Oligonükleotid çiftli Floresan Mikroküreler kullanarak Kompleksi Klinik ve Çevre Örneklerinde Bakterilerin Multiplex Algılama

Özet

Oligonükleotid çiftli florasan boncuklar kullanarak bir örnek içinde mikroorganizmaların tespiti için çoklama yöntemi açıklar. Bir örnek içindeki tüm organizmalar Amplikon bir panel prob-çiftli boncuk melezleşmiştir. LUMINEX veya Bio-Plex enstrüman, boncuk, boncuk türü ve hibridizasyon sinyali için her bir sorgu için kullanılır.

Özet

Bakteriyel vajinozis (BV), "normal" Mikrobiyota Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae de dahil olmak üzere çok sayıda bakteri türlerinin hakim olduğu bir Mikrobiyota ^{Lactobacillus-egemen,} ve diğerleri 1-3 bir değişiklik ile karakterize tekrarlayan polimikrobiyal bir sendromdur. Bu durum, HIV satın ^alma 4 de dahil olmak üzere, olumsuz sağlık sonuçları, bir dizi ile ilişkili olup, ^klinik olarak 5 yönetmek için zor olabilir. Ayrıca, BV tanısı, çeşitli sayısal ^kriterleri 6,7 puan vajinal sürüntü smear Gram boyama güvendi . Bu tanı, basit, ucuz ve kaynak sınırlı ayarları iyi uygun olmasına rağmen, sübjektif ve vajinal Mikrobiyota ⁸ kompozisyon ayrıntılı bir profilini vermez sorunları muzdarip olabilir. Yeni derin sıralama çabaları ile zengin, çeşitli vajinal Mikrobiyota ortaya koymuşturbir dizi BV ^11,12 moleküler tanı için potansiyel hedefler belirlenmesi sonuçlandı Normal ^9,10 olarak bireylere kıyasla BV tanısı kişilerden alınan örnekler arasında belirgin farklılıklar. Bu çalışmalar yararlı bilgiler bir zenginlik var, ama derin sıralama henüz klinik bir ortamda bir tanı yöntemi olarak pratik değildir. Biz son zamanlarda hızla LUMINEX ^platformu 13 algılama oligonükleotid çiftli florasan boncuklar kullanılarak, çok katlı bir biçimi vajinal Mikrobiyota profil için bir yöntem tanımlanmıştır. Bu yöntem, mevcut Gram boyama tabanlı yöntemler gibi basit ve hızlı ama prob tasarım çalışmaları sıralama kaynaklanan moleküler bilgi sömürmek için ek bir avantaj katıyor. Bu yöntem, bu nedenle, BV, spesifite ve duyarlılığı yüksek comp ile teşhis etmek için kullanılabilecek bir vajinal sürüntü bulunan önemli mikroorganizmalar profil bir yol sağlaryarı-kantitatif ve hızlı bir şekilde türlerin varlığı ve bolluk hakkında ek bilgi sağlarken Gram boyama ared. Bu çoklama yöntemi, şu anda tek ^bir örnek 14 5 veya 6 farklı deneyleri ile sınırlı belirli organizmalar için geçerli kantitatif PCR testleri aralığının dışında genişletilebilir. Önemlisi, bu yöntem vajinal bezlerden bakteri tespit sınırlı değil ve hızla ilgi hemen hemen her mikrobik bir topluluk profil kolayca adapte edilebilir. Örneğin, son zamanlarda, atıksu arıtma tesislerinde kullanım için tanı araçları geliştirme metodolojisini uygulamak için başladı.

Protokol

Bu yöntem Dumonceaux ark bildirilen araştırma kullanılmıştır. J. Clin. Microbiol 47, 4067-4077, DOI: 10.1128/jcm.00112-09 (2009).

Genel prosedürü anlatan şematik diyagramı Şekil 1'de sunulmaktadır.

1. Boncuk kaplin

(Bkz. Tablo 2) polistiren LUMINEX boncuk oligonükleotid problar kaplin için kullanılacak yöntemler açıklanmıştır. Hacimler yeni yakalama probları bir deneme olarak değerlendirilmesi için biraz adapte; bu miktarlar parantez içinde belirtilmiştir.

1. -20 ° C desikatöre 1-Etil-3-(3-dimethylamiopropyl) carbodiimide HCl (EDC) toz çıkarın ve oda sıcaklığına kadar sıcak.
2. , Daha sonra yaklaşık 20 saniye karıştırın, 20 saniye boyunca bir su banyosunda sonikatör sonciation mikroküreler tekrar
3. (5x10 ⁶ veya 1.25x karşılık gelen bir Eppendorf tüpüne Transfer ul mikroküre 400 (100 ul)10 ⁶ mikroküreler). LUMINEX tüpler yapışmasını ve boncuk kurtarma ile müdahale Kuplajsız boncuk önlemek için düşük protein bağlama mikrosantrifüj tüpleri (örneğin Eppendorf Protein LoBind tüpler, katalog numarası 0030 108,094) kullanılmasını önerir. Bunu biz genellikle standart polipropilen mikrosantrifüj tüpleri, (örn. VWR katalog sayısı 87.003-298) kullanılarak bir sorun bulamadı.
4. Pelet az 1 dakika süreyle 14000 xg. Süpernatantı çıkarın ve atın.
5. Ethanesulfonic asit (MES), pH 4,5 - (N-morfolino) oda sıcaklığında 0,1 M 2 50 ul mikroküreler (12,5 ul) tekrar
6. 10 mg / ml su EDC taze bir çözüm hazırlayın.
   1. Sonra 10 mg / ml su ekleyerek, analitik bir ölçekte EDC 5-10 mg ağırlığındaki bu çözümün en az 1 ml hazırlayın.
7. 5'-amino C12 modifiye yakalama mikroküreler oligonükleotid (Tablo 2) ve vorteks karışım 1 nmol ekleyin. 1 nmol 200 mcM oligo 5 ulnükleotid.
8. 5 saniye boyunca karıştırın mikrosferler ve karışık taze EDC çözüm 2,5 ul ekleyin.
9. Karanlıkta 30 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
10. EDC çözüm atın (adım 1.6) ve (adım 1.6) yukarıdaki gibi suda 10 mg / ml EDC taze bir örnek hazırlamak.
11. 5 saniye süreyle mikroküreler ve vorteks taze EDC çözüm başka bir 2.5 ul ekleyin.
12. Karanlıkta 30 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
13. % 0.02 Tween 20 1 ml ekleyerek boncuk yıkayın. Boncuklar tekrar süspansiyon Vortex (isteğe bağlı olarak 20 saniye sonikasyon).
14. 14000 xg 1 dakika santrifüjleyin. Süpernatantı çıkarın ve atın.
15. % 0,1 sodyum dodesil sülfat (SDS) 1 ml ekleyerek boncuk tekrar yıkayın. Boncuklar tekrar süspansiyon Vortex (isteğe bağlı olarak 20 saniye sonikasyon).
16. 14000 xg 1 dakika santrifüjleyin. Süpernatantı çıkarın ve atın.
17. 100 ul (25 ul) Tris-EDTA (TE) tampon [10 m boncuk süspanse edinM Tris-Cl, pH 8.0, 1 mM EDTA, pH 8,0].
18. Stok konsantrasyonunu belirlemek için bir haemocytometer veya Coulter sayacı boncuk numaralandırmak.
19. Her boncuk 100 boncuk / ul TE tampon bir son konsantrasyona seyreltilmesi Microsphere Master Mix hazırlayın. Havuzu testinin istenen karmaşık (örneğin 10-karmaşık bir tahlil için, her boncuk 100/μl bir nihai konsantrasyonu 10 farklı birleştiğinde boncuk karışımı) karşılık gelen boncuklar birleştiğinde.
20. 4 Microsphere Master Mix Mağaza ° C karanlıkta. Eğer bu koşullar altında tutulur karışımı ay boyunca saklanabilir.

2. Chaperonin 60 evrensel hedef tek iplikçikler Amplikon üretim ve üretim (cpn60 UT).

1. Her bir örnek için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ürün üretin. Phosphorothioate ve biyotin modifiye 5 'astar seti (Tablo 1) ekleyin. Tablo 3 karıştırmak için hacimleri ve konsantrasyonları için Bkz.
2. PCR işlemi tamamlandıktan hemen sonra, 2 T7 ex ul (20 adet)her PCR tüpü (PCR tampon T7 reaksiyon için yeterli olacaktır) onuclease. Reaksiyon oda sıcaklığında inkübe (~ 22-25 ° C) 40 dakika.
3. Bu inkübasyon sonunda, 0,5 M etilen 12.5 ul eklemek tetraasetik asit (EDTA) pH 8.0 ve karıştırın diamine. Bu tek iplikli PCR ürün ~ 64.5μl bir toplam verir.

3. Oligonükleotid çiftli polistiren boncuklar tek iplikli PCR ürün Hibridizasyon.

1. 60 Prewarm alet ° C, analiz sırasında hibridizasyon ısısını korumak için. Platformu ısıtıcı cihazın yazılımını kullanarak açın ve melezleşmiş boncuk karışımı içeren PCR tarzı plaka uygun pirinç ısıtma bloğu kullandığınızdan emin olun.
2. Bir pipet yardımıyla yeniden süspanse Microsphere Master Mix (adım 1.20), Eppendorf tüpe uygun bir miktar vazgeçmek kap tüp ve su banyosunda sonikatör 2 dakika boyunca sonikasyon. Alternatif olarak, boncuk resuspe mutlak tutarlılık sağlamak içinnsion, Microsphere ana karışımı, sonra bir polipropilen Eppendorf tüp içine istenilen miktarda dağıtılması, yukarıdaki gibi sonication vorteks ve, sonra pipetleme yeniden süspanse edilebilir.
3. 17 ul tek iplikli PCR ürünü (adım 2.2) düşük profilli 96-iyi termo PCR plate (Tablo 2) uygun kuyu içine koyun. Her bir kuyunun 33 ul yeniden süspanse sonciated boncuk karışımı ekleyin. Silikon kapak (Tablo 2) ile kaplayın ve hafifçe dokunun.
4. Bir program ile PCR plaka koyun: 5 dk, 10 dk, 60 ° C - 95 ° C - 60 ° C tutun, 60 ° C de 5 dakika, son. Programı başlatın.
5. Streptavidin fikoeritrin (SA-PE) çözümü taze olun; (ekstra birkaç kuyu olun) ortalama 25 ul gerekecektir. % 0.1 Sarkosyl; 50 mM Tris-HCl, pH 8.0 stok SA-PE (1 mg / ml), 1x tetramethylammonium klorür (TMAC) tampon (3 M TMAC 01:50 20 mg / ml seyreltilmesiyle SA-PE çözüm olun 4 mM EDTA, pH 8.0).
6. Termalcycler 60 ° C tutun adım alır.kapağı açın, silikon kapak ve her iyi (PCR plaka dikkate almayınız) SA-PE doğrudan çözüm eklemek kaldırmak. Silikon kapağını yerine takın PCR kapağını kapatın ve program kaldığı yerden devam.
7. Program tamamlandığında, plaka ve hızlı bir şekilde okumak için Bioplex makineye aktarmak. Plaka 10 dakika içinde okumak gerekir. 60 ° C'de okuyun; Bioplex bu sıcaklık prewarmed olduğundan emin olun. Prob yükseklik olarak kullanılan araç için kullanım kılavuzuna açıklanan kullanılan plaka, uyum sağlamak için ayarlanabilir edildiğine emin olmak.
8. Bioplex kapı ayarlarını doğru boncuk ve sinyal tespiti için, kullanılan mikroküreler türüne göre ayarlanmış olmalıdır. Manyetik mikroküreler 5,000-25,000 bir ayar gerektiren BioRad polistiren boncuklar 4,335-10,000 bir kapı ayarı gerektirir. Plaka muhabiri kazanç değerini artırır Yüksek PMT ayarını kullanarak çalışan seçeneği de vardır. Bu i canArtış düşük sinyallerin yoğunluğunu ancak önemli arka plan sinyali artacaktır uygun bir negatif kontrol içerir.

4. Temsilcisi sonuçları:

Geliştirilmesi ve uygulanması bu testte amaçlarından biri, mümkün olduğunca basit ve düzenli olarak bunu yapmak için. Bu nedenle makul bir zaman çerçevesi içinde tamamlanabilir bir test geliştirmek için T7 eksonükleaz tedavi süresi ve hibridizasyon süresi de dahil olmak üzere, kritik amplifikasyon sonrası adımları optimize edilmiş. Şekil 2A gösterildiği gibi, Amplikon T7 tedavisi çoğu probları T7 tedavi ile kısa ya da çok az ya da hiç sinyal olduğu gibi, sinyal üretimi için esastır. Sinyal sinyal artışı yavaşladı, hangi zamanda, yaklaşık 40 dakika kadar doğrusal bir artış göstermiştir. Primerlerin phosphorothioate değişiklik küçük kalkan önlenmesinde son derece etkili olduğunu gösteren sinyal hiçbir bozulma, T7 tedavi süresi 2 saat bile gözlendit iplikçik bozulması ¹⁵ nitelendirdi. Biz genel protokol süresini en aza indirmek için T7 tedavi süresi için 40 dakika seçti, ama T7 tedavi çok daha uzun süre devam edebilir Şekil 2A açıktır. Ayrıca sinyal nesil (Şekil 2B) hibridizasyon zaman etkisi belirlenir ve 10 dakika maksimum sinyal için yeterli olduğunu, melezleşme 4 saat sonra bile sinyal daha fazla artış gözlendi. Bu nedenle, genel test süresini en aza indirmek için 10 dakika hibridizasyon adım tekrar seçildi. Göz önünde bulundurarak, InstaGene (Bio-Rad) gibi hızlı DNA ekstraksiyon teknikleri ile bu sonuçlar ile, DNA ekstraksiyonu, PCR, ve LUMINEX analizleri de dahil olmak üzere genel bir tahlil, 4-5 saat içinde tamamlanabilir.

Dikkat edilmesi gereken bir nokta, bir LUMINEX veya Bioplex çalışması sırasında polistiren boncuklar agregasyonunun düzeyi testin verimliliği üzerinde büyük bir etkiye sahip olabilir. Bioplex yazılımı oluşur boncuk kümeleme seviyesi gösterecektirBirden fazla boncuk lazer yolu ve agrega hibridizasyon sinyali dışlama sonuçları tespit edilmiştir. Görünür boncuk agregasyon tek bir boncuk için uygun boyutta olmayan herhangi bir partikül madde neden olabilir ve hatta hava kabarcıkları neden olabilir. Bu olaylar herhangi bir boncuk agrega, hava kabarcığı veya partikül sinyal atılır. Çoğu durumda, biz o boncuk agregasyonu az (Şekil 3A) ve her boncuk için 100 sayma olayların hedeflenen düzeyin kolayca ulaşılabilir. Bununla birlikte, bazen boncuk, orta (Şekil 3B) ya da şiddetli bir agregasyon (Şekil 3C) düzeyi göstermektedir. Bu durumlarda, verilerin çoğu atılır, cihaz 100 boncuk tipine göre olaylar ve sonuçları ulaşmada sorun tartışmalı olabilir olabilir. Sonication adım (adım 3.2) boncuk agregasyonu en aza indirmek içindir. Buna ek olarak boncuk, seyreltilmiş Microsphere ana karışımlar (adım 1.20) olarak saklamak yardımcı olabilir. Biz hybri, bu hariç TMAC fark vardization tampon yerine SA-PE seyreltici (adım 3.5) ekleyerek boncuk agregasyonu en aza indirmek için yardımcı olur. Ayrıca, bu test değil ise, LUMINEX veya BioRad yeni manyetik boncuk agrega için bir eğilim daha az göstermek için düşünülmektedir.

G. hedefleyen bir 5-karmaşık LUMINEX dizi uygulama sonuçları vaginalis, A. vaginae, L. iners, L. crispatus, ve L. ilgili Gram boyanan çubukla vajinal smear ile birlikte gasseri Şekil 4'te gösterilmiştir. Bu örnekler, tek bir bireyin birden fazla zaman noktalarında alınmıştır. 0 zamanında, bireysel Gram boyama dayalı BV tanısı (Şekil 4A) ve dizi, G. temsil edilen organizmaların bu aynı örnek LUMINEX sonuçları (Şekil 4B) gösterisi vaginalis, en yaygın iken A. vaginae ve L. iners da pozitifti. Dokuz gün sonra, bireysel hala BV pozitif ve sG. için ignal vaginalis önemli ölçüde artmıştır ise A. vaginae ve L. iners hala pozitifti. Gram pozitif basil smear saptanabilir oldu önemlisi, G. için sinyal ise, bu süreden sonra bireysel (Şekil 4A), normal bir Mikrobiyota geçiş başladı vaginalis azaldı ve L. için sinyal iners (Şekil 4B) artmıştır. Gram G. algılamak için başarısız leke rağmen, bu yöntem (BV pozitif olarak kabul edildi G. vaginalis ve / veya A. vaginae için olumlu ^örnekleri) 13 BV orijinal tanımı olarak, bu birey, tüm zaman noktalarında olumlu BV Son iki zaman noktalarında vaginalis. Burada anlatılan LUMINEX yöntemi ile, eğilimleri kolayca sıralama tabanlı yöntemlerle karşılaştırıldığında olabilir ve organizma kimliğini ve bolluk hakkında ek bilgi sağlarken LUMINEX testinin sonuçları genellikle Gram boyama ¹³ doğrulamak.

Şekil 1 LUMINEX karmaşık bir klinik ya da çevresel örnek Mikrobiyota profili belirlemek için protokol şematik. Protokol ilgi örnekten elde edilmiştir DNA ile başlar. (1) kullanarak DNA PCR ürünü oluşturun iplikçik özel biotinlenmiş, değiştirilmemiş cpn60 UT PCR primerleri (Tablo 1) ile birleştiğinde phosphorothioate modifiye cpn60 UT PCR primerleri; (2) Bu Mikrobiyota temsil eden bir PCR ürünü havuzu oluşturur biotin bir iplikçik üzerinde değişiklik phosphorothioate; (3) phosphorothioate modifiye iplikçik düşürebilir ve bu nedenle tek iplikli DNA biotin 5 'sonunda güncellenmiştir oluşturur T7 eksonükleaz, çift zincirli PCR ürününün Digest; (4) Çift türe özgü cpn60 UT probları polistiren boncuklar her boncuk eşsiz bir spektral adresi (boncuk renk ile gösterilen) bu iLUMINEX veya Bio-Plex alet tarafından ayırt edilebilir (5) faiz örnek türe özgü oligonükleotid çiftli boncuk paketi için oluşturulan tek iplikli PCR ürünü melezleşme; (6) bağlanır streptavidin fikoeritrin konjuge ekle biotinlenmiş tek iplikli PCR ürünü ve melezleşme bir göstergesi olarak görür; (7) bir LUMINEX ya da Bio-Plex alet kullanarak spektral adresi (boncuk kimlik) ve hibridizasyon sinyal yoğunluğu belirler. En az 100 boncuk boncuk her kimlik için sayılır ve fikoeritrin sinyal ortalama floresan yoğunluğu (MFI) çıktı olarak rapor edilir. 100 farklı boncuk türleri için aynı anda değerlendirilebilir ancak üç boncuk türleri ayrımcılık gösteren bir tahlil gösterilmiştir. (8) PCR MFI aynı örnekten üretilen çoğaltır zaman (tek-kuyruklu öğrenci Kullanıcı t-testi, p <0.05) bir verilen boncuk negatif kontrolü göre önemli ölçüde daha fazla olduğunu, örnek bu organizma için pozitif olması için kabul edilir.

Şekil 2 LUMINEX tahlil parametreleri optimizasyonu. Beş farklı prob Peptostreptococcus anaerobius hedefleyen P. de dahil olmak üzere klonlanmış cpn60 UT vajina ile ilişkili olduğu bilinen 20 bakteri içeren plazmid oluşan karışık bir şablondan oluşturulan amplikonlarının kullanıldı anaerobius. (A). T7 eksonükleaz tedavi süresi Etkisi. Yukarıda açıklanan protokol izledi ama T7 eksonükleaz ile tedavi süre önce hibridizasyon ve medyan floresan yoğunluğu (MFI) tüm problar için belirlenen değişmekteydi. (B). Hibridizasyon zaman Etkisi. Yukarıda açıklanan protokol çeşitli hibridizasyon kez izledi. A ve tüm problar için medyan floresan yoğunluğu (MFI) olarak tespit edilmiştir aynı şablondan oluşturulan bir Amplikon probları aynı setleri kullanıldı.

">
Şekil 3 Bioplex yazılım kullanarak boncuk agregasyonunun belirlenmesi. Üç örnekleri boncuk agregasyon seviyesi (A) kabul edilebilir (% 5) olduğu Bioplex çalışır verilmiştir; (B) borderline (% 50) ve (C) kabul edilemez (% 80).

Şekil 4 BV tanısı, aynı kişiden alınan sıralı numuneler 5-karmaşık LUMINEX dizi Uygulama . (A). BV her numune değerlendirmek için kullanılan geleneksel teşhis gösteren Gram-lekeli slaytlar. (B). Uygulama 5-karmaşık LUMINEX dizi hazırlanmış ve bu protokol (A) gösterilen aynı dört örnek açıklandığı gibi yürütülür. MFI sinyal Bakteriyel hedefler bizim tanımı (tek kuyruklu Student t-testi, p <0.05) bir yıldız (*) ile gösterilir anlamlı pozitif oldu.

Tartışmalar

Özgüllük sinyal nesil kritik öneme sahiptir; sinyal gerçekten, o organizmanın elde Amplikon tespiti yansıtan gözlenen emin olmak gerekir. Yazılım PrimerPlex (Premier Biosoft) gibi verimli bir melezleşme olan problar tasarım için yardımcı olabilir, ancak kendilerinin veya hedef olmayan türler çapraz melezleşme değil olabilir. Bu protokol evrensel PCR primerleri açıklandığı gibi kullanıldığı zaman, üretilen Amplikon örnek mevcut organizmaların tümünü temsil ettiğini akılda tutmak öneml...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Oligonükleotid adı	Şirket	Sıra 1
H279BP	Invitrogen, IDT, ya da diğer	Biotin-OEFO GAIIIIGCIGGIGAYGGIACIACIAC
H280		YKIYKITCICCRAAICCIGGIGCYTT
H1612BP		Biotin-OEFO GAIIIIGCIGGYGACGGYACSACSAC
H1613		CGRCGRTCRCCGAAGCCSGGIGCCTT
1O, phosphorothioate-C, E, phosphorothioate-G, F, phosphorothioate-A, I, inozin Y, C veya T, R, A ya da G, K, T, G, S, C veya G.

Reaktifi Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1-Etil-3-(3-dimethylamiopropyl) carbodiimide HCl (EDC)	Delmek	22980
Floresan polistiren boncuklar: MicroPlex Mikroküreler (LUMINEX), ya da Bio-Plex COOH Boncuk (Bio-Rad)	LUMINEX veya Bio-Rad	Bio-Rad: 171-506xxx xxx boncuk tanımlayıcı tekabül	Manyetik boncuk oligonükleotid bağlamak için kullanılabilir hale geliyor ve bazı avantajlar sunabilir. Bu yazarlar tarafından denenmiş değil.
Yakalama oligonükleotidler (5 'amino C12 modifiye)	Invitrogen, IDT, ya da diğer	çeşitli	Desalted saflık derecesi kabul edilir. Vajinal bezlerden karakterize etmek için kullanılan yakalama probları dizileri, bu protokolü 13 dayandığı el yazması sağlanır .
T7eksonükleaz	New England Biolabs	M0263S
Streptavidin-R-fikoeritrin (SA-PE)	Invitrogen	S-866	Yüksek saflıkta SA-PE elde etmek için dikkatli olun; bu katalog numarası önerilir.
Termo 96 PCR plakaları	Balıkçı	CS006509	96-iyi PCR ve Bioplex makine sığacak
Termo sızdırmazlık mat	Balıkçı	CS006555	Yeniden kullanılabilir; sabunlu su ile yıkayın, iyice durulayın ve kuru
5M TMAC	Sigma	T3411
Bio-Plex veya LUMINEX aracı	Bio-Rad veya LUMINEX	Bio-Rad: 171-000201
Prob tasarım PrimerPlex yazılımı	Premier Biosoft	www.premierbiosoft.com	LUMINEX prob de için önerilendiğer yazılım platformlarında kullanılan olsa da, işaret

bileşen	ul / tahlil	μl/100 deneyleri	nihai konsantrasyonu
10x PCR buffer (Invitrogen)	5	500	1x
50 mM MgCl 2 (Invitrogen)	2,5	250	2.5 mM
10 mM dNTP	1	100	Her biri 0.2 mM
H279BP, 25 mcM	0,25	25	375 nM
H1612BP, 25 mcM	0,75	75	125 nM
H280, 25 mcM	0,25	25	375 nM
H1613,25 mcM	0,75	75	125 nM
Su	34	3400	---
Toplamları	44,5	4450