Nöronal Morphogenesis Çalışması Yöntemleri:<em&gt; Ex vivo</emEmbriyonik Mürin Serebral Korteks olarak&gt; RNAi Elektroporasyon

Özet

Serebral kortekse bir gelişme genlerin işlevine hızlı bir değerlendirme yapmak için, ilgili yöntemler açıklanmaktadır Ex vivo elektroporasyon inhibitör RNA (RNAi) ve fare embriyonik kortekste GFP ortak dile getirdi. Bu protokol, nörogenez, nöronal migrasyon ve dendrit ve akson akıbet de dahil olmak üzere nöronal morfonogenezi gibi nörogelişimsel çeşitli yönleriyle incelenmesi için uygundur.

Özet

Serebral korteks yüksek bilişsel fonksiyonları yönlendirir. Bu altı tabakalı yapı son doğan nöronlar beyin ¹ yüzeyine doğru ilk doğan nöronlar geçen geçiş sırasında ilk doğan nöronlar ventrikül yakın kalır olan bir içten-birinci dış-son şekilde, oluşturulur. Nöronal migrasyon ² ek olarak, normal kortikal işlev için bir anahtar işlemi nöronal morfojenezini ³ arasında bir düzenlemedir. Nöronal morfogenez primer kültürlerinde in vitro okudu olabilir iken, bu süreçleri doku ortamlarda nasıl düzenlendiği öğrenilecek çok şey var.

Biz serebral korteks ^4,6 organotipik dilimler halinde nöronal migrasyon ve / veya morfonogenezi analiz teknikleri anlatıyoruz. Bir pSilencer modifiye vektör çift zincirli RNA firkete süren bir U6 organizatörü ve b tahrik GFP protein kodlar ayrı bir ifade kaseti hem de içerir kullanılırya CMV organizatörü ^7-9. Bizim yaklaşımımız aday genler belirli devirme üzerine akson uzantısı kusurların hızlı değerlendirme sağlar ve başarılı bir akson uzantısı ⁸ düzenleyiciler için bir ekran kullanılmıştır. Hücrelerin sadece bir alt kümesini RNAi yapıları ifade Çünkü, organotipik dilim potansiyeli fenotipleri bir mozaik analizi için izin verir. Bu analizin in vivo ortamda bir yanında yaklaşık yapılır, çünkü Dahası, bu bilinmeyen kortikal fonksiyonunun genleri için düşük maliyetli ve transjenik hayvanların ya da boşaltma üretimi için hızlı bir alternatiftir. Son olarak, in vivo elektroporasyon teknolojisi ile karşılaştırıldığında, ex vivo elektroporasyon deneylerin başarıya yetkin cerrahi beceri geliştirme bağımlı değildir ve kısa bir eğitim süresi ve beceri ile yapılabilir.

Protokol

1. (Değil video) Kültür ve Medya Çözümleri hazırlanması

1. 1x HBSS, 2,5 mM Hepes (pH7.4), 30 mM D-glukoz, 1 mM _CaCl2, 1 mM MgSO ₄ ve 4 mM NaHCO ₃ içeren Complete Hank'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS), 1 litre hazırlayın. Çift distile su (GKD ₂ O) ekleyin. 4 at 0.2-mikron filtre ve mağaza ° C ile sterilize filtreleme
2. Bazal ortam Eagle Medium, 35 mL kültür ortamı kullanılarak dilim, Complete HBSS 12.9 mL, 20 mM D-glikoz (1 M çözeltiden 1.35 mL), 1 mM Glutamax (200 mM a çözeltisi 0.25 mL), 0.5 ml penisilin hazırlamak -streptomisin 100x stok. Bir 0.2-mikron filtre ile sterilize filtre uygulayın, sonra% 5 oranında bir son konsantrasyon serum ısı ile inaktive edilmiş at ekleyin.
3. 1 mg / distile deiyonize su ile Laminin mL stok çözelti yaparak Laminin çalışma çözeltisi hazırlayın. -80 Az 0,5 ml Eppendorf tüplerinde 100 mcL alikotları hazırlayın ve dondurma ° C
4. Böylece poli-L-lizin çalışma hazırlamakbir 1 mg / mL stok solüsyonu yapmak için poli-L-lizin 5 mg steril _H2O 5 mL ekleyerek Direkt Ekspres. -20 ° C'de 1 ml hacimde ve dondurma hazırlayın
5. Steril su ile 12 ml nihai hacme poli-L-lizin, 1 ml ve laminin 100 uL seyreltilmesi ile kaplama çözeltisi hazırlayın. Her defasında taze bu çözüm olun.

2. Organotipik Dilim Uçlar (değil video) hazırlanması

1. Tek bir kültür insert başına iyi steril forseps kullanarak iki adet altı-iyi plakaları hazırlayın. Kültür ekler altında steril GKD ₂ O 2 mL ekleyin.
2. Ponksiyonu ile membran bakımı olmayan alarak membran üst kaplama solüsyonu 1 ml ilave edilir. 37 nemlendirilmiş bir inkübatörde gece inkübe ° C ve% 5 CO _2.
3. Kaplama ortamı çıkarın ve steril H ₂ 0 üç kez membran yıkayın. Kullanmadan önce kuru ekler edelim. ° C inkübatör 37 kesit kültürü, orta ve yerin 1.8 mL ekleyin. Parafilm ile kullanılmayan tabak sarınve 4 haftaya kadar 4 ° C'de saklayın.

3. (Değil video) Elektroporasyon için hazırlanıyor

1. Elektroporasyon için RNAi yapıları hazırlayın. Çift dallı RNA firkete ekler pSilencer vektörünün içine klonlandı. Plazmid içerir: 1) çift bükümlü RNA'nın kuşak süren bir U6 promotör, ve 2), bir GFP ifade kaseti CMV promotör ^8,9 tarafından tahrik. Bu plazmid önceden Konishi ve arkadaşları, ⁹ ve diğerleri ^7,8 tarafından tarif edilmiştir. Plazmidler, bir Qiagen Maxi-hazırlık kiti kullanılarak saflaştırıldı, ve 1 mg / mL 'lik bir konsantrasyonda kullanılır.
2. Enjekte ederken DNA canlandırmak için,% 0.5 'lik hızlı yeşil boya solüsyonu hazırlamak ve (genellikle hızlı yeşil 1 uL sahip DNA 20 ul) enjekte edilecek olan DNA ile 01:20 olarak kullanılabilir. Arta kalan DNA'nın hızlı yeşil bir boya karışımı bir hafta boyunca -20 ° C'de saklanabilir.
3. Temiz disseksiyon alanında, dissecting araçları ve% 70 etanol ile vibratome gemi. O buz gibi soğuk olacak şekilde tam HBSS soğutun. Hızlı soğutma için bir miktar su ile vibratome içinde etrafına buz paketleyip Chill vibratome gemi. Tam HBSS kullanılarak% 3 düşük erime noktası agaroz hazırlayın. 1 dakikalık mikrodalga. Kaynar kaçının. Kullanımı kadar 42 ° C su banyosunda tutun.
4. Elektroporasyon parametreleri aşağıdaki gibi ayarlanır. Bir E15 embriyo kullanımı 35 V için 5 bakliyat, 100 ms uzunluğu, darbeler arasında 900 ms aralığı. Yaşlı hayvanlar için elektroporasyon sağlamak için, 50 V yüksek voltaj kadar kullanmak veya 8 darbeleri darbe sayısını artırmak. Genç hayvanlarda doku zarar vermemek için, 25 ya da daha az darbeler veya en fazla 2 bakliyat ve düşük voltaj kadar kullanmak V. Bu parametreler çeşitlidir ve ampirik hayvanın yaşına bağlı olarak belirlenebilir.

4. Diseksiyon ve Elektroporasyon (video)

1. Hamile bir kadın euthanizing sonra, buz gibi tam HBSS içine embriyo dışarı incelemek. Kebireysel plasental keseler her embriyo ep.
2. Embriyo dışarı inceleyin ve ilk vertebra sonra kafasını kesti. Buz gibi tam HBSS tutun.
3. Enjeksiyon için, petri üstüne parafilm parçasının üzerine kafa yerleştirin. Kortikal veziküller her iki lateral ventrikül doldurmak için üçüncü ventrikül ile hızlı yeşil boya karışımı: Özel kullanarak Hamilton enjektörü DNA 8 ila yaklaşık 6 uL enjekte (Tablo I bakınız) yaptı. Alternatif olarak, enjeksiyon her lateral ventrikül doğrudan yapılabilir.
4. Ex vivo elektroporasyon için BTX-cımbız platin elektrot kullanın. Eğer dorsal korteks için kafa yani üst electroporate istediğiniz korteksin tarafına doğru pozitif elektrot yerleştirin.
5. Elektroporasyon sonra diseksiyon önce en az 5 dakika buz üzerinde kafaları inkübe.
6. Buz HBSSby baş tarafında küçük bir kesi yapmak ve baş tarafı kapalı cilt soyma beyinde parçalara ayır. Ile, bir sonrakiyavaşça sıyırın ince forseps beyinden pia. Kortekse zarar vermemeye özen, kafatası sağlam beyin çıkarın.

5.. (Video) gömme ve Electroporated korteksleri Kesit

1. Buz üzerine yerleştirilmiş büyük bir kalıp içine% 3 düşük erime noktası agaroz aktarın. Kalıbın tabanındaki hızlı kalıbın alt aşağı batmasını beyinleri önleyecek olan katılaşmaya başlayacaktır. Nazikçe, ince forseps bir Kimwipe veya filtre kağıdı ile aşırı tamponu çıkardıktan sonra tek tek ile beyni aktarın. Agaroz ve beyin dokusu arasında maksimum arayüz sağlamak için kalıbın içerisine girdap beyinlerine 10 uL pipet ucu kullanın.
2. Tüm beyinleri sağlamak için yönlendirmek beyinleri aynı yönde ve agaroz yaklaşık aynı seviyededir. Agaroz yaklaşık 5 dakika süreyle katılaşmaya edelim. Olfaktör ampuller ayakta böylece agaroz blokları eklemek yapıştırma (deli yapıştırıcı) kullanın. Bloklar tutturulur hemen sonra, i eklemece soğuk HBSS ve emin tek tek dilimler için agaroz kırpmak her beyin için elde edilmiştir.
3. , Dilim bloklar düşük hızlı (yarı maksimum hakkında) için vibratome hızına ayarlayın ve en yüksek ayarda bıçak titreşim frekansı ayarlamak için. 250 mikron kalınlığında koronal dilimleri oluşturun. Boynu bükük ince spatula ile dilim almak ve ince bir fırça veya forseps ile doku kuyu aktarabilirsiniz.
4. Doku kültürü kaputu, kaplamalı uçlar içine dilimlerini aktarabilir. Transferi kolaylaştırmak için her ekleme için kesit kültürü medya 500 uL ekleyin. En fazla 5 dilimleri eklemek için başına yerleştirilebilir. Dilimleri üst fazla olan ortamı çıkarın ve 37 ° C'de nemli inkübatörde inkübe.

6. Kültür ve Organotipik Dilimler Analizi (video)

1. Sağlıklı dilimler korumak amacıyla, taze ortam ortam her yarım değiştirerek membranı altında en az iki günde ilave edilmelidir.
2. D sonra dilimleri analiz etmek içinkültür esired gün, membran dilimleri düzeltin. ° C üç kez 10 dakika, her sefer için 37 1x fosfat salin tamponu (PBS) ile yıkayın. Sonra, 4 ° C'de ya da oda sıcaklığında 1 saat için gece boyunca 4% paraformaldehit (PFA) ile sabitlemek.
3. Dilimler, farklı hücresel belirteçleri ile analiz veya electroporated ve non-electroporated hücreleri canlandırmak için tek başına Hoechst ile boyanmış olabilir. Geçirgenliği ve% 10 serum keçi, yumuşak çalkalama ile 1x PBS içinde% 0.1 Triton ile oda sıcaklığında 2 saat boyunca dilimleri bloke eder.
4. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca Hoechst ile lekesi, her seferinde nazik çalkalanarak 1x 10 dakika PBS ile 3 defa yıkanır.
5. Dilimleri bir neşter ile membran kesilerek monte ve buzlu cam dilim içeren membran aktarmak için güzel bir forseps kullanmak için bir su haznesi içinde kayar. Kadar 5 dilim cam slayt başına yerleştirilebilir. Fazla suyu uzaklaştırınız, ve her beyin dilime Flourmount bir damla ekleyin. Yavaşça beyin dilimleri üstünde coverslip yerleştirin ve bir kaldırmay hava kabarcıklar. Bir konfokal mikroskop kullanılarak dilimleri analiz edin.

7. Organotipik Dilimler Alternatif Parafin Gömme (değil video)

1. Organik tip dilimler da bu amaçla, daha ince bir morfolojik analizi için parafin için gömülebilir organotipik dilim içeren membran PFA yukarıda açıklandığı gibi% 4 sabitlenebilir.
2. Sabit bir dilim% 1 agaroz (37 ° C ila önceden ısıtılmış) içine gömülü, ve 30 dakika süreyle buz içinde katılaştırılmış edilir. Agaroz bloklar daha sonra 30 dakika süreyle 4 ° C'de% 4 PFA post-tespit edilebilir.
3. Organotipik dilim içeren agaroz blok sonra parafine gömüldü ve daha önce açıklandığı gibi ¹⁰ immünfloresan için işlenecektir.

8. Temsilcisi Sonuçlar

Organotipik dilimlerin murin korteks ve kültür elektroporasyon şematik bir temsilini Şekil 1 'de gösterilmiştir. Bu yöntem, rapi için yararlı bir stratejiNöronal gelişimi ¹¹ yer genlerin işlevine d değerlendirmesi. DNA electroporated miktarını ve elektroporasyon azından embriyonik aşamada bağlı olarak, transfeksiyon verim olarak değişecektir. Dilimler en az 8 saat sonrası elektroporasyon ve hücrelerin kültür nörojenik olaylar (proliferasyon, göç, ve erken nöronal farklılaşma) normal sırasını uğrayacaktır GFP ifade başlayacaktır. Şekil 2 pSilencer-GFP bir kontrol ifade edilen bir electroporated beyin kesit gösterir vektör ve bir nöronal ataları, göç nöronlar ve dilim farklı nöronların gözlemleyebilirsiniz. Bu membranlar iyi bir ortam hava arayüzü tutulur ve kültür alanında en az 5 gün öncesine kadar kullanılabileceği gibi Organotipik dilim sürece kendi morfolojisi devam edecektir.

Şekil 1.. Ex vivo elektroporasyon ve organotipik dilim İllüstrasyonkültür testi. E14.5 embriyosu çıkarılmış, ve ayrı ayrı enjeksiyon görselleştirmek için hızlı yeşil boya ile karıştırılır DNA ile enjekte edilir. Lateral ventrikül doldurmak için resimde veya üçüncü ventrikül de tasvir edildiği gibi DNA lateral ventrikül hem enjekte edilebilir. Enjeksiyon sonrası, beyin beynin istenilen tarafında pozitif elektrot yerleştirerek, bir kare dalga elektroporatörün ile electroporated edilir. Beyinler% 3 düşük erime noktası agaroz ve vibratome kullanarak kesitli gömülür. 250 mikron beyin kesitleri 0,4 mikron ekler yerleştirilir ve bir hafta kadar kültürlenmiştir. GFP 8 saat sonra transfeksiyon sonrasında görülebilir.

Şekil 2. Electroporated beyin kesitleri analizi. Electroporated beyin kesitleri Hoescht için boyandı. Dorsal korteks ventriküler zon (vz) at electroporated nöronal ataları gösterir. Ulna dia nöronlarıncal plakası (cp) marjinal zon (mz) tarafından sınırlandırılır. Beyaz oklar göç nöronlar göstermektedir. Bu durumda, beyin E15.5 enjekte edildi ve bir pSilencer GFP kontrol vektörü ile electroporated. Bölümlerde 4 gün elektroporasyon sonra kortikal eksplantları temsil eder. Ölçek çubuğu 100 mikron.

Sorun Giderme:

1. Düşük transfeksiyon verim: en az 1 mg / ml için kullanılan DNA konsantrasyonu ayarlayın. Gerekiyorsa bir endo-free Quiagen kiti DNA arındırmak için ise her zaman bir maxi hazırlık çok temiz DNA kullanın.
2. Bir istenenden daha farklı bir beyin bölgesinde transfekte edilmiş hücrelerin: elektrotlar electroporated edilecek beyin tarafına doğru pozitif elektrot pozisyonu ile düzgün bir şekilde konumlandırılır dikkat ediniz.
3. Her gün Değişim medya ve dilimler medya yüzen kalmamalarını sağlamak: Organotipik dilimleri morfolojisi kaybetmek
4. Onlar vi kesiliyorlar olarak Dilimleri agaroz dökülmekbratome: düşük erime noktası agaroz in beyinleri gömerken iyi bir hale arayüz olmasına dikkat ediniz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Çift sarmallı RNA hairpins ⁸ ve ⁴ çok özel avantajlar sağlar organotipik dilim kültürü kodlayan plazmidlerin ex vivo elektroporasyon içeren bu yöntemleri. İlk olarak, bu yöntemler RNAi-türevi fenotip hızlı bir şekilde değerlendirilmesi için olanak sağlar. Çift RNA firkete tahrik U6 promot.örünü içerir, aynı pSilencer vektör içinde bir ifade kaseti kodlama GFP dahil edilmesi RNAi vektörü ile electroporated hücrelerinin hızlı bir tanımlama ve karakterizasyonu...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Hamilton enjektörü	HAMILTON	80008	0.5 inç uzunluğunda 31 gauge, PT-4 (nokta beveling düzeyi), 10μl hacmi
Platin tweezertrodes	BTX	45-0489	5mm boyutu
ECM830 elektroporatörün	BTX	45-0002
BTX Ayak Pedalı	BTX	45-0208	ECM830 elektroporatörün ile kullanım için
Bıçak mikrotom Titreşimli	LEICA	VT1000 S
6 - ekler ile kullanmak için iyi çanak	FALCON	353502	Ekler uyacak çentikler içerir
Doku kültürü ekler	FALCON	353090	0.4 mikrometre
Fast Green	SIGMA	F7252
Düşük Erime Agaroz	FISHER	BP165-25	DNA notu
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020
Poli-L-Lizin	Sigma-Aldrich	P5899
Bazal Orta Kartal	Sigma Aldrich	B-1522
Ca ve Mg olmadan 10x HBSS	GIBCO	14180-046
HEPES-serbest asit	Sigma-Aldrich	H4034