HIV-1 Çekirdek in vitro Uncoating

Özet

Uncoating HIV-1 yaşam döngüsünün ilk aşamasında önemli bir adım ve kapsid kabuk sökülmesi ve viral ribonükleoprotein kompleksi (vRNP) serbest bırakılması olarak tanımlanır. Burada, HIV-1 virionlar sağlam çekirdek tecrit ve bunların uncoating ölçülmesi için teknikleri göstermek In vitro.

Özet

Retrovirüsler genom lipid bir zarf tarafından çevrili bir kapsid kaplı. HIV-1 olarak lentiviruses için altıgen bir kafes olarak düzenlenmiştir CA protein, konik kapsid kabuk oluşur. Kapsid dar sonunda koni ^{1, 2,} 7 pentamers geniş sonunda ve 5 kapalı . Bu kapsid kabuk kaplı viral ribonükleoprotein kompleksi ve birlikte çekirdek oluşturur.

HIV-1, hedef hücre zarı ile viral membran füzyonu takiben, sitoplazmaya salınır. Kapsid sonra uncoating olarak adlandırılan bir süreç içinde çözünür formu ³ CA serbest bırakmadan sökülebilir. HIV-1 uncoating hücre içi konumu ve zamanlama tam olarak anlaşılamamıştır. Kapsid istikrarı değiştirmez CA Tek amino asit yer değiştirmelerin hücreleri ⁴ bulaştırmak için de HIV-1 yeteneğini bozar. Bu kapsid istikrarı HIV-1 enfeksiyonu için kritik olduğunu gösterir. HIV-1 uncoating Bu işlem için duyarlı ve güvenilir testlerin mevcudiyeti eksikliği nedeniyle çalışma zor olmuştur. Burada bulaşıcı HIV-1 parçacıkları izole çekirdeği kullanılarak in vitro uncoating çalışmak için kantitatif bir yöntem açıklanmaktadır. Yaklaşımı soğuk, deterjan ve doğrusal bir sukroz gradient katmanı üzerinden konsantre virionlar sedimentasyon çekirdek izolasyonu içerir. Uncoating ölçmek için, izole çekirdek 37 inkübe ° C çeşitli zaman aralıklarında ve Ultrasantrifügasyon tarafından sonradan pelet. Uncoating kapsamı süpernatantı CA kısmını nicel analiz edilir. Bu yaklaşım, HIV-1 kapsid ^{istikrar 4, 5,} 6 viral mutasyonların etkilerini analiz etmek için istihdam edilmiştir . Ayrıca HIV-1 uncoating hücresel faktörlerin rol çalışmak için yararlı olacaktır.

Protokol

1. HIV-1 parçacıkların üretimi

Devam etmeden önce, izin almak gerekir ve bulaşıcı HIV için onaylanmış bir biyogüvenlik tesisinde çalışmak üzere kurum Biyogüvenlik ofis yönergeleri izleyin. Bunu uygun bakım sağlamak ve biyogüvenlik laboratuar çalışma sırasında güvenlik önlemleri takip edilmektedir.

HIV-1 parçacıkların üretimi genellikle kalsiyum fosfat transfeksiyon yöntemi ^{7, 8} ile HIV-1 proviral DNA ile 293T hücrelerinde geçici transfeksiyon tarafından yapılır. Bulaşmış T hücrelerinin kültürü ile yetişen yüksek titresi virüs hisse senetleri de uygundur.

1. % 10 fetal sığır serumu (FBS) ve antibiyotik ile desteklenmiş içeren Dulbecco'nun Modifiye Kartal Medium (DMEM) Kültür 293T hücreleri [Penisilin (100 IU / ml) ve Streptomisin (100 mg / ml)] 37 ° C,% 5 CO ₂ .
2. % 0.25 'lik tripsin-EDTA ve tohum 2x10 ⁶ kullanarak yaklaşık konfluent yemekleri hücreleri Ayır hücrelerinin bir gün. Virionlar üretimi için tohum altı 100 mm kültür kaplarına. Çekirdek konsantre hazırlık gerekiyorsa, daha fazla yemekler transfeksiyon numaralı seribaşı olabilir.
3. Ertesi gün, hücre mono tabakaları yaklaşık% 25 konfluent ve transfeksiyon için hazır olmalıdır. Transfekte hücreleri altı yemekleri için, 2.7 ml steril su ile hacmi 120 mikrogram proviral DNA getirmek. Bu karışımı 0.3 ml 2.5 M CaCl ₂ ve 2XBBS 3 ml ekleyin ve birkaç kez aşağı yukarı pipetleme düzgün karıştırın. Karışımı 10-20 dakika oda sıcaklığında bekletin.
4. Karıştırmak için hafifçe dönen her yemeğin merkezine çıkan karışımı damla damla 1 ml ekleyin. Inkübatör 35 ° C ve% 3 CO ₂ set gecede yemekler (~ 16 saat) yerleştirin.
5. Kültür ortamı aspire edin ve hafifçe 5 ml PBS ekleyin.
6. PBS aspire edin ve 5 ml taze orta ekleyin. 37 ve inkübatörde Kültür hücrelerideg C ve% 5 ek 24-48 saat için ₂ CO.
7. Viral parçacıkların bulunduğu kültür süpernatant toplayın, 50 ml konik santrifüj tüpüne aktarın. Tüm yemekler süpernatantlar birleştirin ve pelet hücreleri ve enkaz 5 dakika boyunca 1.500 xg'de santrifüj. 0.45 mikron gözenek boyutu şırınga filtreleri kullanarak süpernatantı Filtresi. Önlemler canlı virüs ile çalışırken aerosol oluşumunu en aza indirmek için önlemler alınmalıdır. Bu santrifüj basamağı sırasında O-ring veya rotor kova kapakları ile konik tüplerin kullanımını içerir. Bu mümkün değilse, tüpler, vidalı kapakları parafilm ile sarılmalıdır.

2. HIV-1 virionlar Ultrasantrifügasyon konsantrasyonu

1. Kültür süpernatant 38.5 ml polyallomer santrifüj tüpüne (Beckman SW32Ti rotor veya eşdeğeri) (30 ml) koyun. 5 ml, 5 ml pipetlemeyin kullanarak PBS içinde% 20 sukroz solüsyonu ile virüs içeren süpernatant hafifçe altında yatan.
2. 3 saat santrifüj32.000 rpm, 4 ° C (r _max 175.000 xg) pelet virüs partikülleri.
3. Tüpün dibinde pelet rahatsız etmemek için özen, aspirasyon ile süpernatantı. 0.5 ml 1XSTE tamponu (10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA), 4 tüp ve yere ° C'de 1 saat pelet gevşetmek için. Hafifçe pipetlemeyin yukarı ve aşağı birkaç kez tüp alt pelet ayırmak için geniş çaplı bir 1 ml pipetlemeyin ucu kullanma. Sonraki köpük önlemek için özen gevşetti pelet, 1,5 ml mikrosantrifüj tüp transferi. Küçük öbekler virüs dağıtmak için izin vermek için başka bir 1-3 saat için 4 ° C'de inkübe edin. Bu dönemde, sukroz gradient adım 3.1 'de açıklandığı gibi hazırlayın.
4. Yavaşça pipetlemeyin virüs süspansiyon yukarı ve aşağı birkaç kez ve 8,000 rpm (6.000 xg), 4 ° C, 1 dakika boyunca buzdolabında mikrofuge'de santrifüj kalan kümeleri kaldırın. Bu işlem sırasında numune soğuk tutun.

3. Sakkaroz degradeçekirdek izole için santrifüj

HIV-1 çekirdekleri HIV-2 çekirdek ⁽¹⁰⁾ arıtma için daha önce açıklanan yöntemi bir değişiklik bir "spin-thru" yöntemi ⁹ kullanılarak izole edilmiştir.

1. 14.5 ml polyallomer SW32.1Ti rotor için bir santrifüj tüpüne 12 ml 1XSTE tampon doğrusal% 30 -% 70 sukroz gradient hazırlayın. Degrade hazırlamak için, eski bir 20 ml degrade kullanmak; yakın tarafında yer% 70 sakaroz çözeltisini 6 ml (çıkış bağlantı noktasına yakın) ve uzak tarafında% 30 sakaroz çözeltisini 6 ml. Hava kabarcıkları, iki odadan birbirine bağlayan kanal kapana kısılmış olmadığından emin olun. Otomatik alttan 1 ml% 85 sakaroz çözeltisini altta içeren tüpün üst degrade pompa eski yoğunlukları Akış degrade kullanın. Yavaşça 4 degrade ° C soğutmalı kadar (2-4 saat).
2. Geniş çaplı bir 1 ml pipetlemeyin ucu kullanarak hafifçe 0.25 ml,% 15 sakaroz çözeltisini ile% 1 Triton X-100 içeren STE gradient overlay.
3. Geniş çaplı bir 1 ml pipetlemeyin ucu kullanarak STE% 7.5 sakaroz çözeltisini 0.25 ml yavaşça kaplaması. Katmanları karıştırmak için dikkatli olun.
4. Adım 2.4 'ten 0.5 ml virus süspansiyonu ile yavaşça bindirme. Bu adım, herhangi bir degrade bozukluğu ve underlaid sakaroz katmanları karıştırma önlemek için dikkatli bir şekilde yapılmalıdır.
5. 4 gecede 32.000 rpm (r _max 187.000 xg) (16-20 saat) önceden soğutulmuş SW32.1Ti kova ve santrifüj ° C tüpler yerleştirin Santrifüj vakum 250 mikron ulaşıncaya kadar santrifüj duraklamadan önlemek için, santrifüj başlamayın
6. 1 ml üstten Otomatik yoğunlukları Akış degrade parçalama kullanarak degrade alt fraksiyonları toplayın. Toplama üzerine tüpler hemen buz koyun. Tüplerin içeriği tersini birkaç kez karıştırın ve ELISA veya ters transkriptaz aktivite assay ölçümü için her bir fraksiyonu 50 ul çekilme.

4. HIV-1 çekirdek yerelleştirilmesive çekirdek depolama

1. Uncoating testleri yapmadan önce, bu kesirler sağlam HIV-1 çekirdek içeren belirlemek için önemlidir. Bu p24 ELISA veya ters transkriptaz aktivite assay adım 3.6 50 ul alikotları kullanarak tespit edilebilir.
2. Çekirdeği ile ilişkili CA kurtarma genellikle çekirdek istikrar ile ilgili. P24 ELISA ⁹ her fraksiyon bir örnek kullanarak çekirdek ilişkili CA ölçün. Alternatif olarak, her bir fraksiyonu ters transkriptaz aktivitesini ölçmek. Her iki yöntem kullanılarak zirveye fraksiyonu 10 civarında olmalıdır.
3. Çekirdek içeren fraksiyonları Havuzu. Çekirdek içine toplanmış çekirdek, 0,2 - 0,3 ml alikotları -80 sıvı N2 ve mağaza flaş dondurucu ° C hemen kısım tahlil uncoating için kullanılacak değilse Bu şekilde dondurulmuş Çekirdek uncoating tayini için uygundur. Çekirdek ilişkili CA verimi genellikle p24 mililitrede 1-2 mg veya yaklaşık% 15 toplam virion ilişkilip24.

5. HIV-1 uncoating Kinetik tahlil

1. Uncoating reaksiyon başına gerekli HIV-1 çekirdek miktarı yaklaşık 50 ng. In vitro uncoating tayininde gerçekleştirmek için, süspansiyonun viskozitesini azaltmak için çekirdek kısım soğuk 1XSTE tampon eşit hacimde seyreltme ve pipetleme hataları en aza indirmek için.
2. Ayrıca, 0.15 ml, 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içinde 10 mcg / ml BSA içeren soğuk 1XSTE tampon çekirdek 100 ul sulandırmak. Biz tüpün duvarlarına CA adsorpsiyonu en aza indirmek için, BSA (10 mg / ml) ile STE tampon tamamlar. Tersine tüp birkaç kez karıştırın. Örnekleri girdap etmeyin. 37 az bir su banyosunda tüpleri ° C'de zaman aralıklarında (15, 30, 60 ve 120 dk). Tüpler hatta ısınma sağlamak için en azından iç örnek düzeyde su banyosuna daldırılmış olmalıdır.
3. İnkübasyon sırasında, yavaşça (genellikle 5 periyodik tüp içeriği karıştırmakTüp Flicking 10 dk). Sıfır dakika kontrolü için, 0.15 ml soğuk 1XSTE tampon içine çekirdek 100 ul sulandırmak ve tüm uzunluğu (120 dk) deney için buz üzerinde inkübe. Sıfır dakika kontrolünde bazal uncoating değeri verir ve 37 ° C farklı zaman aralıklarında inkübe çekirdeği, uncoating artışı belirlemek için kullanılır.
4. Kuluçka döneminin sonunda, tüpler 10 dakika boyunca buz koyarak uncoating işlemini durdurmak.
5. 45.000 rpm (TLA-55 rotor; r _maksimum 125.000 xg) tüpler Santrifüj az 20 dakika süreyle 4 ° C Bu pelet çekirdek uncoating bir sonucu olarak piyasaya sağlam bir çekirdek ve serbest CA süpernatantı kalacaktır. Rotor, 4 ° C örnekleri önce yükleme precooled olmalıdır.
6. Tercihen oda sıcaklığında saklanan jel yükleme ipuçları kullanarak yeni precooled mikrofuge'ye tüpleri süpernatantı aktarın. Pelet çıplak gözle görülebilen olmayacağını lütfen unutmayın, bu yüzden, çok dikkatli wsüpernatantı pipetleme hile. ELISA örnek seyreltici (PBS içinde% 0.5 Triton X-100 ve 5% Donör buzağı serumu) 250 ul pelet tekrar ELISA örnek seyreltici ekledikten sonra pelet etkin bir şekilde çözülmesini, vorteks sağlamak. Aşağıdaki bölümde açıklandığı gibi p24 ELISA kullanarak pelet ve süpernatant CA içerik sayısal olmalıdır.
7. Uncoating kapsamı süpernatantı CA kesir hesaplanması ile elde edilir.

6. P24 ELISA yöntemi ile CA Testi

1. Birçok ticari ELISA kitleri mevcuttur ve CA ölçmek için kullanılabilir. Kullanın ve herhangi bir ticari veya "in-house" ELISA testinin doğrusallık belirlemek için p24 standartları içerir. Numunelerin çözeltiler doğruluğunu sağlamak için çalışılmalıdır.
2. Biz rutin CA için tahlil için kullanabileceğiniz bir ev yapımı ELISA yöntemi geliştirdik. Prosedür, bir önceki ^rapordan 11 uyarlanmıştır ve NIH YARDIM edinilebilir yakalama ve dedektör antikorlar kullanılarak yapılırS Araştırma ve Referans Reaktif Programı.

7. Temsilcisi Sonuçlar:

ELISA sonucu çekirdek içeren fraksiyonları belirlemek için bir örnek Şekil 1'de gösterilmiştir. Fraksiyonları (1 ml) topladıktan sonra, her bir fraksiyonu 50 ul örnek seri dilüsyonları yapmak için kullanılır ve ELISA yöntemi ile analiz edilmiştir. Oniki kesirler değerler ekleyerek elde edilen toplam p24 14.5 mikrogram oldu. Rakam kesirler 8 ile 10 çekirdeği içerdiği gösterilmiştir. Çekirdek içeren fraksiyonlar için p24 değeri 2.17 mg. Çekirdek kesirler için p24 değeri oranı (2.17 mcg), toplam p24 değeri (14.5 mikrogram) alarak çekirdek ilişkili p24 yüzdesi (% 14.97) tespit edildi. Kesir 1 veya 2, p24, her zaman yüksek miktarda içerir; bu çekirdek ile ilişkili değildir ücretsiz CA temsil eder. Bu, sonraki her fraksiyonu ile p24 değerleri kademeli olarak azaltılması, sonra keskin bir artış ve p24 nihayet keskin bir düşüş takip ediyordeğerleri. Degrade yüklenirken uygun bakım alınırsa sonra çekirdek ilişkili CA zirve fraksiyonu 10 civarında bulunmuştur.

HIV-1 çekirdek uncoating kinetiği assaying elde edilen tipik bir sonucu Şekil 2'de gösterilmiştir. Grafik, yabani tip HIV-1 çekirdek uncoating bir zamana bağımlı bir artış gösterir. Süpernatantı CA kesir hesaplanmak suretiyle yüzde uncoating değeri elde edildi. Uygulama ile, testin yüksek tekrarlanabilir ve in vitro olarak viral çekirdek istikrar belirlemek için yararlıdır. Testin tekrarlanabilirliği, işlem sırasında örneklerin uygun taşıma son derece bağımlı olduğunu lütfen unutmayınız. Çekirdek ısıya dayanıksız olduğundan, örnekleri ° C tahlil boyunca kuluçka dönemi sırasında dışında 4 muhafaza edilmelidir.

Şekil 1 Denge yoğunluk gradiyenti santrifüjHIV-1 çekirdek. % 1 Triton X-100 ile üst üste% 30 ila% 70 doğrusal sukroz gradient üst konsantre bir virüs süspansiyonu uygulandı. 187.000 xg ve 4 geceleme santrifüj sonrasında ° C, 1 ml kesirler yukarıdan aşağıya (Kesir 1) (Kesir 12) toplandı ve p24 ELISA yöntemi ile belirlendi.

In vitro HIV-1 uncoating 2 Saat dersin Şekil. Saflaştırılmış HIV-1 çekirdekleri ° C belirtilen zaman aralıkları için seyreltilmiş ve 37 saat inkübe edildi. Sıfır min örnek deney tamamı boyunca buz üzerinde inkübe edildi. Inkübasyon sonrasında, örnekler 4 ° C'de 20 dakika boyunca 125.000 xg'de ultra santrifüje edildi Süpernatant ve pelet p24 ELISA ile ayrılmış ve analiz edildi. Protokol metninde açıklandığı gibi uncoating bir ölçüde tespit edildi. Her uncoating tepki yinelenen yapıldı; hata çubuklarını iki değer aralığına yayılır.

Tartışmalar

Bu yöntem, hedef hücreleri, HIV-1 uncoating analiz etmek için geçerli bir yöntem olmaması nedeniyle bu aşamada, HIV-1 yaşam döngüsü eğitimi için yararlı in vitro uncoating çalışmada HIV-1 çekirdek arındırmak için buraya nitelendirdi. Bu yöntem, çekirdek arındırmak için denge Ultrasantrifügasyon kullanıyor olsa da, diğerleri ile kısa Parçalama işleminden sonra doğrudan peletleme kullandık% 1 Triton ^{X-100, 12,} 13 ya da% 0,1 Triton ^X-100, 14, 15 ile üst üste sakaroz...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktifi Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar (isteğe bağlı)
DMEM	Cellgro	10-013-CV
PBS	Cellgro	21-031-CV
Triton X-100	Mallinckrodt Baker A.Ş.	9002-93-1
Tween 20	Acros	9005-64-5
% 0.25 'lik tripsin-EDTA	Cellgro	25-053-CI
2XBBS			Kompozisyon: 50mm BES [p H 6,95], 280 mM NaCl ve 1.5 mM Na 2 HPO 4. PH 6.95 ile ayarlayınoda sıcaklığında. Sterilize & Süzgeç alikotları -20 ° C'de saklamak,
Kaplama antikor: p24 için monoklonal antikor (183-H12-5C)	NIH AIDS Araştırma ve Referans Reaktifi Programı	3537
Primer antikor: HIV-Ig (hiper-immün insan hasta serum)	NIH AIDS Araştırma ve Referans Reaktif Programı	3957
İkincil antikor: Keçi anti-insan IgG, konjuge peroksidaz	Delmek	31130
HRP substrat	KPL Inc.	50-76-11
Immulon 2HB 96 kuyucuğu	Thermo Scientific	3455
SW32Ti ve SW32.1 Ti rotorları ve uyumlu ultrasantrifüjdeki	Beckman Coulter
TLA-55 rotor ve masaüstü ultrasantrifüjdeki	Beckman Coulter
Yüksek hızda mikrofuge'ye borular	Beckman Coulter	326.823, 358.123, 357.448
Otomatik yoğunlukları Akış yoğunluk gradiyenti parçalama	Labconco Corp.	4517000
Gradient Eski	CBS Bilimsel A.Ş.	GM-20