lipofektamin kompleksleri izin verecek şekilde, oda sıcaklığında 20 dakika için karışımın inkübe edin.
4. HEK 293FT hücrelerin ortamı çıkarın, orta 7 ml (antibiyotikler hariç) tarafından dikkatle değiştirin ve karıştırma için şişeyi ve ileri geri rock bu (Gün 2) DNA-lipofektamin karışımı ekleyin. Nemlendirilmiş bir% 5 CO ₂ inkübatör 37 ° C'de gece boyunca şişeyi inkübe edin.
5. Orta ertesi gün (; 3. Gün antibiyotik olmadan 10 ml orta) değiştirin.
6. 48 saat sonra (Gün 5) süpernatant hasat, oda sıcaklığında 5 dakika için 300 x g'da santrifüj ve bir 0.45 mikron filtre içinden PVDF süpernatant filtre.

Kültür ortamı - DMEM (HEK 293FT)

çadır "> DMEM
% 10 FBS
0.1 mM MEM NEAA
6 mM L-glutamin
1 mM sodyum piruvat MEM
% 1 Kalem-Strep (isteğe bağlı)
500 mg / ml Genetisin (isteğe bağlı)

3. Polietilen Glikol (PEG) Çöktürme ile Virüs Konsantrasyon

1. 4'te süpernatan ve 2 saat süre ile inkübe ° C. dört miktarlar, bir hacim polietilen glikol çözeltisi (50 mM PEG polietilen glikol, 41 mM NaCl, otoklav, pH = 7.2) ekleyin Dikkatlice üst edilerek her 20-30 dk karıştırın.
2. 4 ° C'de 30 dakika süreyle 1500 x g aşağı Spin Beyaz bir pelet görünür olmalıdır.
3. Süpernatan aspire ve 4 ° C'de 5 dakika süreyle 1500 x g'de yeniden santrifüj Kalan PEG çözüm aspire.
4. Orta veya pelet yeniden süspanse edin fosfat-tamponlu salin (PBS) ile yukarı ve aşağı pipetle ve 20 ila 30 saniye boyunca kuvvetli bir girdap tarafından. Bir kılavuz tek T75 şişesi ve kısım 100 ul için 500 ul kullanmak gibi. -80 ° C'de saklayın virüs

4. Virüs titering

1. 5 üzerinden Tohum × 6-plaka transfeksiyon Bir gün önce her bir kuyunun 10 ⁴ U2-OS hücreler.
2. Transfeksiyondan bir gün, kültür ortamı ortadan kaldırmak ve DMEM 8 ug / ml polybrene (hexadimethrine bromit) içeren 1 ml ile değiştirin. Konsantrasyonda virüs süpernatant 1:10 ve 1:100 seyreltin ve iyi biri her 1 ul ekleyin. Için, daha yüksek konsantrasyonlarda virüs 1 ul, 5 ul ve kalan kuyular için konsantre virüs süpernatan 10 ul kullanır. Bir iyi bir pozitif kontrol olarak bırakılmıştır.
3. Ertesi gün DMEM 2 ml orta değiştirin.
4. Seçim ertesi gün ile başlayın. Her bir kuyunun 10 ug / ml Blasticidin uygulayın. Ikinci günde antibiyotik içeren ortam değiştirin.
5. Yaklaşık 6-7 gün seçimi başlattıktan sonra untransduced hücreleri öldü. Boyama PBS ile hücreleri üç kez yıkayın ve kristal viyole (10 mg / l kristal viyole ile hücreleri kapak için% 20 etanol), oda sıcaklığında 5-10 dakika için inkübe. Aspiratif kristal viyole (birkaç kez tekrar edilebilir) ve GKD ₂ O ile iki kez kuyuları durulayın ve plaka kurulayın.
6. Kolonileri sayın ve 1.000 ve karşılık gelen seyreltme (Şekil 7) ile çarpın. Bu prosedür, virüs / ml transfeksiyon birimi (TU) hesaplamak için izin verir.

Kültür ortamı - DMEM (HFF-2/U2-OS)

DMEM
% 10 FBS
6mm L-glutamin
% 1 Kalem-Strep

5. Insan diploid Fibroblast Transduction (Bu işlem, herhangi bir hücre tipi için de kullanılabilir.)

1. 5 üzerinden Tohum × 10 ⁴ insan diploid fibroblast (HDFs) 6-kuyucuğu için transdüksiyon önceki gün.
2. Bir mililitre toplam olarak 8 ug / ml transdüksiyon arttırıcı olarak polybrene ile birlikte iki enfeksiyon çokluğu kullanımı.
3. Ertesi gün orta değiştirin.
4. Ne zamanhücreler konfluense başlatma 10 ug / ml blasticidin seçimi ile% 70-80 oranında yer almaktadır. Seçim işlemi tamamlandıktan sonra (daha untransfected hücreler ölür) hücrelerinin genişlemesi başlayabilir ve hücreler deneyler için hazırdır. Blasticidin Kronik seçimi istikrarlı bir hücre hattı eksprese GFP-DGN veya GFP-dgnFS füzyon proteinleri, proteazom aktivitesini ölçmek için hazır oluşturmasına olanak sağlar. Bu prosedür, hücre tipinden bağımsız olarak, çok yüksek transfeksiyon verimi garanti etmektedir.

6. Akış sitometrisi ile ölçüm

1. 1. Tohum × 10 ⁵ hücreleri (GFP-DGN veya GFP-dgnFS ya taşıyan) deneyinin bir gün önce.
2. Kontrol hücreleri öncesinde 3 saat proteazom inhibitörü ile ölçümü, örneğin 100 mg / ml LLNL davranın.
3. PBS ile iki kere yıkayın ve 0.5 ml tripsin kullanılarak hücreler hasat. Trypsinisation kültür ortamı 4,5 ml kullanın ve 15 ml şahin için hücreleri aktarmak durdurmak için.
4. Spin tOda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 xg'de o hücreleri.
5. 37, orta aspire PBS içinde tekrar süspansiyon ve hücreler 5 dakika boyunca 300 xg'de tekrar aşağı dönüş ° C.
6. FACS tamponu (10 mM Hepes, 140 mM NaCl, 2.5 mM _CaCl2, pH = 7.4) içinde tekrar süspansiyon 400 ul PBS aspire ve FACS tüpleri içine hücre transfer edin.
7. Flow sitometri ile buz ve tedbir örneklerinde hücreleri tutun. Hücreler, 4 ° C'de 30 dakika daha uzun bir süre muhafaza edilmemelidir

7. Temsilcisi Sonuçlar

GFP-DGN füzyon proteini proteazom ve bu nedenle protein hemen parçalanır için hedeflenen bir dizi taşır, bu GFP flöresan sinyalinin azalmaya karşılık gelir. Frameshift mutant (GFP-dgnFS) bu dizinin bir mutasyona uğramış versiyonu taşır ve proteozom tarafından bozulmuş değil, daha yeşil floresan yol açar. Bu nedenlerden dolayı, genç beklenen yüksek proteazom aktivitesi HDFs ve GFP-dg ile transdükn flow sitometri ölçümü hem de Epifloresans (Şekil 2A ve B, Şekil 3), düşük (% 6 pozitif hücreler) floresans sinyali göstermektedir. Aynı HDFs pozitif hücrelerin% 39,7 görüntülemek GFP-dgnFS ile transdük. Proteazom inhibitörü LLNL (N-asetil-L-lösil-L-lösil-L-norleucinal) ile hücrelerin tedavisi, GFP-DGN ve GFP-dgnFS hücreleri (Şekil 2A ve B her ikisi de% 62.9 ve en fazla sinyal yükseltilmiş ).

Yaşlı insan derisi örneklerinde proteozom aktivitesinde olası bir düşüşün belirlemek için, genç, orta yaşlı ve yaşlı vericilerden izole dermal fibroblastlar, GFP-DGN ve GFP-dgnFS ile enfekte olduğu gibi yukarıda tarif ve akış analizi öncesinde aynı pasajda sayıda ekili sitometri. Bu deneylerde, genç bireyler arasındaki GFP sinyali kesin artış (11.2 ± 0.88% GFP pozitif hücreler) ve orta yaşlı donörler (20.4 ± 2.27% GFP pozitif hücreler, p = 0.003) bir işaret gözlenmektedir Proteas azalmayaşlı donörler ⁷ (Şekil 4) elde edilen örneklerde ome aktivite. Proteazom aktivitesinde daha fazla azalma yaşlı bireyler (Şekil 4) izole edilmiş fibroblastlarda gözlenmiştir. GFP-dgnFS için Floresans şiddeti tüm olgularda oldu ~% 90 (veriler gösterilmemiştir) üç farklı yaş grupları için yüksek transfeksiyon etkinliği belirtir.

Şekil 1. GFP-DGN ve GFP-dgnFS sekansı. Gösterilen GFP (yeşil) pEGFP-CL1 vektör (gri) ve DGN / dgnFS sekansı (kırmızı) çoklu klonlama sitesi ve 3'-uç.

Şekil 2. GFP-DGN ve GFP-dgnFS insan diploid fibroblast Flow sitometri analizi. A. Genç insan sünnet fibroblast (HFF-2) bir yeşil floresan protein taşıyan lentiviral vektörleri ile enfekte edildi (GFP)-DGN gen veya GFP-dgnFS (frameshift) olarak gösterilen ve akım sitometri (FACS Canto II, Becton Dickinson) kullanılarak GFP floresan için analiz, inşa. Burada, belirtilen hücreler de proteazom inhibitörü N-asetil-L-lösil-L-lösil-L-norleucinal (LLNL) ile 3H ile tedavi edilmiştir. Enfekte olmamış hücreleri kontrol olarak kullanılmıştır. Deneyler, kopyalardaki uygulandı. B. Veriler, üç bağımsız deneyin temsil etmektedir. Numaraları GFP pozitif hücrelerin miktarını yansıtmaktadır. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 3,. GFP-DGN ve GFP-dgnFS HFF-2 hücrelerinin floresan mikroskobu analizi. HFF-2 Young, Şekil 2'de olduğu gibi tedavi edildi. Enfeksiyondan sonra 9 gün sonra, hücreler v vardıfloresans ve faz kontrast mikroskobu ile isualized.

Şekil 4. Insan deri yaşlanmasına proteozom aktivitesinde değişiklikler. Belirtilen yaş grubunda dokuz farklı donörden insan sünnet fibroblastlar minimal genişletti ve GFP-DGN için kodlama lentiviral yapıları ile enfekte edildi. Enfeksiyondan sonra 9 gün sonra, hücreler akış sitometrisi ile analiz edilmiştir. Veri çiftleri yaş grubu başına üç numune (± SE) elde edilmiştir.

Şekil 5,. Deneysel yaklaşım. DGN ve dgnFS için özel-oligo nükleotid pEGFP-C1 vektörüne klonlanmış ve virüsler HEK 293FT hücreleri kullanarak her yapı için üretilmektedir. Virüs titresi belirlenir. Hücreler virüs ile transdük ve genişletilmiştir. Tercih edilen tedavi sonra hücreler analiz edilmiştirflow sitometri ile floresan sinyal için.

Şekil 6. Randımanlı GFP-DGN haritası. GFP-DGN sırası dahil pLenti6/V5-DEST vektör harita gösterilir. Kısaltmalar: pCMV (CMV organizatörü), GFP-DGN (GFP-DGN dizisi), P _SV40 (SV40 erken promoter), EM7 (EM7 organizatörü), Blasticidin (Blasticidin direnç geni), ΔU3 / 3'LTR (3'LTR ile Silinen U3 bölge), SV40 pA (SV40 poliadenilasyon sinyali), ampisilin (Ampisilin direnç geni), pUC ori (pUC kökenli), PRSV / 5'LTR (RSV / 5'LTR melez promotör), Ψ (HIV-1 Ψ paketleme sinyalinin ), RRE (HIV-1 Rev yanıt elemanı).

Şekil 7. U2-OS titering plaka. U2-OS, 6-plaka üzerine ekildi ve farklı konsantrasyonlarda virüs (1/100 ile 1/10 seyreltme, 1, 5 ve 10 ul eş ile transfekte edildi) viral süpernatant ncentrated. Bir iyi untransfected kontrol (NT) olarak kullanılmıştır. 6-7 gün sonra, hücreler kristal viyole ve hava ile kurutulmuştur ile boyandı.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Ubikuitin-proteazom aktivitesi için bir muhabir substrat olarak yeşil floresan protein (GFP) kullanarak ilk yayın 2000 ¹² yayımlanmıştır. O zamandan beri, GFP hücresel faaliyetler, özellikle ubikuitin-proteazom işlemini görselleştirmek için ortak bir araç haline gelmiştir. In vivo ubikuitin-proteazom etkinliğini izlemek için bir GFP tabanlı muhabiri ile bir transgenik fare modelinde ¹³ girmiştir. In vivo araştırmalar bu yayın ile ilgili ek ¹⁴

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası
pEGFP-C1 vektör	BD Bioscience Clontech	6084-1
pentr Yönlü TOPO Klonlama Kiti	Invitrogen	K2400-20
pLenti6/V5 Yönlü TOPO Klonlama Kiti	Invitrogen	V496-10
Lipofektamin 2000 Reaktif	Invitrogen	11668019
DMEM	Sigma	D5546
PVDF filtre (Rotilabo-Spritzenfilter)	Roth	P667.1
Polietilen glikol	Sigma	P2139
NaCl	Merck	1.06404.1000
Dulbecco Fosfat Sali Tamponlune 1x (PBS)	Invitrogen	14190
hexadimethrine bromür	Sigma	10,768-9
Blasticidin	Invitrogen	R21001
Kristal viyole	Sigma	C3886
FACS tüpler	BD Biosciences
Penisilin Streptomisin (Kalem-Strep)	Invitrogen	15140130
L-glutamin 200 mM	Invitrogen	25030024
Sığır fetüs serumu (FBS)	Biochrom AG	S0115
MEM Temel Olmayan Amino Asitler (NEAA) 100x	Invitrogen	11140035
MEM 100 mM sodyum piruvat	Invitrogen	11360039
D-(+)-glikoz (% 45)	Sigma	G8769
Genetisin	Invitrogen	11811023
CaCl2	Merck	C5080
Hepes	Sigma	H3375
Tripsin-EDTA (% 0.05)	Invitrogen	25300054