Farelerde γHV68 Enfeksiyon ölçümü

Özet

γ-herpesvirüslerinin (γ-HVS) ev sahibi ömür boyu kalıcılığı kurmak. Enfeksiyon γ-HV68 ile farelerin genetik çözülebilir sağlar In vivo ΓHVs ömrü / patogenezinde karakterizasyonu modeli. Bu protokol, plak oluşturan, bulaşıcı merkezi, ve qPCR deneyleri enfeksiyonu takip eden akut ve latent aşamasında γHV68 enfeksiyon tespit ve kantitatif açıklamaktadır.

Özet

γ-herpesvirüslerinin (γ-HVS) lenfoid hücrelerde ¹ latent enfeksiyonlar kurmak için yeteneklerini dikkat çekicidir. EBV ve KSHV insan olarak γ-HVS, dar ana aralığı ciddi detaylı patojenik çalışmaları engellemiştir. Murin γ-herpesvirus 68 (γHV68) hisse senetleri γ-HVS insan ve yaygın genetik ve biyolojik benzerlik murid ^kemirgenler 2 doğal bir patojen . Viral enfeksiyon farklı aşamalarında fareler kendilenmiş suşları γHV68 enfeksiyon gibi, değerlendirme sırasında viral yaşam döngüsü ve γ-HVS enfeksiyon patogenezinde anlamak için önemli bir model sağlar.

Intranazal aşılama üzerine, daha sonra dalak ve diğer hücrelere, ev ^sahibi 3,4 ömrü boyunca yeniden olabilir gizli bir enfeksiyon, akut akciğer viremi γHV68 enfeksiyonu sonuçları çözümlenir bu. Bu protokol, biz eşek plak testinin nasıl kullanılacağını anlatacağızpost-intranazal enfeksiyonu (dpi) - akciğer bulaşıcı bir virüs titresi erken evre (7 gün 5) Vero hücre mono tabakaları homojenatlarında. Akut enfeksiyon, büyük ölçüde 2 temizlenir, 3 hafta postinfection γHV68 bir latent enfeksiyon 14 dpi etrafında kurulan ve daha sonra farelerin dalak tutulur. Gizli virüs enfeksiyonu genellikle uykuda kalır ve onun gen ekspresyonu çoğu kapanır sayede enfekte dokular, hücrelerin çok küçük bir nüfus etkiler. Latent enfekte splenositlerin kendiliğinden virüs, viral gizli yükü belirlemek için bulaşıcı bir merkezi (IC) yöntemi ile değinmeyecek olabilir doku kültürü içine explanting sonra yeniden etkinleştirin. Akut ve / veya latent enfekte dokular, kantitatif real-time PCR viral genomun kopya miktarını hesaplamak için (qPCR), maksimum hassasiyet ve doğruluk için kullanılır. QPCR ve plak tahlil ve / veya IC tahlil sonuçlarının kombine analizler, viral Spatiotemporal profillerini ortaya koyacaktırin vivo çoğaltma ve enfektivite.

Protokol

Aşağıdaki protokol teorik γHV68, benzer yaşam tarzı paylaşan diğer virüsler tarafından enfeksiyona değerlendirmek için kullanılabilir farelerde γHV68 litik ve latent enfeksiyon döngüsü, virüs titreleri ve viral genomun yükler çalışma anlatacağız.

1. ΓHV68, amplifikasyon

1. 37 ° C su banyosunda γHV68 donmuş bir flakon çözülme.
2. 37 NIH3T12 veya 3T3 hücre kültürü (~% 50 confluency) 10 cm yemekleri ve kültürü enfekte olmuş hücrelerde virüs inoculums ° C,% 5 CO _2.
3. Sitopatik etki (CPE) mikroskopi, kültür inceleyin ve hücrelerin% 80 den daha büyük CPE 4 ~ 5 gün sonra enfeksiyon eklendiğinde, bir anda medya toplamak. Virüs verimi en üst düzeye çıkarmak için, enfekte hücre kültürü ile ilişkili tüm hücre γHV68 serbest bırakmak için iki kez dondurulmuş ve çözülmüş olabilir.
4. Hücre enkaz kaldırmak için toplanan medya Santrifüj için 1000 rpm'de 5 dakika oda sıcaklığında (RT).
5. Süpernatantlar yeni tüpleri (yüksek hızda santrifüj tüp) altındaki hücre enkaz dokunmadan dikkatlice aktarın.
6. 12.000 devirde yüksek hızda santrifüj (Sorvall SA-600 için) 4 ° C'de en az 1.5 saat viral parçacıkların konsantre.
7. Süpernatantlar 10γ çamaşır suyu çözeltisi içine atın ve dikkatle 1ml serum serbest DMEM pelet (virüs ve artık hücre artıkları) yeniden askıya. 1,5 ml mikro-santrifüj tüpü içine yeniden askıya pelet aktarın ve vorteks ile iyice karıştırın.
8. Kalan hücre enkaz kaldırmak ve yeni bir tüp (virüs stok) supernatant aktarmak için maksimum hızda 2 dakika boyunca santrifüjleyin. Bu enfeksiyon için son viral stoğu. Virüs stokunun titresi plak assay (aşağıya bakınız) tarafından belirlenir.

2. ΓHV68 fareler intranazal Enfeksiyon

1. 1.000 ile yaş ~ 6 hafta fareleri enfekte ~ γHV68 başına farelerin 5000 plak oluşturan birim (PFU).
2. Uyutmakketamin / xylazine (80 mg / ml ketamin ve 12 mg / ml ksilizin bir karışımı 60 ul / fare) periton boşluğuna enjeksiyonu ile fareler. Fareler ayak kısma anestezi izleyin. Genellikle ~ 5-10 dakika sürer. Fareler tamamen anestezi değilse, bu virüs hapşırık.
3. Fare tam anestezi olduğunda, yavaş fakat istikrarlı bir damla bırak farelere PBS içeren γHV68 ~ 30 ul (her bir burun deliğine 15 ul) aşılamak için bir pipet kullanın. Fare gerçekten kabarcıkları oluşturmaya çalışıyor kalmadan damla teneffüs emin olun.
4. Fareyi 10-15 dk kurtarmak ve onları kafes dönmeden önce fareler (örneğin bilinç, solunum, vb.) Refah izlemek için izin verin. Hayvanlar, gıda, su, ve yatak koşulları hastalık ve yeterliliği için günlük olarak kontrol edilir. Hastalık, ağrı veya sıkıntı klinik belirtileri ortaya çıkarsa, etyolojisini belirlemek için rutin teşhis yapılacaktır. Kendi vücut ağırlığının% 20'den fazla kaybetmek Hayvanlar maksimum ağırlık kaybı için kaydedilecektirötenazi. Ötenazi gerçekleştirmek için nihai karar klinik veteriner takdirine ve baş araştırmacısı olan aşağıdaki istişare yapılır.

3. Akut Etkilenmiş Akciğerler Virus titresi belirleme Plak Testi

1. Virüs enfektivite titreleri Vero hücreleri mono tabakaları üzerinde plak oluşumu ile belirlenir.
2. Vero hücreleri 2.5x10 ⁴ hücre / kuyu iyi plakaları 12 gün önce plak tahlil numaralı seribaşı. Hücreler eşit olarak dağıtılmış olmalıdır ve ulaşmak hücre yoğunluğu 30 -% 40 plak testinin günü.
3. % 0.5 (w / v) metilselüloz (MC) kaplama orta (Tablo 1) hazırlayın.
4. 5-7 gün sonra burun içi enfeksiyonu, akciğerlerde akut faz virüs titreleri belirlemek için γHV68-enfekte olmuş fareler Kurban. Euthanization Ketamin HCl (80-100 mg / kg SC, IM, IP) IM Na pentobarbital (30-50 mg / kg IP), intravenöz doz aşımı takip yönetilecek. Bu yöntem, t tarafından onaylanmıştırAmerikan Veteriner Hekimleri Birliği.
5. Hasat ve akciğerlere kan hücreleri çıkarmak için 1 x PBS ile iki kez yıkayın. 1 ml buz gibi komple DMEM orta akciğerlerin bir tarafı toplayın ve buz üzerinde tutmak. Hızla qPCR (aşağıya bakınız) akciğerlere viral DNA yükleri incelenmesi için -80 ° C'de, akciğerler ve mağaza diğer tarafı dondurmak.
6. Akciğer dokularında, 1 sn, donma ve çözülme üç kez maksimum hızda homojenize bir doku Homojenizatör kullanın. Örnek değiştirirken Homojenizatör her adımda% 70 etanol ile yıkayın.
7. 3.000 rpm'de 10 dakika süreyle homojenize doku Santrifüj 4 ° C Süpernatantı toplayın ve plak tayini için yeni tüplere transfer.
8. Girdap tarafından düz DMEM ile 1.5 ml mikro-santrifüj tüplerine akciğer Homojenat örneklerinin seri dilüsyonları (genellikle 10 ° 10 ^-8) hazırlayın. Önceden doldurunuz 540 ul DMEM uygun tüpleri numarası ve ilk tüp içine 60 ul Homojenat sulandırmak. I ilk tüp 60 ul transferbir sonraki, vb.
9. 12 kuyucuğu hazırlanan Vero mono tabakaları medya aspire ve yük / ters sırayla (10 ^-8 10 °) bulaşıcı virüsler içeren iyi seri seyreltilmiş Homojenat 200 ul. Her titrasyon (çift) için iki kuyu kullanın.
10. 37 virüs inoculums 1 saat Vero hücreleri inkübe ° C Her 15 dakikada bir, eşit, tek tabaka üzerinde virüs dağıtmak için plakalar yavaşça girdap.
11. Inoculums çıkarın ve 2 ml / bindirme orta (Tablo 1) ile değiştirin. 37 tabak az bir hafta süreyle inkübe ° C
12. Bindirme orta çıkartın (tam olması gerekmez) ve düzeltme / plak testinin leke orta (Tablo 1) ile değiştirin ve oda sıcaklığında en az 1 saat süreyle inkübe edin.
13. Plakalar kurutulur, her seyreltme iyi izole plakların sayısını. Hatayı en aza indirmek için, sadece 10 ve 100 plaklar arasında içeren kuyu sayılır.
14. Follo kullanarak virüs titresi hesaplayınkanat formül: titresi (pfu / ml) = [/ (/ iyi plakların sayısı) (inoculums / iyi hacmi)] x seyreltme faktörü.

4. Latent Etkilenmiş splenositlerin Virüs Yük belirleme Enfeksiyon Merkezi Testi

1. Latent viral yük Vero hücreleri tek tabaka üzerinde bulaşıcı merkezi (IC) tayini ile belirlenir. 6-kuyucuğu IC tahlil, tohum Vero hücreleri (1 - 2.5 X 10 ⁵ hücre / Biz genellikle dalak örnek başına 11 kuyu, 10 kuyu seri seyreltilmiş splenositlerin süspansiyon için kullanılan olacak ve test etmek için iyi bir gün önce donma-çözülme döngüsünden sonra virüs spontan reaktivasyon.
2. Gecikme süresi (12 - 14 gün sonra enfeksiyon) kurulduktan sonra enfekte olmuş fareler Kurban. Fare dalak ve havuz, 1 ml soğutulmuş DMEM içine Hasat.
3. Mekanik fare dalak çözülmesi. Taze izole fare dalak 10 cm tabak içine aktarın ve 10 ml% 2 FBS ile DMEM gibi istenilen orta ekleyin. Islak iki buzlu uç cam microscbuz orta yerdir slaytlar. Bir slayt nick ve diğer slayt buzlu sonu kenarı ile kapsül buzlu tarafta dalak yerleştirin. Bütün kırmızı kümeleri (eğer varsa da yağ parçacıkları kaldırmak) ezilmiş kadar mekanik iki slaytlar arasındaki dalak ayrıştırmaları.
4. DMEM ile hem slaytlar üzerinde kalan hücreleri kurtarmak için slaytlar durulayın.
5. 50 ml konik vidalı kapaklı tüp içine bir hücre süzgeç (40 mikron naylon mesh) ile tüm doku süspansiyonu yavaşça aktarın. 10 cm çanak dalak homojenatlarında içeren filtreleme ise 10 ml PBS ve transferi ile yıkayın.
6. 375 xg'de tek hücre süspansiyonları 10 dakika santrifüj ve supernatant atın. Mevcut hücre kümeleri break up hücre pelletleri Flick. 5 ml ACK tamponu (Tablo 1), kırmızı kan hücreleri lyse ekleyin. 5 dakika inkübe ve 375 x g. tekrar santrifüj
7. Süpernatantı atın ve PBS içinde yavaşça henüz iyice yeniden askıya pelet,% 2 FBS. Hücreleri, 4 ° C tutun Bir pipet kullanınvarsa pislikleri temizleyin. Canlı hücreler kullanarak bir otomatik hücre sayıcı (Bio-Rad) güvenin.
8. 4 dakika için 375 xg PBS yeniden süspanse splenositlerin dönerler. Süpernatant atın ve 4 ml tam DMEM (2 x 1 ml süspansiyon IC testi için kullanılacak hücreler tekrar süspansiyon; IC tayininde seri beş kat seyreltme için kullanılan 0,6 ml; viral DNA hazırlığı ve qPCR için 0.4 ml, ve 1 ml süspansiyon) üç donma-çözülme döngüsünden sonra latent virüs spontan reaktivasyon değerlendirmek için kullanılır.
9. Çiftleri splenositlerin süspansiyon seri beş kat dilüsyonları (yani 1 / 5, 1 / 25, 1 / 125, 1 / 250) hazırlayın. 2.4 ml DMEM ve ilk tüpe 600 ul splenositlerin süspansiyon sulandırmak ve iyice karıştırın önceden doldurunuz 15 ml konik tüpler. Sonraki tüpe bir önceki tüpten 600 ul Transferi, vb girdap etmeyin!
10. Vero hücrelerinden hazırlanan 6 sıra tek tabaka, orta aspire. Tohum 1 ml her seyreltme dupl ile Vero hücreleri üzerine seri olarak seyreltilmiş splenositlerinicated (10 kuyu, 0, 1 / 5, 1 / 25, 1 / 125, 1 / 250 dilüsyonları için kullanılır).
11. Plakalar 8-12 saat 37 ° ° C'de ve% 5 CO _2. 24 saat aşmayın. Aspire numaralı seribaşı splenositlerin süspansiyon ve her bir kuyu için 4 ml bindirme medya (Tablo 1) yüklemek. Ek bir 6 gün boyunca inkübe edin.
12. Plak tayininde gösterildiği gibi kristal viyole% 0.2 (w / v) ile tabak boyama dalak bulaşıcı merkezleri düzeylerini belirlemek.

5. Viral Genom, Niceleme

1. Bu deneyde, akciğer ve dalak örnekleri gibi γHV68 enfekte dokular, toplam genomik DNA ayıklayın. Üreticinin protokolü takip DNeasy Kan ve Doku Seti (Qiagen) kullanın.
2. QPCR tayini için kullanılan DNA aynı miktarda sağlamak için her numunenin DNA konsantrasyonu belirleyin. Tasarım virüs spesifik primerler (~ 200 bp Amplikon qPCR testi için tercih edilir). ΓHV68 ORF56 spesifik primerler (ileri astar kullandı: Biz 5 ve prime - GTAACTCGAGACTGAAACCTCGCAGAGGTCC - 3 '; ters astar: CCGAAGCTTGCACGGTGCAATGTGTCACAG 5'-3') bu tahlil ve β-aktin primerler (ileri astar: 5'-cacccacactgtggcccatcat-3 'ters astar: 5'-gtgaggatcttcatgaggtagtc 3') qPCR reaksiyon için bir denetim.
3. (- 500 ng 100) ve 2 x SYBR master miks (Bio-Rad iQ SYBR Green Supermix) uygun primerler DNA örneği karıştırın. Bio-Rad Real-Time PCR sistemi enfekte dokularda viral yükü ölçmek için kullanın. Aşağıdaki koşul PCR yapın: 15 dakika ve 45 döngüleri 95 - 95 ° C ° C, 30 dakika 60 ° C için 30 dakika ve 72 ° C 30 dakika, viral ve her ikisi de, erime eğrisi analizleri ile takip aktin amplikonlarının.
4. Viral genomların ölçümü için bir standart eğri olması, enfekte olmamış hücrelerden izole edilen genomik DNA ile γHV68 bacmid DNA bilinen miktarlarda seri sulandırmak için. Enfeksiyon alınan DNA'lar ile paralel olarak qPCR çalıştırınTed virüs spesifik primerler aynı setleri kullanarak dokular.
5. Aktin normalleşme sonra genomik DNA birim başına viral DNA kopya sayısı (örneğin 100 ng veya 500 ng) gibi dokularda viral genom yük sunun.

6. Temsilcisi Sonuçlar:

Şekil 1 genel şeması γHV68 enfeksiyon farelerde in vivo olarak ölçmek için deneyler gösteriyor. Şekil 2A plak yöntemi ile belirlenen γHV68, akut enfeksiyon sırasında akciğerlerde virüs titreleri Temsilcisi sonuçlar gösterilmiştir. Içeren γHV68 bir mutant suşu fonksiyonel olmayan viral Bcl-2, 7 gün BALB / c farelerde (grup başına 6 - 7 fareler) intranazal enfeksiyon sonra akciğerlerde yabani tip γHV68 karşılaştırılabilir seviyelerde çoğaltılır (vBcl 2). Virüs akciğer titreleri iki grup arasında istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar tespit edildi. Bu veri vBcl-2 γHV68 akut enfeksiyon için önemli bir faktör olmadığını gösterirfareler. Ancak, 28 gün postinfection, dalak vBcl-2 mutant virüs titresi 6 düştü - 10 kat WT, bulaşıcı merkezi assay (Şekil 2B) ile ölçülen ile karşılaştırıldığında, öne vBcl-2 mutant γHV68 virüs , enfeksiyon sonrası splenik gecikme bakım arızalı. Azaltılmış bulaşıcı merkezi titreleri ile anlaşma, vBcl-2 mutant virüs viral genomun yükü ciddi Şekil 2C gösterildiği gibi tekrarlanan deneylerde 28 gün WT virüsler, kıyasla azalmıştır. Enfeksiyon latent aşamada latent-HV68vBcl-2 mutant virüs reaktivasyonu ex vivo viral genomun yükler ve sıklığı arasında yakın bir ilişki, bu mutant virüs enfeksiyonu bir gecikme kusur vurgulamaktadır .

Şekil 1 plak oluşumu sayesinde, bulaşıcı merkezi ve qPCR tahlil farelerde γHV68 enfeksiyon ölçümü için şematiks

Şekil 2, in vivo WT ve mutant γHV68 virüs Parçalayıcı ve latent infeksiyon . 7 dpi (günlük yazılan enfeksiyonu) BALB / c farelerde akciğerlerde WT ve mutant vBcl-2 γHV68 virüsleri akut çoğaltma (A) plak yöntemi ile tespit edildi. Dalak bulaşıcı merkezleri (B) ve enfekte farelerde dalak viral genomun yük (C) (B ve C), sırasıyla, 28 dpi çözünürlükte, bulaşıcı merkezi tahlil ve qPCR tarafından ölçüldü. Kırmızı çizgiler, belirtilen değerlerin ortalamaları. NS, anlamlı değil.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

γHV68 yaygın insan γ-HVS ^2,4,5 patogenezinde anlamak için bir model olarak kullanılmıştır. Bu protokol, farelerde intranazal aşılama sonrası γHV68 akut ve latent enfeksiyon değerlendirmek, plak için bulaşıcı bir virüs titresi tahlil, viral gizli yük için IC tahlil ve viral genomun yük için qPCR olmak üzere üç rutin olarak kullanılan yöntem tanımlanmıştır.

Plak testi, enfekte olmuş hücrelerde ya da dokularda virüs titresi belirlemek için yaygın o...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Malzeme Adı	Hazırlama Prosedürü
Viral plak testi için Metilselüloz (MC) bindirme orta	Isı ~> 80 TC şişede 250 ml distile su ° C (mikrodalga fırında 3 dakika kaynar) Eriyene kadar kısık ateşte karıştırarak sıcak su içine yavaş yavaş 2.5 g MC tozu ekleyin. Sıvı döngüsü az 15 dakika boyunca hemen Otoklav. 4 ° C gecede otoklavlanmış MC medya karıştırmaya devam edin. 2 200 ml ile 250 ml MC medya birleştirin x MEM (Gibco-BRL) + 500 ml bindirme medya vermek için 50 ml FBS.
Düzeltme / plak testi için orta leke	% 0.2 (w / v)% 20 etanol içinde kristal viyole.
ACK Lizis Tamponu	NH 4 Cl 0.15m, KHCO 3 10mM EDTA 0.1mm
Komple DMEM	Dulbecco'nun modifiye Eagle orta2 mM L-glutamin, ve% 1 penisilin-streptomisin (Gibco-BRL) (DMEM)% 10 fetal sığır serumu (Invitrogan FBS) ile desteklenmiştir.

Reaktifi Adı	Şirket	Katalog numarası
Ketamin	Sigma-Aldrich	K2753
Xylazine	Sigma-Aldrich	X1251
Metilselüloz	Sigma-Aldrich	M0512-250g
2 x MEM	Yaşam Teknolojileri	11935
Hücre süzgeç	BD Faclon	352340
Omni doku homojenizatör	OMNI Uluslararası	TH115
DNeasy Kan ve Doku Seti	Qiagen	69504
iQTM SYBRH Yeşil Supermix	BioRad	170-8882
CFX96 real-time PCR sistemi	Bio-Rad	184-5072
Hücre sayıcı	Bio-Rad	145-0001
Sorvall SA-600	Thermo Scientific	096-124022