Kök Hücreler Ferumoxytol, FDA Onaylı Demir Oksit Nanopartikül Etiketleme

Özet

Biz, FDA onaylı, süperparamanyetik demir oksit (SPIO), ferumoxytol (Feraheme) ile kök hücre etiketleme ve izleme için kullanılan bir tekniktir açıklar. Hücresel görüntüleme tekniği, manyetik rezonans görüntüleme (MR) görüntüleme için kullanır Bu, başarılı ya da başarısız hastalarda kök hücre engraftments uzun vadeli izleme ve teşhis için kolay erişilebilir.

Özet

Kök hücre temelli tedaviler rejeneratif tıp alanında önemli bir potansiyel sunmaktadır. Ancak, çok nakledilen hücrelerin in vivo kinetiği ile ilgili olarak anlaşılmalıdır kalır. In vivo olarak nakledilen kök hücrelerin arka arkaya izlemek için bir non-invaziv yöntem, araştırmacılar kök hücre nakli doğrudan izlemek için izin ve başarılı veya başarısız engraftman sonuçların belirlenmesi .

Kök hücrelerin geniş bir yelpazede sayısız uygulamalar için soruşturma devam ediyor. Insan embriyonik böbrek, 293 (HEK293) hücreler, insan mezenkimal kök hücreler (hMSC) ve uyarılmış pluripotent kök (iPS) hücreleri: Bu protokol, 3 farklı kök hücre popülasyonlarının üzerinde duruluyor. HEK 293 hücreler makaslanmış adenovirüs 5 DNA kültür yetiştirilen insan embriyonik böbrek hücreleri elde edilir. Bu hücreler kolayca kültüre, çünkü araştırma yaygın olarak kullanılan, hızlı büyümek ve kolayca transfekte. hMSCs yetişkin kemik iliği bulunur. Bu hücreler ca,multipotency veya sınırlı sayıda hücre kaderi içine ayırt etmek için potansiyel korurken n farklılaşmamış hücreler olarak çoğaltılan. hMSCs osteoblastlar, adipositler, kondrosit, tendon, kas ve kemik iliği stroma içeren mezenkimal doku, soy ayırt edebilirsiniz. iPS hücreleri, genetik, genler ve benzeri faktörler, embriyonik kök hücreleri tanımlayan özellikleri ifade etmek için değiştirilmiş yetişkin hücreler reprogrammed. Bu hücreler, tüm hücre ^soyları 1 içine ayırt etmek için kapasitesine sahip pluripotent anlamı vardır . Her iki hMSCs ve iPS hücreleri, doku yenileyici kapasitesi in vivo göstermiştir .

Süperparamanyetik demir oksit (SPIO) nanoparçacık hücre etiketleri kullanımı ile birlikte manyetik rezonans (MR) görüntüleme yakın mikroskobik anatomik çözünürlük nedeniyle kök hücrelerin in vivo takibi için etkili olduğu kanıtlanmıştır, bu yarı-ömrü daha uzun bir kan uzunlamasına görüntüleme ve izin yüksek sensitivity SPIO MR tarafından sağlanan hücre tespiti için ^2-4 nanopartiküller. Buna ek olarak, SPIOs kullanımı ile MR görüntüleme klinik olarak çevrilebilir. SPIOs bioreactive demir çekirdek plazma bileşenleri içeren hizmet veren bir dekstran, carboxydextran veya nişasta yüzey tabakası ile demir oksit çekirdek oluşur. Bu ajanlar, T2-ağırlıklı MR ^{görüntüleri} 5 bir azalma sinyal yol yerel manyetik alan homojen olmayan düzensizlikleri oluşturun . Ne yazık ki, SPIOs artık üretilmektedir. İkinci nesil ultrasmall SPIOs (USPIO), ancak, bir alternatif sunuyoruz. Ferumoxytol (FerahemeTM) polyglucose sorbitol carboxymethylether kat ile çevrili olmayan bir stokiyometrik manyetit çekirdek oluşan bir USPIO. Ferumoxytol kolloidal, parçacık boyutu, ışık saçılması tarafından belirlenen 17-30 nm. Molekül ağırlığı 750 kDa ve 2T MR alanında sabit relaksivite 58,609 mM-1 sn-1 gücü ^4. Ferumoxytol yakın zamanda FDA onaylı bir, böbrek ^yetmezliği 6 olan hastalarda demir eksikliği tedavisi için bir demir takviyesidir . Grubumuz, bu ajan uygulanan hücre etiketleme uygulamaları için "off label" kullanım vardır. Bizim teknik, MR görüntüleri etiketli hücrelerinin önemli MR sinyali etkilere yol açar ferumoxytol ile kök hücreleri etkin bir etiketleme göstermektedir. Bu teknik, kök hücre tedavileri, klinik öncesi ve klinik ortamlarda non-invaziv izlenmesi için uygulanabilir.

Protokol

1. 1. Gün

1) Plaka hücreleri

1. Etiketleme için en az 18-24 saat önce T75 confluency 80% balonuna Plaka hMSC. Alternatif gemiler için talimat için Tablo 1'e bakınız.

2. 2. Gün

2) etiketleme çözümü hazırlayın. Bu preparat, 400 mikrogram Fe / ml 'lik bir konsantrasyon ile% 80 confluency az bir (1) T75 şişesi etiketi. Alternatif gemiler için talimat için Tablo 1'e bakınız.

1. 15 ml konik boru: 1 ml serum özgür medya ve 93.1 ul ferumoxytol (30 mg / ml hisse senedi) karıştırarak bir çözüm (solution 1) oluşturun.
2. Ikinci bir 15 ml konik tüp: Serum özgür medya ve protamin sülfat 7 ul (10 mg / ml hisse senedi) 1 ml karıştırılarak ikinci bir çözüm (çözüm 2) oluşturun.
3. Her çözüm 5 dakika dinlenmek için izin verin.
4. Çözüm 1 ve 2 birlikte ekleyin. Yeni etiketleme çözümü yavaşça karıştırın. 5 dakika dinlenmek için çözüm USPIO-pro izin için izin verbronşial histamin sülfat kompleksleri oluşturur.
5. SPIO / son bir hacim 7 ml protamin sülfat çözeltisi karışık 2 ml 5 ml serum ücretsiz medya ekleyin.

3) etiketlenmesi için hücreleri hazırlayın

1. Hücrelerden medya aspire.
2. Önceden ısıtılmış Mg / Ca-ücretsiz D-PBS veya serum ücretsiz medya 2-3 ml kontrast madde alımı ve etiketleme verimliliği bozabilecek artık serum proteinlerinin ve diğer medya bileşenleri nazikçe yıkayın hücreleri bir kez yıkayın. Durulama sıvısı aspire.

4) Etiket hücreleri

1. Hücreler için çözüm etiketleme tam 7 ml ekleyin.
2. Bir inkübatör (37 ° C /% 5 CO ₂₎ ve hücrelerin, 4 saat boyunca etiketleme çözümü inkübe izin icine koyun hücreleri .
3. % 10 son bir serum konsantrasyonu elde etmek için FCS 700 ul hücrelerin etiketleme çözümü ekleyin. Serum hücreleri alışkın olan zenginleştirilmiş ortam yeniden kurmak için, ve mil yardımcı olmak için eklenirani bir kayma serum serbest bir ortamda 24 saat maruz kalma hücre ölümüne neden olabilir nimizing.
4. Hücreleri etiketleme çözümü ile ek bir 20 saat süreyle inkübe izin ver.

3. 3. Gün

5) işaretli hücrelerin hazırlayın

1. Etiketleme çözümü hücreleri aspire.
2. Önceden ısıtılmış Mg / Ca-ücretsiz D-PBS 2-3 ml hücreleri nazikçe yıkayın. PBS aspire. Bu ücretsiz PBS-Mg / Ca, Mg ve Ca sonraki adımda tripsin verimliliğini olumsuz olarak kullanmak önemlidir.
3. Hücrelerin% 0.05 tripsin önceden ısıtılmış 2 ml ekleyin ve balon balonun tüm yüzey sağlamak için ileri ve geri eğim tripsin ince bir tabaka ile kaplıdır. Hücrelerin bir inkübatör (37 ° C /% 5 CO ₂₎ yerleştirin ve hücreleri plaka ayırmak alıncaya kadar hücreleri veya 5-7 dakika dinlenmek için izin. Bu mikroskop altında dekolmanı onaylamak için gerekli olabilir. Yavaşça gerekirse fa balonun iki dokununhücre yüzeyi dekolmanı cilitate.
4. Tripsin nötralize etmek için balona 4 ml önceden ısıtılmış eksiksiz bir medya ekleyin. Hafifçe birkaç kez tripsin / medya / hücre çözümü yukarı ve aşağı pipetleme şişeyi çalkalayın. 15 ml konik bir tüp içinde tüm çözüm toplayın. 5 dakika boyunca 400 RCF hücre çözümü santrifüjleyin.
5. Hücre pelletini bozmadan süpernatantı dikkatlice aspire. Medya 5 ml (serum içeren veya serum) hücrelerin tekrar 5 dakika boyunca 400 RCF hücre çözümü santrifüjleyin.
6. Adım 5.5 'de açıklanan hücre yıkama tekrarlayın. Toplamda, hücreler üç kez medya ve hücre yüzeyinde kalan, ücretsiz kontrast madde kaldırmak için durulanır olacaktır.
7. Hücreleri önceki yıkama esnasında kaybolacak gibi, en doğru hücre sayısını elde etmek için, bu noktada hücreleri güvenin. Bir hücre canlılığı testi yapın. Hücreler artık bir sonraki analiz ya da deneysel uygulama için hazır. MR görüntüleme ve T1-w ile yapılabilir T2-w parametreleri, ferumoxytol T2-w kontrast madde olmasına rağmen, çünkü ferumoxytol de T1 etkileri sergiler. Görüntü ferumoxytol etiketli hücreler için kullanılabilir Temsilcisi T2-w MR parametreler şunlardır: 60-80 ms 2000-2500 ms ve TE TR FSE veya SE_Multislice dizileri. T1-w bir görüntü elde etmek için, FSE TE değeri veya SE_Multislice dizisi azaltmak veya yüksek TR ve TE düşük GRE dizisi kullanmak. Şekil 4, in vivo uygulama etiketli kök hücre görüntüleme için önemli bir potansiyel göstermektedir .

4. Temsilcisi Sonuçlar:

Etiketli hücreleri T2 ağırlıklı MR görüntülerinde önemli koyulaşması veya negatif kontrast etkisi ve T1 ağırlıklı MR görüntülerinde bir parlatma veya pozitif kontrast etkisi (Şekil 2) göstermektedir. Boyuna MR ve canlılık testleri, 5 gün etiketleme anlamlı MR sinyal ve etiketsiz denetimleri (veriler gösterilmemiştir) ile karşılaştırıldığında canlılığı üzerinde anlamlı bir etkiye gösterdi yapıldı.

jove_content "> Etiketli kök hücreler daha sonra çeşitli hücre tipleri ayırt edilmesini veya intravenöz in vivo soruşturma enjekte .

Şekil 1, kök hücreler, demir oksit nanoparçacık, ferumoxytol etiketlenmesi için şematik zaman çizgisi.

Şekil 2. hücre pelletini hücreleri ile sagittal kesitte thrrough Eppendorf tüpleri MR görüntüleri. A) Etiketsiz kontrolleri. B) veya negatif kontrast madde etkisi önemli bir T2 T2 ağırlıklı FSE SE_Multislice görüntüleme ve T1 ağırlıklı GRE sekansında T1 ya da pozitif bir kontrast madde etkisi gösteren Etiketli hücreleri.

Şekil 3 Eppendorf tüpleri hücreleri ile hücre pel sagittal kesitlersağlar. Az 10.000 ferumoxytol etiketli hücreleri, T2-w MR ile tespit edilebilir.

Şekil 4 ferumoxytol etiketli kök hücrelerin MR görüntüleme fare serebral ventriküller içine enjekte. A) Aksiyel hiçbir USPIO etiketli kök hücre enjeksiyonu ile fare Barin, MR görüntüsü. B) Koronal Aksiyal, C), ve D) sagital MR görüntüleri bir fare beynine enjekte USPIO etiketli kök hücreler (beyaz ok) T2, negatif kontrast etkisi gösteren.

Tablo 1. alternatif damarlarında hücrelerin etiketlenmesi için Miktar adaptasyonlar.

Tartışmalar

Kök hücre engraftments etkinliğini artırma rejeneratif tıbbın ilerlemesi için kritik öneme sahiptir. In vivo kök hücreleri için bir non-invaziv görüntüleme tekniği önemli ölçüde başarılı engraftman sonuçlara yol açan mekanizmaları anlamak için yeteneğimizi artırır. Manyetik etiketleme için prosedür olarak ortaya koyduk MR görselleştirme, MR görüntüleme ile kök hücrelerin in vivo takibi sağlar. Manyetik etiketli kök hücreleri hedef dokulara daha önce nakledilen ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktifi Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar (isteğe bağlı)
D-MEM Yüksek Glikoz	Sigma	D5648	Kullanılmak istenen kök hücre hattı veya diğer taban orta
D-PBS (Ca + +, Mg + + ücretsiz)	Gibco	14190-144
Tripsin-EDTA% 0.05	Invitrogen	25300-120
Fetal sığır serumu (FBS)	Hyclone	SH30071.03
Ferumoxytol (Feraheme)	AMAG	59338-0775-01
Protamin Sülfat	APP Ecz.	22930