Mürin Yüzeysel lenf nodu Cerrahisi

Özet

Aynı fare zaman içinde bir bağışıklık yanıtı ilerlemesini takip etmek, lenf düğümleri sırayla ameliyatla çıkarılabilir. Burada, bu teknik gerçekleştirilebilir açıklanmıştır.

Özet

Bir aşı, bir enfeksiyon veya tümöre karşı bir bağışıklık cevabı ilerlemesini anlamak için immünoloji alanı içinde, yanıt zaman içinde takip eder. Benzer şekilde, lenfosit homeostazı çalışma süresi Elbette deney gerektirir. Aynı fare olan bu çalışmaların gerçekleştirme deney değişkenlik de kullanılan farelerin sayısını azaltmak için uygundur. Kan çekilme zamanı tabii deneyler performans sağlar, ancak yalnızca lenfositler dolaşım hakkında bilgi verir ve hücre ^1-4 sınırlı sayıda sağlar. Vücut içinde dolaşan ve lenf bezlerinde bulunan lenfosit farklı özelliklere sahip olduğundan, her iki bölgede incelemek önemlidir. Cerrahi ile lenf nodlarının çıkarılması sıralı bir bağışıklık tepkisi veya zaman içinde aynı fare immün hücre genişleme takip eşsiz bir fırsat sunuyor. Dahası, bu teknik PE için yeterli olan lenf düğümü başına 1-2x10 ⁶ hücreleri arasında verimlerifenotipik karakterizasyonu ve / veya fonksiyonel testler rform. Sıralı lenf nodu cerrahi veya lenfadenektomi başarıyla bize ve diğerleri ^5-11 tarafından kullanılmıştır. Burada, brakiyal ve kasık lenf düğümleri bir Narkoz fare derisinde küçük bir kesi yaparak çıkarılabilir açıklar. Cerrahi yüzeysel ve hızlı bir olduğundan, fare çok çabuk kurtarır, iyi iyileştirir ve aşırı acı deneyim değil. Her iki günde, o zaman tabii deneyler için izin veren bir ya da iki lenf düğümleri hasat etmek mümkündür. Bu teknik, zamanla lenf düğümü özellikleri-bulunan lenfositler incelemek ve böylece de uygundur. Bu yaklaşım çeşitli deneysel tasarımlar için uygundur ve biz birçok laboratuvarda sıralı lenf nodu cerrahisine yarar olacağına inanıyorum.

Protokol

1. Cerrahi Öncesi Hazırlık

Fareler Hayvan Bakımı yönergelere Kanada Konseyi'ne göre tedavi edildi.

1. Ketamin / Xylazine (150/300 mg / kg, ip) ile enjeksiyon yoluyla ya da izofluran inhalasyon (% 2, 1L oksijen) ile Anesthetise fareleri. Eğer mevcutsa bu anestezi zaman ve derinliği daha iyi bir kontrolü için olanak olarak, izofluran kullanılmalıdır. Ayrıca, oksijen hayvanın fizyolojik işlevleri destekler aynı anda verilir. Dahası, izofluran doğrudan akciğerler ile elimine edilir ve böylece hepatik veya böbrek metabolizmasını gerektirmez.
2. Ya da bir başka analjezik - Buprenorfin (0.1 mg / kg, sc 0,05) enjekte edilir.
3. (Izofluran kullanılırsa) göz kuruluğu önlemek için ameliyattan önce fare göze merhem sürün.
4. Fare pençesini pinching ve kuyruk yuvarlayarak uykuda olduğundan emin olun. Fare tepki vermezse, cerrahi ile devam edin.

2. Cerrahi

Bu cerrahi yüzeysel lenf düğümleri (LN) 4 kaldırmak mümkündür: 2 inguinal ve 2 brakiyal. LN izolasyonu LN izolasyonu ile karışabilir büyük farelerde yağ dokusu varlığında yana genç yağsız farelerinin (6-8 haftalık) daha kolay olmaktadır. Ancak, bu sınırlama tekrarlanan uygulama ile üstesinden gelinebilir. Fareler konfor için, bir seferde 2 LN maksimum hasat ve biz zaman tabii deneyler gerçekleştirirken, her ikinci gün LN hasat. Ayrıca, enfeksiyonu önlemek için antibiyotik fare verildi, ama biz yapmak ve yaralara iyi şifa olabilir. Deney tasarımı bağlı olarak, bir antibiyotik kullanımı sonucu (örneğin, bir bakteri bir yanıt olarak ölçülür eğer varsa) gözlenen etki edebilecek unutmayın bir ihtiyaç duyar. Tüm aletlerin her kullanımdan sonra sterilize edilir ve aseptik koşullarda prosedürleri boyunca korunur unutmayın.

1. Yan fare koyun.
2. Bir incisio gerçekleştirecek bölge Localizen, hasat istediğiniz LN bağlı. (Şekil 1).
3. Bu bölgeye, klorheksidin veya başka bir dezenfektan uygulayın.
4. Keskin bir makas (yaklaşık 5 mm) ön bacağını arkasında veya yanında karın arka ayak (Şekil 1) Yukarıda biriyle küçük bir kesi yapmak.
5. Eğer forseps ile kestik tüyleri temizleyin. Eğer tercih ederseniz, kesi yapmadan önce fare tıraş olabilir. Ancak, prosedür uzatır ve burada gösterildiği gibi, hem çok nadirdir iyileşme veya azalma enfeksiyon, geliştirmek değil çünkü gerekli olmadığını bulmak.
6. LN görmek için 2 forseps ile kesi gerin. Kesi 10 mm ulaşabilir. LN grimsi veya çevreleyen yağ dokusundan daha koyu görünür.
7. Bir forseps ile LN üstüne fasya (yağ ve doku kapsayan ince bir zar) sıkın ve çevre dokulara zarar vermeden hafifçe çekin.
8. Mümkün olduğunca unde ikinci forseps yerleştirinLN rneath. İlk forseps ile fasya kırmak ve LN çıkarın. Başarıyla LN hasat varsa, bir kan lekesi LN daha önce bulunduğu yerde görünmelidir. Not izotonik çözelti içinde LN lavabolar. Bu basit test size bir LN ve yağ dokusu değil ayıkladıktan doğrulamak sağlar.
9. Hiçbir kıllar yara olduğunu doğrulayın.
10. (Deri içi) bir araya cilt 2 parça yapışarak ve bir klip ile zımbalama suretiyle kesi yakındır. Biz uygulayarak forseps ile bazı Michel Klip kullanın. Kesi büyüklüğüne göre bir veya 2 klipleri yükleyin. Dokunun iyileşmesi zaman Çoğu kez, klipler düşer.

3. Ameliyat Sonrası Bakım

1. Farelerin ameliyattan sonra rahatlıkla besleyebilir böylece kafesinin alt bazı yaş gıda ekleyin.
2. Ameliyattan sonra 6 ila 8 saat, deneyim ağrı etmemelerini sağlamak için farelerin kontrol edin. Dikkatle davranışlarını (postür, yürüme, gözlemlemekkürk soydaşlarımıza ve görünümü ile teraction). Farelerin genel görünümü kötüyse, buprenorfin ikinci bir doz yönetmek. Ertesi gün farelerin buprenorfinin idaresi devam aksi takdirde normal davranışı geri kazanmak olmalıdır. Fareler daha önce belirlenen ve Hayvan Bakım Kurulu tarafından kabul bitiş ulaşmak asla. Ögüt ve hayvan bakımı vivaryum teknisyeni yardım isteyebilirsiniz.

4. Lenf Bezleri İşleme

1. Laboratuar, tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için, normal usulüne göre LN ayrışır. Biz buzlu slaytlar karşı LN basın ve rutin LN başına 1-2 x 10 ⁶ hücre elde. Alternatif olarak, RNA ekstraksiyonu için LN hazırlamak.
2. Her zamanki protokol uyarınca hücreleri Leke. Siz bekleniyor LN sitometrisi profilleri almalıdır.

5.. Temsilcisi Sonuçlar

Öne ve yan dağılım p bir örneğiÇok ameliyatla ya da bir kurban fare (Şekil 2) bir anestetize fare hasat LN için gösterilmiştir. Canlı lenfosit kapısı içinde profil ve hücrelerin yüzdesi LN cerrahi hasat hücreleri için uygun bir yöntem olup gösteren aynıdır.

Şekil 1. Kasık ve fare brakiyal LN yerelleştirme. A. inguinal LN biraz göbek doğru, sadece arka ayak üzerinde yer almaktadır. B. brakiyal LN ön bacağını arkasında yer alır.

Lenfosit Şekil 2. Flow sitometri profili LN cerrahi sonrası elde. İleri ve yana saçılım profilleri bir Anseth hasat LN için gösterilircerrahi (A) ya da bir kurban fare (B) etized fare. LN, hasat ayrışmış ve bir akış sitometresinde edildi. Canlı lenfosit kapısı hücrelerin yüzdesi gösterilmiştir.

Tartışmalar

Biz pek çok deneysel sistemler için geçerli olabilir LN cerrahi bir protokol tanımladılar. Immün yanıtlar veya bağışıklık hücre homeostazının takip etmek çok yararlı olmasına rağmen, bu tekniğin birkaç sınırlaması vardır. İlk olarak, yalnızca dört LN toplanabilirler. İkincisi, incelenen immün yanıt sistemik olabilir veya yüzeyel inguinal veya brakiyal (cilt-boşaltma) LN oluşması gerekir. Son olarak, hücreler hasat sayısı LN kaldırılması, mutlak hücre sayısı ihtiyaç duyulduğu...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Güzel Desen Premium Forseps Graefe	Harvard Apparatus	52-2144	Kesinlikle Eğri, 10 cm (4), 0.8 mm uç
Michel Klip Forseps uygulanması ve Çıkarma	Harvard Apparatus	52-3779	12.5 cm (5)
Michel Klip 100	Harvard Apparatus	52-3746	7,5-1,75 mm
Temgesic (Buprenorfin hidroklorür)	Schering-Plough
Vetalar (Ketamin hidroklorür)	Boniche Hayvan Sağlık		DIN: 01989529
Spinal anestezi (Ksilazin)	Bayer		DIN: 02169592
Izofluran	ABBOTT		DIN: 02032384
Hypotears göz merhemi	Novartis Ophtalmics		DIN: 02133288
Baxedin (izopropil alkol içinde Clorhexidine glukonat 2% 70%)	Omega	L0000017	DIN: 02251477