Nöronlar Foto-Stimülasyon için uygun fiyatlı LED Diziler

Özet

ChR2 ifade Yetişkin doğmuş nöronlar, koku alma nöral devrelerin işlevini doğru katkıları incelemek amacıyla dilim elektrofizyolojik hazırlıkları manipüle edilebilir.

Özet

Standart dilim elektrofizyoloji araştırmacılar, elektrik veya farmakolojik ^{manipülasyonlar} 1,2 yanıt olarak tek hücre elektriksel yanıtlar kayıt sinir devresi bileşenleri tek tek prob izin verdi . Genetik hedef nöronların (optogenetics) optik kontrol etmek için yöntemler icat sayesinde, araştırmacılar standart bir dilim hazırlık nöronların belirli gruplar üzerinde kontrol görülmemiş bir düzeye sahiptir. Özellikle, araştırmacılar ışık ^3,4 nöron aktif hale getirmek için channelrhodopsin-2 (ChR2) ışığa sağlar. LED tabanlı standart dilim elektrofizyoloji ChR2 photostimulation dikkatli kalibrasyon birleştirerek, daha fazla ayrıntı, koku alma ampul, koku alma sisteminin ilk merkezi röle yetişkin doğumlu internöronlar rolü prob. Özellikle yetişkin doğumlu nöronlar ChR2-YFP viral bir ifade kullanarak, biz seçici eski bir ortamda genç bir yetişkin doğumlu nöronlar kontrol edebilirsinizd olgun nöronlar. Optik kontrol, basit ve ucuz bir LED sistemi kullanır ve bu sistem çok fazla ışık, tek nöronların faaliyet spike uyandırmak için gerekli olan anlamak için nasıl kalibre göstermektedir. Bu nedenle, kısa mavi ışık yanıp söner uzaktan ChR2 transduced yeni doğan hücrelerin ateşleme düzenini kontrol edebilirsiniz.

Protokol

1. Optik Kalibrasyon: Ölçme LED Güç

1. LED dizisi aktif için bir fan ve yapıştırmayın bu LED / soğutucu aparat collimating objektif ile soğutulan bir soğutucu takın.
2. Aydınlık aydınlatma lambası kullanılan LED / soğutucu / fan / lens cihazları ile değiştirin. Bu cihaz dikkatle paralelleştirilmiş LED ışını düz bir optik yoğunlaştırıcı lens doğru yol boyunca hareket şekilde yerleştirilmesi gerekir. Soğutucu / fan sisteminin ortak bir zemin düzgün topraklanmış olduğundan emin olun.
3. Sürücü akım hızlı ve kare bakliyat verebilir bir güç kaynağı ile LED dizisi. Bu güç kaynağı bir darbe jeneratörü kaynaklanan bir 5V TTL darbe tarafından kontrol edilebilir.
4. Merkezi paralelleştirilmiş ışın alan diyafram ve kondenserin objektif arasında tanımlanan ışık yolu boyunca. İdeal olarak, LED ışın tamamen açılmış alanında diyafram biraz aşırı doldurmayın. Tipik olarak, daha sıkı collimated bir LED ışını bu diyafram daha az dolduracak, ve mor üretecektekdüzelik pahasına e güç. Kurulumu consenser diyafram konjuge düzlemde LED dizi biraz daha genişletilmiş bir görüntü yansıtılır collimating objektif seçerek ışık tekdüzelik arttı.
5. Kohler aydınlatma alanında diyafram (ışık kaynağının en yakın diyafram) görüntü dilim odası (Şekil 1) odaklanmış böylece kondansatör odaklanarak elde edin. Mercek kağıdı ince bir doku diğer derinliklerde alan diyafram odaklı görüntü görselleştirmek için bir projeksiyon perdesi olarak hareket edebilir.
6. Opak bir madde olarak bilinen bir çapa iğne deliği bir dizi delin. Bu küçük iğne deliği, optik bir güç metre sensör üzerinde tek bir yerde. Alan diyaframın maksimum okuma verir kadar sadece güç metre hareket ettirerek odaklı resmin üzerine numune aşamasında ve merkezi güç ölçer güç ölçer yerleştirin. Bu pozisyonda yapıştırmayın güç ölçer.
7. Tüm açıklıkları (diyafram açıklıkları diyafram ve tam olarak açılmasınaalanında diyafram). Sistematik optik lightpath göre ekli dilim haznesi / güç metre taşımak ve optik güç tekdüzelik ışıklı alanı içinde hesaplayabilirsiniz. Sisteminiz için tekdüzelik arsa oluşturun. Mikroskop objektif odak merkezli Kohler aydınlatma ile kurulum doğru ise, maksimum güç doğrudan hedefi altında olmalıdır ve bu odak dışında kalan bölgelerde artık bilinen bir miktar tekdüzelik arsa göre güç almalıdır.
8. Iğne deliği her boyutu için optik güç vs iğne deliği yüzey alanı, standart bir eğri oluşturmak. LED diziye giriş akımı ayarlayarak, birden çok güç düzeyinde bu eğri üretmek ve her bir eğri mm2 başına gücünü hesaplamak. LED dizi yama optikler için kullanılacak ise, ışık ne kadar yama aydınlatma altında iletilen bilmek için gerekli yama (kondansatörler, gözeneklerin ve filtreler) optik unsurlarını tanıtmak için emin olun.
9. Güç ölçer Flippingcıva lambası açıkken amacı yüz, 470Nm aydınlatma yoğunluğunu hesaplamak.
10. Odasının canlı bir dilim ekleyin ve saçılma beyin dokusu üzerinden iletilen ışık gücü belirlemek üzere standart eğrileri yeniden.

2. Dilimleme Usul ve Elektrofizyoloji

Bölüm A: Dilim Hazırlık

1. Fare anestezisi (60 mg / kg Ketamin ve 2mg/kg Xylazine) ve başını kesmek. ; Karışımı ile kabarmış ~ 310mOsm, pH 7.4 NaCl 124, 3 KCl, 1.3 MgSO _4, 26 NaHCO _3, 1,25 NaHPO _4, 20 glikoz, 2 CaCl _2: yapay beyin omurilik sıvısı beyin teşrih (ACSF mM % 95 O2 ve% 5, koku ampuller zarar vermemeye _özen, ² 5,1) CO . Hatta bir kenarı (yatay bölümler için) ile ventral yüzeyi ile agar iki yarımküresinin ve yer ayırın.
2. Tutkal vibr agar ve her kortikal yarımkürenin dorsal yüzeyatome ayna, ve banyo yavaş yavaş buz ACSF ile doldurun. Dilim, ventral yüzeyinden 300 mikron bölümlerde ısıtılmış (34-36 º C) ve her bölümün transfer oksijenli ACSF onları kurtarmak için 30-45 dakika izin verir.

Bölüm B: Gevşek Patch Ölçüm Spike Eşik

3. 30 dakika oda sıcaklığında dilim getirerek sonra, yavaşça oksijenli ACSF sürekli perfüzyon altında mikroskop odası kayıt odasında bir dilim koyun.
   Aşırı ChR2 enfekte olmuş nöronların uyarıcı riski, EYFP-ChR2 varlığı Epifloresans (şekil 2a) altında teyit edilebilir
4. Bir pipet çektirmesi (Sutter P-97) cam elektrotlar çekin. Bu elektrot ACSF doldurun. ACSF banyosuna konulduğunda ucu direnci 7-10 Mohms arasında olmalıdır.
5. Floresan aydınlatma altında, olgun morfolojisi ile dilim sağlıklı bir ChR2 EYFP nöron bulun. Ayrıca bu yama optik altında nöronun soma bulun.
6. Elektrot ucu geçirilir hafif pozitif basınç ile tespit floresan nöron doğru yama elektrot düşük. Membran temas yapıldığında, hızlı bir şekilde bırakın ve pozitif basınç emme ucu ile küçük ve kısa bir miktarda uygulayın. Giga-ohm mühür plazma membran ve yama elektrot duvarları arasında yapılmalıdır.
7. Giga-mühür, ölçülebilir bir yerel alan potansiyeli üretmek elektrot floresan nöron aktivitesi spike yeterince yakınsa oluşur. Olsa bile Farklı dozlarda ışık yanıp sönen bu nöron ChR2 etkinleştirin. Hafif doz LED gücü ve süresi, hem de bir fonksiyonu olduğundan, çok fazla ışık nasıl bir aksiyon potansiyeli, birden fazla yetki ve süreleri (şekil 2b) uyandırmak için gerekli hesaplar. Spike cıva lambası aydınlatma altında oluşur ne kadar gözlemliyoruz.

3. Temsilcisi Sonuçlar:

Mikroskopta (Olympus BX51WI), LED i2 menfez ve yoğunlaştırıcı mercek n hattı, böylece orijinal fabrika yüklü ark lambası lightpath sürdürmek. Alan diyafram ve diyafram açıklıkları diyafram kapatarak, yama kelepçe kayıtları (Şekil 1b) yeterli aydınlık kontrast elde edebilirsiniz. Tüm diyaframlar ile tam channelrhodopsin aktivasyonu (şekil 1a) için maksimum ışık gücü dilim maruz açın. Bizim mikroskop, bu yama yapılandırma (4.1 μW / mm ² karşı 6.88 mW / mm ^2), maksimum alan yoğunluğu daha büyüklüğü yaklaşık üç siparişlerin düşük ışık yoğunluğu üretir .

Biz tek bir yetişkin doğumlu ChR2 EYFP granül hücresi ifade belirtir rostral göçmen akımı (şekil 2a) Gevşek bir yama kayıt neuroblasts göç lentiviral enfeksiyonu sonra yetişkin doğumlu koku alma ampul granül ve periglomerular nöronlar hafta sağlam bir etiket maxim 5 ms stimülasyonum güç (6.88 mW / mm ²⁾ spike (şekil 2b) uyandırmak için yeterli olacaktır. Ekspresyon seviyesi hücreleri arasındaki farklılık gösterdiğinden, başak eşiği geçen ışığın miktarı değişebilir ve ilgi her hücre türü için istatistiksel olarak tarif edilmelidir.

Şekil 1 tam saha photostimulation ve patch-kelepçe dilim elektrofizyoloji dizi kurulum LED. Channelrhodopsin etkinleştirmek için (ChR2) açık arka diyafram açıklığı ve kondenser optikler (a) ile bir paralel ışın proje. Bu yapılandırma, tam alanında diyafram kapatma ve modüle alan diyafram genişliği (b), yüksek kontrastlı yama optik içine değiştirilebilir. Kısaltmalar: a. fan, b. soğutucu, c LED dizisi, d. collimating lens, e. ayna, f. alanında diyafram, g. diyafram, h. yoğunlaştırıcı lens, i. sample sahne, j. objektif.

Şekil 2. resmi yama kelepçe ve tüm alan photostimulation için koku alma ampul 300μm yatay dilim (a). Yayılan koku ampul çekirdek ChR2-EYFP ifade Lentivirally enfekte yetişkin doğumlu granül hücreleri görülebilir. Spike uyandırmak için gerekli olan ışık doz, LED flaş, (b) süresi artırılarak bulunabilir. Bu granül hücre için eşik tam LED yoğunluğu (2.43mW/mm ²⁾ 5ms oldu. Ölçeği (a), (b) = 50ms ölçek = 500μm.

Tartışmalar

Son yıllarda popülaritesi sinirbilim araştırması, ⁶ optogenetic araçları bir patlama gördük. Sonuç olarak, bu yeni araçları kullanmaya başlamak isteyen laboratuarlar için giriş bariyer düşürmek için giderek daha önemli. İşte biz bu channelrhodopsin ifade nöronlar tam alan optik stimülasyonu yapabilirsiniz böylece geleneksel bir yama klemp kulesi basit ve düşük maliyetli güçlendirme ve kalibrasyon yapmak için nasıl açıklar. Özellikle, biz, özellikle ışık ile yeni doğan n...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine	Imalgène 1000		100 mg/ml
Xylazine	Rompun		2%
NaCl	Sigma-Aldrich	S5886	&nbps;
KCl	Sigma-Aldrich	P5405
MgSO4	Sigma-Aldrich	M1880
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761
NaHPO4	Sigma-Aldrich	S5011
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
CaCl2	Sigma-Aldrich	C7902
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
Pipette Puller	Sutter Instrument Co.		P-97
Glass Capillaries	Harvard Apparatus	GC150T-10	1.5 mm O.D./1.17 mm I.D.
LED array	Bridgelux	BXRA-C2000
Collimating lens	Thorlabs Inc.	LEDC1	40 mm beam diameter
Power supply	A1W Electronik	HKO2800	2.8 amp
Optical power meter	Thorlabs Inc.	PM 100
Heatsink	Thermaltake	A1838	Silent Boost K8
Fan	Thermaltake	A1838	Silent Boost K8
Vibratome	Leica Microsystems	VT1200S