Müteakip 3D ile İntrakranial İmplantasyonu In Vivo Murin Gliomlar Bioluminescent Görüntüleme

Özet

İntrakraniyal GL261 hücrelerin içine C57BL / 6 farelerin implantasyon birçok insan glioblastoma multiforme işaretlerinden özetlemek malign gliomlar üretir. Biz bizi kullanmasına izin stably lusiferaz ifade GL261 hücreleri kullandı In vivo Görüntüleme tümör progresyonu takip etmek. Ameliyat ve 3D In vivo Görüntüleme göstermiştir.

Özet

Insan glioblastoma multiforme (GBM) özellikleri birçok özetlediği fare glioma 261 (GL261) in vivo modeldir sistemi olarak kabul edilmektedir. Hücre hattı başlangıçta C57BL / 6 singeneik fare suşu ¹ 3-metil-cholantrene intrakranial enjeksiyonu ile indüklenen; bu nedenle, immünolojik yetkili C57BL / 6 fareler kullanılabilir. GL261 kullanırken, aşağıdaki protokolü, herhangi intrakraniyal bir fare tümör modeli implantasyon ve izleme için kullanılabilir. GL261 hücrelerin stabil bir şekilde ifade ateşböceği lusiferaz (GL261-luc) için tasarlanmış. Biz de CMV organizatörü ifade luc2 gen istikrarlı transfeksiyon parlak GL261-luc2 hücre hattı oluşturdu. C57BL/6-cBrd/cBrd/Cr fareler Ulusal Kanser Enstitüsü, Frederick, MD (C57BL / 6 albino varyant), siyah deri ve kürk neden ışık zayıflama ortadan kaldırmak için kullanılmıştır. Albino C57BL / 6 farelerin kullanımı ile; in vivo görüntüleme IVIS Spektrum kullanarak in vivo imsistemi yaşlanma gün (Kaliper Yaşam Bilimleri, Hopkinton, MA) implantasyonu mümkün. GL261-luc ve GL261-luc2 hücre hatları ebeveyn GL261 hücreler olarak aynı in vivo davranış gösterdi . Insan GBMs paylaşılan histolojik özellikleri ve bu fare modeli bazıları şunlardır: tümör nekroz, pseudopalisades, neovaskülarizasyon, istila, hiperselüler ve inflamasyon ^1.

Implantasyon öncesinde hayvanlara bir stereotaktik aparatı ve bir kesi yerleştirilen bir intraperitoneal ketamin enjeksiyonu (50 mg / kg) ksilizin (5 mg / kg) ve buprenorfin (0.05 mg / kg), anestezi edildi üzerinden bir neşter ile yapıldı kranial orta hat. Burrhole bregma ve orta hat sağ için 2.3mm 0.1mm posterior yapıldı. Bir iğne 2.6mm derinliği 3mm ve geri 0.4mm derinliğe yerleştirildi. İki ul GL261-luc veya GL261 luc2 hücreleri (10 ⁷ hücre / ml), 3 dakika boyunca infüze edildi . Burrhole kapatıldıbonewax ve kesi dikildi.

Stereotaktik implantasyonu takiben bioluminescent hücreler implantasyon günden itibaren saptanabilir ve tümör IVIS Spectrum enstrüman, 3D görüntü rekonstrüksiyonu özelliği kullanılarak analiz edilebilir. Hayvanlar 150μg luciferase / görüntüleme için önce kg vücut ağırlığı 20 dakika subkütan enjeksiyon alırsınız. Tümör yükü, zaman içinde ortalama tümör biyoparlaklık kullanarak miktarı. Tümör taşıyan farelere morbidite değerlendirmek için günlük olarak gözlenmiş ve aşağıdaki belirtilerden biri veya daha fazlası mevcut olduğunda ötenazi: uyuşukluk, ambulasyon yetmezliği, hunched duruş, damat başarısızlık, iştahsızlık>% 10 kilo kaybı ile sonuçlanan. Tümörler tüm hayvanların nekropsi belirgindi.

Protokol

1. Hücre Kültürü

1. Kanser Tedavi ve Tanı (DCTD) Ulusal Kanser Enstitüsü (NCI), Frederick, MD Bölümünden GL26 hücre hattı elde edildi. GL261 hücreler tümör büyüme hızının bir miktar ölçümü kolaylaştırmak için bioluminescent Lenti-X HT Ambalaj Mix (Clontech Laboratories, Inc) ve FUW Lentiphos HT Sistemi (Clontech Laboratories, Inc, Mountain View, CA) kullanılarak yapıldı GL plazmid (JB Rubin, MD, PhD laboratuvar cömert bir hediye.) Hücreler% 10 tetrasiklin Fötal Buzağı Serumu (FCS; Clontech Laboratories, Inc), Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta (DMEM) devam edildi. GL261 hücreleri de stably pGL4.51 [luc2 / CMV / Neo] gen kodlama luc2 kullanarak vektör (Promega Corp, Madison, WI) ve FuGENE 6 Transfeksiyon Reaktif (IN Roche Applied Science, Indianapolis,) tarafından belirtilen aşağıdaki koşullar transfekte edildi üreticisi. Luc2 gen ateşböceği Lucifera kodon optimize edilmiş versiyonu.standart luc gen göre anlamlı derecede daha yüksek ışık çıkışı sağlar se. Kararlı transfektanları% 10 FCS ve 100 mg / ml Geneticin (G418, Invitrogen Corp, Carlsbad, CA) içeren DMEM medya ve tutuldu.
2. Kültürlü hücreler, implantasyon öncesinde trypsinzation tarafından hasat serum olmadan DMEM kez yıkanmış ve 1 x 10 ⁷ hücre / ml 'lik bir konsantrasyon serum olmadan DMEM yeniden bekletildi.

2. Cerrahi Kurulum ²

1. Steril bir ortamda, tüm cerrahi aletleri, sarf malzemeleri, eldiven, örtüleri, vb de dahil olmak üzere, ameliyat boyunca devam eder.
2. On hafta eski C57BL/6-cBrd/cBrd/Cr (albino C57BL / 6) farelerde Frederick Hayvansal Üretim Programı, Ulusal Kanser Enstitüsü satın ve ortalama 20 gram ağırlığı (NCI, Frederick, MD) kullanılır.
3. Hayvanlar ksilizin (5 mg / kg), ketamin (50 mg / kg) ve buprenorfin (0.05 mg / kg) intraperitoneal anestezi. Içine tutam ameliyat başladı önce hayvan yeterli anestezi olduğunu sağlamak için yapılır. Hayvanın herhangi bir bölümünün Hareketi (azda olsa bile), anestezi düzeyinin azaltılması bir göstergesidir. Hayvan hemen ek bir 3.3 mg / kg xylazine ve 26.6 mg / kg ketamin verilmiştir. Vücut ısısı, vücudu kaplayan bir lamba ve steril pansuman ile korunur.
4. Hayvan düzgün uyuşturulduktan sonra, stereotaktik headframe minderli yatak (Model 900 Küçük Hayvan Stereotaksik David Kopf Instruments) [Şekil 1] konur.
5. Akwa Tears Oftalmik Yağlayıcı Merhem küçük bir miktar (1 / 4 inç) kornealar üzerine uygulanır.
6. Hayvan hayvanın ağzı (hayvanın çene etrafında parmağı ve başparmak koyarak) stereotaktik çerçeve içinde girinti içine açılması ve üst ön dişler kayar stereotaktik çerçeve içinde sabitlenir. Kelepçe emin olun kulaklık hayvanın başının güvenli sıkılır ki incie kafa hizalandığından ve gözleri ancak hayvanın kafasını aşırı güç uygulamak için değil emin olun, ortalanmış.
7. O ₂ hortum, hayvanın burun delikleri yakın aşağı bantlanmış . Oksijen debisi 0.5 lt / dk.
8. Alt sırt ve kuyruk solunum uzlaşma için dikkatli olmak stereotaktik yatağa aşağı bantlanmış.
9. Cerrahi kesi yeri traş. Povidin-İyot Swab stickler, iyot hayvanın gözlerinin içine damla değildir emin olun, iyot ile kulakları arasındaki bölgeye geri dönüyor gözleri arasındaki bölgeyi yıkamak için kullanılır.
10. Hücreler hemen önce cerrahi implantasyon için hazırlanır ve razı olmayan sağlamak için periyodik olarak karıştırılır.
11. 10 ul, 50 mm Dünya Hassas Çalgı (TEFE), Sarasota, FL, iğne ile 26 göstergesi Eğimli şırınga hücre inokulum ile yüklenir. Hücrelerin bir araya kümesinin gibi görünüyorsa şırınga yeniden yüklemek için gerekli olabilir.
12. 10 ul şırınga UMP3-1 UltraM yerleştiriliricroPump mikro enjektör (TEFE, Sarasota, FL).

3. İntrakranial İmplantasyonu ²

1. Cilt insizyonu bir boyutu 15 neşter bıçak ve dişli forseps kullanılarak yapılır. Bregma (kafatasının üst kısmında sagital ve koronal sütür kavşağı) açığa hayvanın kulağına doğru hareket, boyuna hayvanın gözleri arasında 10-15 mm kesi yapılır. Bregma [Şekil 2] distal sinüs alanı ile kolayca karışabilir için düzgün bregma tanımlamak için emin olun.
2. Hayvan sedasyon sonra% 0.25 'lik (2.5 mg / ml) bupivakain bir insizyonel içi enjeksiyon alır.
3. Burrhole yavaş yavaş bir kafatası nüfuz ve beyin maruz kadar büküm ise iğne çok az basınç uygulayarak, bir 16 gauge 1 ½ inç iğne elle büküm orta hatta sağ bregma posterior 0.1 mm ve 2.3 mm yapılır.
4. Şırınga iğnesi Microdrive ste kullanarak pozisyon içine indireotactic şırınga sahibinin sadece beynin yüzeyine temas edene kadar. Bu pozisyonda, iğne, 3 mm derinliğe kadar beyin içine gelişmiş ve 3 dakika boyunca bir yerde saklanmalıdır.
5. İğne hücreleri infüze edilmelidir küçük bir cep oluşturarak, beyin yüzeyinin altında 2.6 mm toplam derinliği 0,4 mm geri çekilir. Bu noktada hayvan iğne düzgün yerleştirme ve derinlik sağlamak için bir X-ray görüntü almak isteğe bağlıdır.
6. 667 nL / dakika infüzyon hızı ile 2000 nL (2 mcL) bir birime ayarlamak mikro enjektör ile 3 dakika içinde hücre süspansiyonu demlenir.
7. Iğne, infüzyon sitesinden sızıntıyı önlemek için 2 dakika yerde kaldı.
8. İğne yavaş yavaş tamamen iptal edilir.
9. Burrhole Penfield disektör kullanarak kemik balmumu ile doludur.
10. Kesi büyük boşluklar cilt sol emin bir 4-0 (1.5 Metrik) Vicryl dikiş kullanılarak sütüre edilir. Vicryl çözülür bir dikiş materyalive bu nedenle sütürler kesi iyileşene kaldırılması gerek yok.
11. Ameliyattan sonra hayvanların 30 kafesinin alt yüzeyi ısıtmak için gerekli yüksekliği ayarlanmış bir ısıtma lambası ° C altında bir kafes yerleştirilir Hayvanlar tamamen uyanık olduğunda (kafes normal hareketi tarafından değerlendirilecek) grubu konut iade edilir. Oral ibuprofen ameliyat sonrası 5 gün boyunca kendi içme suyuna eklenir. Ibuprofen (100mg/5ml) 100 mg 473 ml standart bir kemirgen şişe su eklenir. Hayvanlar günlük ve görüntülü gözlenen ve her 3 günde bir tartılır. İki hafta implantasyon sonrası gözlem, iki kez her gün artar. Hunched duruş, daha az hareketlilik ve görünür bir vücut ağırlığı kaybı (≥% 20) içerir azalan sağlık belirtileri göstermeye Hayvanlar ötenazi. Bu belirtiler tümörün yayımlanmış bir tepki vardır ve bunlar tekrarlanabilir, tümör nedeniyle ölüme yaklaşık 1 gün önce görünür.

4. In vivo Biyoparlaklık Görüntüleme ³

1. [Yaşam] yazılımı başlatın.
2. IVIS Görüntüleme Sistemi [başlat IVIS Sistemi] Kontrol panelinin sağ alt tarafında düğmesini tıklayarak Başlamaya.
3. Kontrol panelinin sol üst tarafta [Luminesans] Görüntü Modu seçin.
4. Görüntüleme luciferase enjeksiyon sonrası kinetik çalışmada gerekli olan en uygun zamanı belirlemek için [Şekil 3]. Bu açıklamalar ateşböceği lusiferaz;
   1. Aşağıda açıklandığı gibi, D-luciferase ateşböceği (Kaliper Yaşam Bilimleri Katalog XR-1001 veya başka bir satıcı, benzer bir ürün 15mg/ml PBS içinde) 10μl / g vücut ağırlığı hayvan içine enjekte edilir.
   2. 3 dakika bekleyin ve ardından gaz anestezi odası (% 2 O ₂ İsofluranın gaz) içine koyarak fare uyutmak.
   3. Gaz anestezi odasına kapatın ve anestezi vana ve IVIS manifoldu vakum açık. Hemen yer sedatize hayvansıcaklık kontrollü görüntüleme platformu, gaz anestezi manifoldu farenin burun deliği düzgün yerleştirildiğinden emin. İlk görüntü, yaklaşık 5 dakika luciferase enjeksiyon sonra alınmalıdır. IVIS Spectrum cihaz içinde bir defada 5 hayvanlara görüntülenebilir. 5 hayvandan az görüntülü edilecekse, isofluran gaz tasarrufu için kullanılmayan manifold fiş (ler) mümkündür.
   4. Luciferase ifade için bir kinetik eğri oluşturmak için bir saat için bir dizi oluşturarak her 3 dakikada bir almaya devam edin.
      1. Kontrol panelinde [Sıra Setup] düğmesine tıklayın.
      2. Dizisi editörü görünür.
      3. Kontrol paneli, sıradaki ilk bioluminescent görüntü ayarlarını belirtin.
         1. Orta binning ile başlayan öneririz.
         2. Ayrıca optimum pozlama süresini belirlemek için Otomatik Pozlama tavsiye ederiz.
         3. Dizisi editörü [Gecikme] düğmesini seçinnd her edinimi arasındaki 3 dakikalık bir gecikme süresi belirtin.
      4. Dizisi editörü [Ekle] tıklayın. Toplama parametreleri daha sonra tabloya eklenir.
      5. Sırayla her bir görüntü için 4. adımı yineleyin.
   5. Eğrisi kurulduktan sonra, en uygun görüntüleme süresi, sinyal gücü (yoğunluk) karşı komplo tarafından tespit edilebilir. Resim hayvanların en yüksek in vivo foton anda en güçlü ve en doğru sinyali almak için sayılır.
5. Ancak Erken deneylerde kullanılan luciferase intraperitoneal (ip) enjeksiyonu, ip enjeksiyonları bazen biraz tümör hiçbir biyoparlaklık gösteren aralıklı sonuçları sonuçlandı. Biz sinyal zaman zaman rastgele olmaması, barsak veya diğer iç organları luciferase teslim bağlı olduğunu varsaydık. Bu nedenle subkutan (sc) luciferase enjeksiyonları kullanmaya başladı ve daha fazla görüntüleme tekrarlanabilirlik gördüm [Şekil 3].
6. Yirmisc enjeksiyon sonrası dakika, tepkisiz kadar O _2% 2 İsofluranın gaz odasına yerleştirerek, hayvanların anestezi.
7. Anestezi hayvan (lar) görüntüleme odasına taşınır. Oftalmik merhem görüntüleme uzunluğu nedeniyle kinetik çalışma için kullanılmalıdır. Süresi kısa, çünkü diğer görüntüleme işlemleri için gerekli değildir.
8. Görüntü orta binning 5 dakikalık bir poz süresi ile elde edilir. Otomatik satın alma seçeneği de kullanılıyor olabilir.
9. Sinyal doymuş ve / veya orta binning zayıf ise, binning ya da pozlama süresi ayarlanabilir.
10. Program dosyaları ve daha sonraki görüntü yorum kullanıcının bilgisayarına dizinde kaydedilir.

5. 3D Görüntüleme ³

1. [Sıra Setup] kontrol paneli penceresi [Görüntüleme Sihirbazı] sekmesini tıklayın.
2. Görüntüleme Sihirbazı başlangıç ​​ekranında görüntüleme modu ve cl [Biyoparlaklık]ick [Sonraki].
3. "Biyoparlaklık - DLIT" görüntüleme sihirbazı penceresi [Firefly] muhabiri prob seçin. Seçilen ateşböceği kaynak spektrum emisyon / uyarma elde edilecek altı karşılık gelen filtre seçimleri ile görünecektir.
4. Otomatik pozlama toplama Profil C. Varsayılan ayarlar Alan çok iyi bir çalışma parametreleri ve varsayılan seçenekleri ile en son ekran görünecektir; Ancak gerekirse, bu ayarlar değiştirilebilir.
5. [Next] ve dizi editörü penceresinde, 20 nm geniş filtreleri (560 nm, 580 nm, 600 Nm, 620 nm, 640 nm ve 660nm) az altı spektral bölgeleri sırası ile doldurulur. Basın [Sıra Edinme]. İlk filtre (560 nm), yüzey topografyası kurmak için bir lazer galvanometre kullanarak yapılandırılmış bir ışık deseni içerir.
6. Aracı Paleti [Yüzey Topografya] sekmesini seçin. Yüzey düzeltme, yeniden yapılanma süreci sırasında oluşturulan herhangi bir keskin açıları için hesap yapılabilir.Varsayılan düşük yumuşatma tavsiye edilir.
7. [Oluştur] ve tomografi analiz kutusu görünecektir. Tüm hayvan içeren bir kırpma kutusunu çizin ve ardından [Next] düğmesini tıklatın.
8. Eşik aracı seçilen bölge üzerinde mor bir maske olarak görünecektir. Hayvanın fotoğrafını maç için maske otomatik olarak ayarlanması gerekir. Gerekirse, daha uygun hayvan anahat uygun maske ayarlayabilirsiniz.Özellik.
9. [Finish] ve yeniden inşa mesh görünecektir. Rekonstrüksiyon sonra sonuçları sekmesinde kaydedilebilir.
10. Hayvanın yüzey topografya yaratma ardından, [DLIT 3D İmar devam Aracı Paleti aşağı bırakın.
11. [Analiz] sekmesi altında yeniden yapılanma gerçekleştirmek için tüm altı dalga boylarını seçin. 600 altında doymuş piksel veya sayıları vermiştir işaretini kaldırın görüntüler. [Parametreler] sekmesinde ayarları varsayılan olarak bırakın.
12. [Özellikler] sekmesi altında, "Muscle" varsayılan seçenek olarak listelenir olmalıdırr Doku Özellikleri ve "Ateşböceği" kaynak spektrum olarak listelenmiş olmalıdır.
13. Çözümle sekmesi altında [Yeniden İnşa] ve hayvan yüzey ve sinyal kaynağını karşılık gelen yeniden yapılanma 3D rekonstrüksiyon [Şekil 4] görünmelidir.
14. Sinyal konumu ve yoğunluğunu belirlemek için, Araç Paleti 3D Araçlar sekmesinde vokseller düğmesini seçin.
    1. Görüntülenen tüm vokseller etrafında bir kare çizin ve toplam akı ölçümlerini hacmi sekmesinin altında gösterilir.
    2. Seçilen vokseller sinyal konumu belirlemek için [Kütle Merkezi] tıklayın. Hayvan koronal, sagital ve transaksiyal dilim görünür ve [Ölçüm İmleç Display] kullanarak hayvanın yüzeyinin voksel merkezine uzaklık ölçülebilir.
15. Yaşayan Görüntü Yazılımı Kullanıcı Kılavuzu co-kayıt organı atlaslar ve diğer gelişmiş özellikleri hakkında daha fazla bilgi için bakınız.

6. Data Analysis ³

1. Görüntü kazanmış ve kaydedildikten sonra, [Gözat] düğmesine tıklayarak ve dosyayı seçerek programın dosya erişim.
2. Görüntü bilgileri [View] altında bulunan olabilir → [Bilgi].
3. Faiz (ROI) [ROI Araçlar] düğmesine Bölge Of seçerek sinyal yoğunluğu belirlenebilir. Görüntü görüntü kontrol panelinin sol üst köşesinde açılan listeden "Foton" seçerek [Photon] modu altında analiz edilir emin olun.
4. "Tipi" açılır listesinde [Ölçüm ROI] düğmesini seçin. Ilgi yatırım getirisini şekli seçin; seçenekleri Daire, Kare, ve Izgara içerir. Elde edilen imge yoğunluğu tüm alanlarını kapsayacak.
5. ROI pozisyon bioluminescent sinyal içeren bölgeye yatırım getirisini şekli seçimi sürükleyerek ayarlanır.
6. [Ölçü] düğmesine tıklayarak ROI sinyal yoğunluğu hesaplanır. ROI etiket yoğunluğunu gösterir. ROI yönetilen ve USI kaydedilebilirng Yaşayan Image yazılımı.

7. Temsilcisi Sonuçlar:

Başarılı hücre implantasyonu implante hücreleri cerrahi gününde IVIS tayfı kullanılarak saptanabilir açıktır. GL261-luc ve GL261-luc2 hücrelerin her ikisi de saptanabilir, ancak daha yüksek bir seviyeye biyoparlaklık [Şekil 5] luc2 gen sağlayacaktır. , Kısa bir süre implantasyon sonra çekilen görüntüler, arka plan olarak göz ardı edilmesi gereken hayvanın pençeleri ve burun non-spesifik sinyal olabilir. Implantasyon yerinde bulunan sinyal gerçek ve sinyal [Şekil 6] zamanla artacaktır. 6 gün sinyal yoğunluğunda düşüş, tekrarlanabilir ve implante hücrelerin bazı tümör kaybı nedeniyle büyük olasılıkla. Tümör yükü nicel ölçümler sonuçta hayvan hastalığa yenik kadar düzenli olarak artmaya gerektiğini tekrarlanabilir. Ancak, büyüme eğrileri implante hücreleri devlet, ya da kaçınılmaz küçük var büyük ölçüde bağlıdır. implantasyon prosedürü iability. Laboratuvarımız her üç günde bir görüntü implante hayvanlar için seçti.

Fareyi doğru uyuşturulduktan sonra Şekil 1, stereotaktik çerçeve yerleştirilir. Fare kafası ağız kelepçe ile sabitlenir.

Şekil 2. cilt, ana anatomik işaretleri bregma, koronal ve sagital sütür de dahil olmak üzere tespit açıldıktan sonra . Burrhole, kafatası nüfuz ve beyin maruz kadar küçük bir miktarda basınç yavaş yavaş, 16 gauge 1 ½ inç iğne büküm bregma sağ 2.3mm yapılır.

Şekil 3 subkutan bir kinetik karşılaştırma (iles/ftp_upload/3403/3403fig3_1.jpg "alt =" Figure3.1 "/>) karşı intraperitoneal ( Subkütan luciferase enjeksiyon programını göstermek için ve görüntü aşağıdaki luciferase yönetim için en uygun zamanı belirlemek için) luciferase enjeksiyon yapıldı. Üç dakika luciferase sonra fare, sedasyon IVIS Spectrum aleti yerleştirilir ve biyoparlaklık bir kinetik eğri oluşturmak için bir saat ve bundan sonra her 6 dakika için her 3 dakikada bir görüntülü olarak enjekte edildi. Bu luciferase yönetiminin subkutan rota elimizde bir intraperitoneal üstün olduğu ve hayvanların görüntü için en uygun zaman GL261-luc hücreleri kullanılan luciferase enjeksiyonu takiben yaklaşık 25 dakika olduğunu gösterdi.

3-Boyutlu bir reconst Şekil 4. Birden çok görünümGL261 luc2 hücreleri intrakranial implantasyonu karışıklık fare iskelet ve beyin ile birlikte kayıtlı.

Şekil 5 GL261-luc hücreleri vs GL261-luc2 hücreleri kaynaklanan tümörler elde Foton sayar. Sonuçlar 5 hayvanların ortalama.

Şekil 6 albino C57BL / 6 fare GL261-luc tümör hücre büyüme grafiği. Biyoparlaklık 3 günde ölçülen ve in vivo foton sayısı karşısında gün implantasyon sonrası olarak çizilir. Fotoğraflar çeşitli zaman noktalarında biyoparlaklık göstermektedir. Renklendirme, tümör hücre sayısı (renk çubuğunun sağ tarafında gösterilir) göre biyoparlaklık bir göstergesidir (piksel yoğunluğu). Hayvan hastalığa yenik sonra beyin diseke edildi ve luciferase ex vivo imag elde etmek için topikal eklendi.e içerlek rakam gösterilmiştir.

Tartışmalar

Hücre inokulum 0,4 mm cep oluşturduktan sonra beyin yüzeyinden 2.6 mm derinlikte demlenir. Iğne doğru yerleştirilmesi ve derinlik sağlamak için bir X-ışını, bir C-Kol ya da benzer bir X-ray görüntü yoğunlaştıran cihazı kullanılarak alınabilir, ancak bu isteğe bağlıdır. Hayvan düzgün sedasyon değilse, ameliyat komplikasyonları, hayvan hücre infüzyonu sırasında hareket edebilir ve bu noktada ortaya çıkabilir. Bu iğne parça hücre karışımı veya kanama sızıntıya neden olabilir. Kaçak hücreler, tümör hücrelerinin ektopik büyümesine neden olur. Burrhole protokolü ⁴ olarak açıklanan 2.3 mm medial yapılırsa da ponksiyon yapılabilir ventrikül önemli değildir. 2 ul metilen mavisi ile bir fare beslerken ve beyin dokusu diseksiyon infüze boya yerini kontrol etmek için iğne ve hücre yayılmasını doğru yerleştirme test edildi.

Bu protokolde, in vivo görüntüleme sistemi ve t IVIS SpektrumBu alet ile kullanılmak üzere tasarlanmış Görüntü yazılımı (v 4.0) yaşamak. (Kaliper Life Sciences). In vivo görüntüleme sistemi, görüntü analiz araçları herhangi bir karşılaştırılabilir benzer sonuçlar elde etmek için kullanılabilir. Bu sistemler, deneysel bir intrakranial tümör büyümesini takip geleneksel manyetik rezonans görüntüleme (MRG) üzerinden bazı avantajlar sağlar. 2 araçların en belirgin göreli maliyetler hayvan MRI makineleri çok daha pahalı ve genellikle yetenekli bir MRG teknisyen hizmetleri gerektirir. In vivo görüntüleme, burada açıklandığı gibi son kullanıcı tarafından yapılabilir. MRI veri kantitatif zaman alıcı ve biraz zan ise biyoparlaklık verileri, kantitatif. Ayrıca, MR görüntüleri tümör hücrelerinin yanı sıra ödem ve inflamasyon ve tedavi etkisi tümör ayırmak zor olabilir. Bu nedenlerden dolayı, büyüyen tümörün doğru hacimsel ölçümler elde etmek zor olabilir. Biyoparlaklık ATP, Bu nedenle sadece canlı tümör hücrelerinin tümör boyutu verilerine katkıda bulunmaktadır. Buna rağmen bir makine varsa, MR için bazı avantajları vardır. Hücreler, MRG tarafından görüntülenebilmekte bioluminescent işaretleyici ile etiketlenmesine gerek yoktur. Peri-tümöral ödem görselleştirmek için yeteneği bazı deneysel protokoller için bir avantaj olabilir. Her iki teknolojinin kullanılabilir duruma geldiğinde, her iki teknolojinin gücü birini kullanarak diğer kullanılmasına engel olmadığını, bu yüzden verilerin yanı sıra aynı hayvan peri-tümöral ödem ve inflamasyon varlığı, tümör büyüme elde edilebilir. araştırmacı.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif ya da tedarik Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
GL261-luc2 BioWare Ultra	Kaliper Yaşam Bilimleri	GL261-luc2
Dulbecco'nun Modifiye Kartal Medium (DMEM)	Invitrogen	10313039
Geneticin (G418)	Gibco (Invitrogen)	11811-023
Fötal Buzağı Serumu (FCS)	Invitrogen	26140079
Fosfat tamponlu salin (PBS)	Invitrogen	70011044
C57BL/6-cBrd/cBrd/Cr Fare	NCI-Frederick
Akwa Tears Yağ Oftalmik merhem	Akorn Inc.	17478-062-35
Ketaset (ketamin hidroklorür)	Wyeth	11570775
Sedazine (ksilizin hidroklorür)	Wyeth	10031894
Küçük Hayvan Stereotaksik Enstrüman	Kopf Aletleri	900
SYS-Micro4 Kontrolörü ile UltraMicroPump	Dünya Hassas Aletler	UMP3-1	Eğer mevcut değilse, elle demlenmeye mümkün
26 gauge 10μl şırınga iğnesi eğimli	Dünya Hassas Aletler	SGE010RNS
Adison Forseps	Dünya Hassas Aletler	500092
Penfield Dissector	Codman	65-1015
16g 1 ½ Hassas Glide İğne	Beckton, Dickinson and Company (BD)	305198
Cerrahi Bıçak Kolu	BD	371030
Boyut 15 Bıçak	BD	371315
4-0 Vicryl Sütür	Ethicon	VCP496G
Kemik Wax	Medline	DYNJBW25
Povidin-İyot Swab stickler	Medline	MD93901
D-luciferase Potasyum Tuz	Kaliper Yaşam Bilimleri	122796
Forane (İsofluranın)	Baxter	1001936060
OPMI Pentero Mikroskop	Carl Zeiss, Inc.		Herhangi bir cerrahi mikroskop yeterli olacaktır
Isteğe bağlı anestezi sistemi ile Xenogen IVIS Spectrum	Kaliper Yaşam Bilimleri