Büyüme Faktörü Progranulin ile etkileşimde Proteinler tanımlamak Modifiye Maya-İki Hybrid Sistemi

Özet

Biz geleneksel maya iki-hibrit taraması, protein etkileşimleri tanımlayan genetik etkili bir aracı olarak var. Bu değişiklik, sürecin belirgin kısaltır, iş yükünü azaltır ve en önemlisi, yanlış pozitiflerin sayısını azaltır. Buna ek olarak, bu yaklaşım, güvenilir ve tekrarlanabilir.

Özet

Granulin epithelin habercisi (GEP) olarak da bilinen Progranulin (PGRN), 593 amino asit otokrin büyüme faktörü. PGRN dahil olmak üzere, çok çeşitli fizyolojik ve hastalık süreçleri erken embriyogenez, yara iyileşmesi ^1, inflamasyon ^{2, 3,} ve ⁴ konak savunmasında kritik bir rol oynadığı bilinmektedir. Nörotrofik faktör ⁵ ve kısmi PGRN protein neden frontotemporal demans ^{6, 7} kaybı ile sonuçlanan PGRN gen mutasyonları gibi PGRN fonksiyonlar. Son çalışmalar, kıkırdak gelişimi ve ^bozulması 8-11 için önemli bir düzenleyici olarak PGRN izolasyonu yol açmıştır . PGRN, yaklaşık iki yıl önce keşfetti rağmen, birden fazla fizyolojik ve patolojik koşullar PGRN eylemleri istismar ve ilgili mekanizmaları anlamak için çabalarını önemli ölçüde bağlayıcı reseptör (ler) tespit edilememesi nedeniyle engellense de önemli roller oynamaktadır. Bu sorunu gidermek için modifiye geliştirdiğı maya iki hibrid (MY2H) en sık kullanılan GAL4 tabanlı 2-hibrid sistem tabanlı bir yaklaşım. Konvansiyonel maya iki hibrit ekran ile karşılaştırıldığında, MY2H ekran sürecini önemli ölçüde kısaltan ve yanlış pozitif klonların sayısını azaltır. Buna ek olarak, bu yaklaşım, güvenilir ve tekrarlanabilir ve bu sistemin başarıyla iyon kanal ^12, ekstrasellüler matriks protein ^{10, 13,} ve ¹⁴ büyüme faktörü de dahil olmak üzere çeşitli yemler bağlayıcı proteinlerin izole istihdam. Bu çalışmada, bu MY2H deneysel işlemin bilinen ilk PGRN-ilişkili reseptör ^{14, 15} olarak TNFR2 tanımlanmasına yol açan bir örnek olarak PGRN kullanarak ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.

Protokol

1. Arka plan bilgileri

Maya iki hibrid sistemi, protein-protein ^{etkileşimleri 16,} 17 keşfetmek için kullanılan güçlü bir genetik tekniği . 2-hibrit sistemler, Lexa tabanlı sistemler, Sos İşe Alım Sistemi ve bakteri ya da memeli hücre tabanlı 2-hibritlerin gibi birkaç çeşit ticari, bu yazıda özellikle en yaygın olarak kullanılan GAL4 esaslı değişiklikler üzerinde duruluyor maya 2-hibrid sistemi. Kısaca, yöntemi, DNA-bağlayıcı ve transkripsiyonel aktivasyon sorumlu ayrılabilir etki oluşur maya GAL4 protein özelliklerine dayanır . Av proteinler GAL4 aktivasyon etki alanı (AD) füzyonlarını olarak ifade edilir yem protein, DNA-bağlayıcı GAL4 etki alanı (DNA-BD) bir füzyon olarak ifade edilir. Yem ve av füzyon proteinleri arasındaki etkileşim, maya g entegre muhabiri genleri içeren GAL4 bağlayıcı siteleri transkripsiyonel aktivasyonlar yol açarenome. Y2H ilkesi Şekil gösterilmiştir. Şekil 1 ve deneysel prosedür özetlenmiştir. 2.

2. Gerekli malzemeler ve çözümler

1. YPD Büyüme Orta (Saccharomyces cerevisiae suşlarının çoğu yetiştirmek için en uygun oranlarda bir pepton karışımı, maya özü, ve dekstroz).
2. Minimum SD Bazlar (Minimal sentetik tanımlı (SD) bazında bir maya azot baz, amonyum sülfat ve karbon kaynağı, dekstroz içerir. Dropout (DO) takviyeleri belirtilen olmayan bir sentetik, tanımlanan orta yapmak için minimum SD Base eklenebilir besinler).
3. Leu / Trp Dropout (DO) takviyesi (lösin ve triptofan hariç her esansiyel amino asit içeren)
4. -His/-Leu/-Trp/-Ura Dropout (DO) Eki (lösin, triptofan, histidin ve urasil hariç her esansiyel amino asit içeren)
5. Luria Broth (LB) (Tripton 10 g / L, maya özü 5 g / L NaCl 5 g / L)
6. X-Gal (5-bromo-4-kloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) çözüm: N 20 mg / ml stok solüsyonu, N-Dimethylformamide olarak hazırlanan
7. 10X TE (100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM EDTA, otoklava)
8. Sonicated Herring veya Somon Sperm DNA, haşlanmış (10 mg / ml)
9. 10X LiAc (1 M lityum asetat, otoklava)
10. % 50 PEG-3350 çözümü, filtre ile sterilize edilmiş
11. 3-Amino-1, 2, 4-Triazole (3AT)
12. Kanamisin
13. Ampisilin
14. ELECTROMAX DH5α hücreleri
15. Z buffer: 16,1 g Na2HPO4 7H2O (veya 8.52 g susuz), 5.5 g NaH2PO4 H2O (veya 4.8 ganhydrous), 0.75 g KCl, 1 L otoklavlanmış, damıtılmış su içinde çözünmüş ve ayarlanabilir 0.246 g MgSO4 7H2O (veya 0.12 g susuz), pH değeri 7.0.

3. Bait nesil (pDBLeu-PGRN)

Sinyal peptid (aa21-588) yoksun bir cDNA parçası kodlama PGRN yönde pDBLeu vektör Sal I-I siteleri (ProQuest iki hibrid sistem, Invitrogen) klonlandıGAL4 DNA Cilt Alan aynı çeviri okuma çerçevesini oluşturmak için pDBLeu-PGRN tutmak.

1. Kare füzyon izin kısıtlama siteleri (3'end Sal 5'end I ve ben) içerecek şekilde tasarlanmış oligonükleotid primerler kullanılarak PCR ile yukarıda açıklanan PGRN cDNA parçası artırın.
2. Jel PCR ürünü arındırmak, kısıtlama ile sindirimi Sal I ve I. endonükleaz
   Aynı kısıtlama endonükleazları ile çift sınırlama sindirim DB vektör pDBLeu hazırlayın.
3. Lineerleştirilmiş pDBLeu vektör içine kısıtlama PGRN parçası bağlanır ve LB için seçim ile DH5α dönüşme + kanamisin 25 mg / ml.
4. DNA dizi yapı düzeltme olun.

4. Küçük ölçekli dönüşüm plazmid yem

1. 30 geceleme sallamak Mav203 (Invitrogen) bir koloni ile 5 ml YPD İnokülasyon ° C
2. YPD 50 ml gecede kültür sulandırınız. Grow bir eklentiitional 2-4 saat.
3. RT az 5 dakika 3000 rpm'de Pelet hücreleri. Pelletini tekrar otoklavlanmış, distile su 40 ml.
4. Re-pelet hücreleri. Ben, RT 10 dakika inkübe çözüm 2 ml süspanse edin.
   Çözüm: 0,5 ml 10xLiAc, 0.5 ml 10xTE, 4 ml H ₂ O
5. PDBLeu-PGRN 2-3 ul (0.25μg/μl) ve denatüre, makaslanmış somon sperm DNA (10μg/μl) 10 ul: tüplere DNA koyun. 100μl maya hücreleri ekleyin, iyice karıştırın.
6. 700μl çözüm II ekleyin, iyice karıştırın. 30 ° C'de 30 dakika inkübe. Çözüm II: 0.2 ml 10xLiAc, 0.2 ml 10xTE, 1.6 ml% 50 PEG3350.
7. Isı şoku 42 ° C de 15 dk.
8. Pelet için 2 dk. Süpernatantı atın. 200 ul otoklavlanmış, distile su pelletini tekrar.
9. SD-Leu plakalar üzerine seri dilüsyonları süspansiyon plaka. Plaka için 30 ° C'de 2-3 gün inkübe edin.

5. Bait doğrulama

Yea performans önceself-aktivasyonu için st iki-hibrit ekran, testi pDBLeu-PGRN ve bazal HIS3 muhabiri gen ekspresyon düzeyleri belirler. Bu test yemler transkripsiyon aktive olup olmadığını ve kendini etkinleştirme inhibitörleri ile nötralize edilebilir olup olmadığını belirler. 3-Amino-1, 2, 4-triazol (3-AT) HIS3 gen ürünü bir rekabet inhibitörüdür ve HIS3 ifade histidin eksikliği medya büyüme için gerekli minimum düzeyde titre için kullanılabilir.

1. Maya Mav203 zorlanma, plaka SD-Leu plakalar üzerine dönüşüm içine pDBLeu-PGRN Dönüşümü, ve 48-72 saat boyunca inkübe 30 ° C
2. Üzerine otoklavlanmış kürdan kullanarak her dönüşüm Patch koloniler SD-Leu-3-AT 10 mM konsantrasyonları içeren plakalar, 25 mM, 50 mM, 75 mM ve 100 mM. -AT 3 HIS3 enzim ve sadece kendini etkinleştirme gösteren yemler rekabetçi bir inhibitörü 3-AT varlığı büyümeye mümkün olacak.
3. Plakalar containi yetişen Bait suşları3-AT ng 100 mM iki hibrid ekran kullanımı için uygun değildir. Kullanılabilecek yemler için, hücre büyümesini engeller konsantrasyon-AT 3 düşük kullanın. Birçok durumda, 3-AT 25 mM tarama için kullanılır.

6. cDNA kütüphanesi taraması

Plazmid pDBLeu PGRN yukarıda açıklandığı gibi küçük ölçekli bir dönüşüm kullanarak MaV203 içine tanıtıldı. MaV203 (pDBLeu-PGRN) içine pPC86-kütüphane (Invitrogen) tanıtmak için, aşağıda açıklanan prosedür genellikle plazmid kütüphane DNA 0.5 mikrogram ile ~ 4 x 10 ⁴ koloni verir. Bu nedenle, 2.5 x 10 ⁶ maya transformants ~ 30.0 mikrogram pPC86 cDNA kütüphanesi plazmid DNA, 25 dönüşümler, ve 10 cm elli levhalar (SD-Leu-Trp AT-His-Ura 3) gerekecektir.

1. AT plakaları (50 aşağıdaki prosedürü), 10 cm SD-Leu-Trp-His-Ura 3 uygun sayıda hazırlayın. Ayrıca transformants sayısını tahmin etmek için en az dört adet 10 cm SD-Leu-Trp plakaları hazırlamak.
2. Içine kütüphane DönüşümüMaV203 pDBLeu-PGRN içeren prosedüre göre aşağıda açıklanmıştır.
   1. ~ 100μl otoklavlanmış, distile su içinde MaV203 birkaç izole koloniler (pDBLeu PGRN) askıya alma ve 10 cm SD-Leu plaka üzerine yayıldı. SD-Leu ikinci bir plaka için prosedürü tekrarlayın. Iki tabak inkübe 18-24 saat süreyle 30 ° C
   2. Kazıyın ve 10 ml otoklavlanmış, distile su hücreler tamamen askıya. OD ₆₀₀ ~ 0.1 vermek için 500 ml'lik bir şişe sıvı YPD orta hücre süspansiyonu yeterli hacmi ekleyin.
   3. OD, aşılama sonrası ~ 0,1 olduğunu doğrulayın.
   4. OD ₆₀₀ ~ 0.4 ulaşır ° C kadar 30 çalkalayın.
   5. Taze hazırlayın:
      1. 110 ml, 11 ml 10X TE, 10X LiAc 11 ml, 88 ml otoklavlanmış su birleştirerek 1X TE / LiAc.
      2. 1.6 ml 10X TE, 1.6 ml 10X LiAc ve 12.8 ml% 50 PEG-3350 birleştirerek 16 ml PEG / LiAc.
   6. Pelet oda sıcaklığında 5 dakika 3000g hücreleri.
   7. T atıno süpernatantlar ve yavaşça oda sıcaklığında 100 ml otoklavlanmış, distile su, yukarı veya aşağı pipetleme ve pelet tekrar süspansiyon haline getirin.
   8. 3000 g oda sıcaklığında 5 dakika boyunca santrifüjleyin.
   9. Santrifüje hücrelerinin süpernatant atın ve 50 ml 1X TE / LiAc çözüm hücre pelletini tekrar süspansiyon.
   10. 3000 g oda sıcaklığında 5 dakika boyunca santrifüjleyin.
   11. Süpernatantlar çıkarın ve nihai hacmi 2.5 ml 1X TE / LiAc çözüm pelet tekrar süspansiyon.
   12. 25 dönüşümler yapın. 2.5 ml hücreleri, denatüre 125 ul (10μg/μl), somon sperm DNA makaslanmış, ve 30 mikrogram cDNA kütüphanesi birleştirin. Pipetleme ve aşağı yavaşça karıştırın. 15 ml PEG / LiAc çözüm ekleyin ve hafifçe karıştırın. 25 içine kısım 1.5 ml her 700 ul mikrosantrifüj tüpler otoklava.
   13. 30 ° C su banyosunda 30 dakika inkübe edin.
   14. 42 ° C su banyosunda 15 dakika ısı şoku.
   15. Oda sıcaklığında 1 dakika için 6.000 g santrifüjleyin. Dikkatle süper kaldırmakyüzen. Yavaşça yukarı ve aşağı pipetleme tarafından 400 ul otoklavlanmış, distile su her pelletini tekrar.
3. Plaka üzerine her dönüşüm tek bir 10-cm SD-Leu-Trp-His-Ura 3 AT (3AT konsantrasyonu: 25 mM) 200 ul dönüşüm karışımı bir yayılma çubuğunu kullanarak plakaları, 25 1.5 ml mikrosantrifüj tüpler 50 plaka yapabilirsiniz otoklava (SD-Leu-Trp-His-Ura 3 saat).
4. 5-10 gün 30 ° C inkübe plakalar
5. SD-Leu-Trp plaka kaplama; reaksiyon dönüşüm verimliliği, tek bir reaksiyon (1:400 ve 1:4000 01:40) seri dilüsyonları tahmin etmek için. 3 gün 30 ° C, kolonilerin sayısı ve toplam sayısı hesaplanır transformants için kuluçka.

7. X-gal tahlil

1. YPD plaka koloniler Transfer inkübe 30 ° C gecede.
2. YPD plaka üzerine yerleştirin Selülozik zarı yuvarlak, membran ve YPD plaka arasında hava kabarcığı olmadığından emin olun. 1-2 sonra min, make emin tüm koloniler membranlar (nitroselüloz kağıt) aktarılır.
3. Alüminyum folyo kağıdı ile yapılan tekne membran koloni tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirin.
4. Sıvı azot içine membran koyun, birkaç dakika için sıvı nitrojen içine yirmi saniye ve batığın bekleyin.
5. Çözülme membran dışarı atın.
6. Bu arada aşağıdaki reaktif karışımı:
   1.5ml Z buffer
   20μl X-gal (20 mg / ml)
7. Z buffer / petri X-gal, bunun üstüne Vatmanlar kağıt bırakın.
8. Nitroselüloz kağıt Vatmanlar kağıt üstünde dikkatlice yerleştirin.
9. Mavi koloniler görünür kadar 37 ° inkübe edin.

8. Retransformation tahlil

Kütüphane tarama izole Prey füzyon proteinleri (AD-Y) rapor genleri ikna etmek için yem füzyon proteini (DB-X) ile etkileşimi daha fazla yanlış pozitif ortadan kaldırmak ve eklemek kolaylaştırmak korumak, ve av klonlar ve yem retransformation maya içine inşaitional analizi.

1. Potansiyel etkileşen proteinleri içeren maya suşlarının plazmid DNA izole edin.
2. E. coli DNA Dönüşümü DH5α hücreleri, LB plaka dönüşümler 100 mcg / ml ampisilin plakaları seçici pPC86 cDNA kütüphanesi izole ve 37 ° gece inkübe ° C
3. LB 100 mikrogram / ml ampisilin suyu koymak için plaka birçok koloniler seçin.
4. Sal ve I. değil ile çift kısıtlama analizi ile miniprep DNA hazırlanması ve incelenmesi
5. Co-plazmid yem ve yem plazmid MaV203 haline dönüştürmek, plaka SC-Leu-Trp plakalar üzerinde dönüşüm karışımlar, 2-3 gün 30 ° C inkübe
6. SC-Leu-Trp plaka üç farklı koloniler haberleri, X-gal Testi gerçekleştirin.

9 - Sıralama ve biyoinformatik analizi

Sırası olasılıkla gerçek pozitif klonların izole edilmiştir plazmid DNA BLA kullanarak GenBank bu dizileri karşılaştırmakST programı ve bilinen genlerin karşılık gelen bu iki melez klonları tanımlamak. Sıralama verileri yukarıda elde edilen 12 pozitif iki hücre yüzeyinde TNFR2 (Katılım # NM_130426 TNFRSF1B/CD120b) olduğunu gösterdi. Buna ek olarak, PGRN ve TNFR arasındaki etkileşimi Solid-faz bağlayıcı tahlil, Co-immunoprecipitation, Yüzey plazmon rezonans analizi ve Flow sitometri testinin ¹⁴ in vitro dahil olmak üzere çeşitli protein-protein etkileşim testleri kullanılarak doğrulandı.

10. Temsilcisi Sonuçlar

Taramanın akış şeması Şekil özetlenmiştir. 3. Genelde 50-100 olumlu klon adaylar bu aşamada elde edilecektir. Biz, başlangıçta 2,5 milyon transformants PGRN yem ile gösterildi arasında 54 olumlu klon adaylar izole edilmiştir. Pozitif klon adayları daha sonra X-gal tahlil yaparak doğrulandı. Tipik olarak, yaklaşık% 50 yanlış pozitif klonların X-gal tahlil üzerinden kaldırılır. Biz samimi 23 olumlu klon elde PGRN yem (Şekil 4) Bu aşamada ates. Av klonları ve maya içine yem inşa Retransformation hala muhabir genler muhtemelen gerçek pozitif temsil etkinleştirin "false positive" (hatalı tespit) ve klonlar daha ortadan kaldırır. Tipik olarak, yaklaşık% 50 oranında olumlu klon adayları silinecektir. Sonunda, maya PGRN ile etkileşime 12 olumlu klonlar izole edilmiştir.

Şekil 1 maya iki hibrid sistem Prensibi

Şekil 2 maya iki hibrid sistemi kullanarak protein bağlayıcı ortaklarının belirlenmesi Boru Hattı

Şekil 3. Akış şeması tarama maya iki hibrid kütüphanesi.rge.jpg "target =" _blank "> Bu görüntünün tam boyutlu sürümünü görmek için buraya tıklayın.

Pozitif klon adayların Şekil 4 Beta-galaktosidaz tahlil. Kütüphane ekranının elde edilen A, Pozitif klonlar YPD plakaya aktarılır ve 30 ° C'de gece boyunca inkübe; B, YPD plaka üzerinde tüm koloniler nitroselüloz membranlar aktarılır ve beta-galaktosidaz tahlil gerçekleştirilir.

Tartışmalar

Maya iki hibrit taraması, protein ^{etkileşimleri 16,} 17 belirlenmesinde etkili bir araç olduğu kanıtlanmıştır . ; Biyokimyasal ortak arıtma ve protein cips, maya iki hibrid sistemi, nispeten basit bir deney dizileri kodlama çok yüksek sayıda tarama için kullanılan hassas bir genetik yaklaşım olarak protein bağlayıcı ortakları belirlemek için diğer yaklaşımlar ile karşılaştırıldığında Buna ek olarak, in vivo etkileşim içinde algılar ve karmaşık protein saflaştırılması ge...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktifi Adı	Şirket	Katalog numarası
ProQuest iki hibrid sistem	Invitrogen	10835
YPD Büyüme Orta	Clontech	630409
YPD Agar Orta	Clontech	630410
SS Agar Base Minimal	Clontech	630412
-Leu Ek DO	Clontech	630414
-Leu/-Trp Ek DO	Clontech	630417
-His/-Leu/-Trp/-Ura Ek DO	Clontech	630425
3-Amino-1 ,2,4-Triazole (3AT)	Sigma-Aldrich	A8056
Luria suyu (LB)	Sigma-Aldrich	L3022
X-Gal	Invitrogen	15520-034
Sonicated Somon Sperm DNA	Stratagene	201190
Ampisilin	AMRESCO	0339
Kanamisin Sülfat	Invitrogen	11815-024
Subcloning Verimlilik ™ DH5α ™ Yetkili Hücreleri	Invitrogen	18265-017
Trizma ® tabanı	Sigma-Aldrich	T6066
Lityum asetat	Sigma-Aldrich	L4158
Ethylenediaminetetraacetic asit	Sigma-Aldrich	ED
Selülozik Membran	Bio-Rad	162-0115
10 cm'lik petri	ITI Bilimsel	CT-903
İnkübatör (30 ° C)	ATR (Ecotron)