Kök Hücre yüklü Chitosan Mikrokürelerin teslimi için bir Kollajen Hidrojel oluşturma

Özet

Mevcut kök hücre tedavilerinde büyük bir engel konak dokularına bu hücrelerin sunmak için en etkili yöntem belirlemektir. Adipoz kaynaklı kök hücreler kendi multipotency korumasını sağlarken Burada, verimli ve yaklaşım, basit bir kitosan tabanlı dağıtım yöntemi açıklar.

Özet

Multipotent kök hücreleri rejeneratif tıp ^1-3 alanında çok faydalı olduğu kanıtlanmıştır. Bununla birlikte, doku rejenerasyonu için etkili bir şekilde, bu hücrelerin kullanmak için, değişken bir dizi dikkate alınmalıdır. Bu değişkenler şunlardır: toplam hacmi ve implantasyon sitenin yüzey alanı, doku mekanik özellikleri ve damarlanma miktarını ve hücre dışı matris bileşenlerini kapsamaktadır doku mikro,. Ana doku taklit eden bir mekanik mukavemet korurken Bu nedenle, bu hücrelerin sağlamak için kullanılan materyallerin belirlenmiş bir kimyasal bileşimi ile biyo-uyumlu olmalıdır. Bu malzemeler ayrıca oksijen ve besin hücrelere tutunur ve çoğalırlar için elverişli bir mikro sağlamak için geçirgen olması gerekir. Chitosan, mükemmel biyouyumluluk bir katyonik polisakkarit, kolayca kimyasal olarak değiştirilmiş ve in vivo mac in ile bağlamak için yüksek afinite edilebilirromolecules ^4-5. Chitosan, hücre yapışması, göçü ve çoğalması için bir substrat olarak işlev sağlayan, ekstraselüler matriksin glikozaminoglikan kısmı taklit eder. Bu çalışmada, üç boyutlu bir yapı iskelesi ⁶ göre kollajen bir içine adipoz-türevi kök hücreleri (Artan) sunmak üzere mikrosferler şeklinde kitosan kullanmaktadır. İdeal bir hücreden mikrosfer oranı inkübasyon süresi ve yüklenmesi olabilir hücrelerin sayısını elde etmek için hücre yoğunluğu açısından değerlendirildi. ASC kitosan mikroküreler (CSM) üzerine ekildikten sonra, bir kollajen iskele gömülü olan ve uzun süre kültüründe muhafaza edilebilir. Özetle, bu çalışmada hassas bir üç boyutlu yapı iskelesi biyomalzemenin içinde kök hücreleri sunmak için bir yöntem sağlar.

Protokol

1. Yalıtımlı Yağ-Türetilmiş Kök Hücre (ASC)

Not: aksi belirtilmediği sürece tüm işlemler oda sıcaklığında yapıldı.

1. Sıçan perirenal ve epididimal adipoz yalıtmak ve daha önce ⁶ açıklandığı gibi% 1 fetal sığır serumu (FBS) içeren steril Hank tamponlu tuz solüsyonu (HBSS) ile yıkayın.
2. Doku kıyma ve oda sıcaklığında 8 dakika boyunca 500 g'de 50 mL tüpü ve santrifüj içine% 1 FBS içeren HBSS 25 mL içine 1-2 g transfer.
3. Serbest yüzen adipoz doku tabakası ve 125 mL erlen transfer toplayın ve 37 az 45 HBSS kollajenaz tip II (200 U / ml) 25 ml ile tedavi ° orbital çalkalayıcı (125 rpm) C.
4. Dikkatle sıvı kısmı (petrol ve yağ tabakası altında) kaldırmak ve 100 mikron ve 70 mikron naylon örgü filtre üzerinden sırayla filtre. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 500 g'de santrifüje süzüntü, supernatan aspiret ve 25 ml HBSS ile iki kez pelet yıkayın.
5. MesenPRO RS Büyüme katkısı, (100 U / penisilin G, 100 ug / mL streptomisin sülfat, ve 0.25 mg / mL Amphotericin B'nin mL) antibiyotik-antimikotik ile desteklenmiş büyüme medyumu (MesenPRO RS Bazal Medium) 50 mL hücre pelletini ve 2 T75 şişeler (25 mL / şişeye) içine 2 mM L-glutamin ve pipet hücreleri.
6. Kültür 37 ° C (Artan Tüm deneyler için kullanılan Geçiş 2-4) de bir% 5 _CO2 inkübatöründe nemlendirilmiş ASC.

2. Chitosan Mikroküreler (CSM) hazırlanması

Not: aksi belirtilmediği sürece tüm işlemler oda sıcaklığında yapıldı.

1. CSM önceki protokolü kullanılarak bir iyonik ⁶ Koaservasyon tekniği ile birlikte, bir su-içinde-yağ emülsiyonlaştırıcı işlemle hazırlanır. Soya oluşan bir yağ fazı karışımı, 100 mL kitosan, sulu bir solüsyonu (0.5 M asetik asit içinde% 3 ağırlık / hacim kitosan 6 mL), emülsifiyeYağ, n-oktanol (1:2 v / v) ve% 5-sorbitan mono-oleat (p 80) emülsiyonlaştırıcı, karşıt yönlerde, üstten (1700 rpm) ve eş zamanlı olarak manyetik olarak karıştırıldı (1000 rpm) kullanılarak. Erken çapraz bağlama meydana gelmeden önce üzerinde oluşan miseller çözüm kalır ve dibe olamaz karıştırma temin eder bu ikili yöntemi. Dahası, içinde manyetik karıştırıcı yardımcıları misel oluşumu ve rigidization sırasında kitosan de-toplamak.
2. Karışım sürekli stabil bir su-içinde-yağ emülsiyonu elde edilene kadar yaklaşık 1 saat boyunca karıştırıldı. İyonik çapraz bağlama 4 saat (24 mL toplam) n-oktanol, her 15 dakika içinde% 1 w / v potasyum hidroksit ile 1.5 mL eklenmesi ile başlatılır.
3. Çapraz bağlama Reaksiyonun tamamlanmasından sonra, karışıma yavaş yavaş içeren CSM yağ fazı boşaltacaktır ve hemen aseton 100 mL küreler ekleyin. Yağ fazı, tamamen çıkarılana kadar aseton ile yıkanır küreler.
4. Bir vakum desikatörde ve anal olarak kurtarıldı küreler kurulayındaha fazla işlem olmadan yze. Ortalama partikül boyutu CSM, miligram başına yüzey alanı ve birim hacmi kübik parçacık boyutu analiz cihazı ile tespit edildi.
5. Sonraki deneyler için, kalıntı tuzları kaldırmak ve mutlak alkol ile sterilize etmek için steril su ile CSM üç kez yıkayın.

3. CSM Serbest Amino Grup Sayısını Belirleme

Not: aksi belirtilmediği sürece tüm işlemler oda sıcaklığında yapıldı.

1. Bubins ve Ofner ⁷ trinitro benzensülfonik (TNBS) asit yöntemi kullanılarak iyonik çapraz sonra CSM mevcut serbest amino gruplarının sayısını belirleyin. 40 ° C'de 4 saat süreyle 50 mL cam tüp içinde% 0.5 TNBS solüsyonu 1 mL mikrosferler 5 mg inkübe ve 2 saat boyunca 60 ° C'de 6N HCI 3 mL ilavesi ile hidroliz.
2. Oda sıcaklığına kadar soğumaya örnekleri, ve deiyonize su ile 5 mL etil 10 ml ilave edilerek serbest TNBS özüeter.
3. ° C bir su banyosunda 15 dakika oda sıcaklığına kadar soğutulur ve kalan eter, buharlaşma ve 15 ml su ile dilüe etmek için 40 sulu faz bir 5 ml bir örnek ısıtılır.
4. Boş ve kitosan amino gruplarının sayısı tespit etmek CSM hazırlanması için kullanılan şekliyle kitosan olmadan TNBS çözeltisi kullanılarak bir spektrofotometre ile 345 nm'de absorbans ölçün. Kitosan göre CSM serbest amino grubu ile kestirilebilir.

4. CSM içinde yükleniyor ASC

Not: aksi belirtilmediği sürece tüm işlemler oda sıcaklığında yapıldı.

1. Gece steril HBSS bölümünde 2,5 sterilize CSM 5 mg dengeye ve 8 mikron gözenek büyüklüğüne membran kültür plakası eki (24-iyi plaka) ekleyin.
2. CSM zarı üzerine yerleşen sonra, dikkatlice HBSS aspire ve inci büyüme medya ekleme ve 700 uL içine besiyeri 300 uL ekleyinucun dışına e.
3. Kültürü plakası içine eklemek CSM içinde büyüme ortamı ve tohum 200 uL uygun konsantrasyonda Pastör pipetiyle ASC (1 x ^04-04 Ekim x 10 ^4). Kültürü insert içinde orta son hacim, tohumlama sonra, 500 uL olup.
4. 37 azından% 5 _CO2 inkübatöründe nemlendirilmiş 24 saat süreyle CSM üzerine ASC tohumlu inkübe ° C.

5.. CSM içinde ASC Yükleme ve Hücre Uygulanabilirlik Yüzde Belirlenmesi

Not: aksi belirtilmediği sürece tüm işlemler oda sıcaklığında yapıldı.

1. Inkübasyondan sonra, insert membran içine göç etmiş hücreleri bozmadan steril bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne ASC yüklü CSM toplamak.
2. Artık orta çıkarın ve tüp taze besiyeri 250 uL ekleyin.
3. Her tüp 25 uL MTT [3 - (4,5-dimethylthiozole-2-il) -2,5-difeniltetrazolium bromür] eklemekçözeltisi (5 mg / mL) ve 37 azından% 5 _CO2 inkübatöründe nemlendirilmiş 4 saat süre ile inkübe edilir ° C.
4. İnkübasyondan sonra, orta kaldırmak dimetil sülfoksit 250 uL ekleyin ve karmaşık formazan çözünürleştirmek için 2-5 dakika boyunca vorteks karışımı.
5. 5 dakika boyunca 2700 x g'de santrifüje CSM, ve referans olarak 630 nm ile 570 nm de ölçüldü süpernatan absorbans belirler.
6. Uygulanabilir ASC'nin bilinen numaraları elde absorbans değerine göre CSM ile ilişkili hücre numarasını belirlemek.

6. ASC-CSM-Gömülü Kolajen Jel Karakterizasyonu

Not: aksi belirtilmediği sürece tüm işlemler oda sıcaklığında yapıldı.

1. 2 N NaOH kullanılarak pH 6.8 'arındırılmış Bornstein ⁸ ve fibrillate yöntemine göre, fare kuyruk tendonu ekstrakte tipi 1 kolajen (7.5 mg / mL) karışımı ASC-yüklü CSM (5 mg ≈ 2 x 10 hücre ihtiva eden ^4).
2. Bir 12-iyi levhaya fibrile kolajen-ASC-CSM karışımı ekleyin ve bir _37% 5 CO2 inkübatöründe nemlendirilmiş azından 30 dakika süreyle inkübe edilir ° C.
3. Tam fibrilasyon sonra, 37 ° C kadar bir% 5 CO ₂ nemli inkübatörde 14 gün için kolajen-ASC-CSM jeller inkübe
4. Jel içine CSM gelen hücrelerin Yayın ve göç standart mikroskopi teknikleri kullanarak gözlenmiştir.

7. Temsilcisi Sonuçlar

Bu çalışmada, bir kollajen jel iskele içine kitosan mikroküreler (CSM) kök hücre sunmak için bir in vitro bir strateji geliştirdik. Birörnek (çapı 175-225 mikron) ve kompozisyon Gözenekli CSM hücre taşıyıcıları (Şekil 2) olarak hazırlanmış ve kullanılmıştır. CSM'den ASC kuluçkaya üzerine, hücreler CSM 2 x 10 cells/5mg ⁴ arasında bir konsantrasyonda bağlı. Filopodia uzatırken hücreleri, mikroküre yayılan kabil edildimikroküre gözenekli yarıklar (Şekil 3) takın. Hücre yüklenmiş CSM kollajen jel ile karıştırılır edildi sonra, hücreler hemen jeller (Şekil 4) içine göç başladı.

Tablo 1. Bir kök hücre taşıyıcı sisteminde kitosan ve kollajen kullanımı için biyolojik avantajları.

Şekil 1. Şematik ASC-CSM yüklenen kollajen iskelelerinin çift kullanımı için genel bir strateji resmediyor. Şekil 2, 3, ve 4 görüntülerin yorumlanması ile yardımcı şematik içinde açıklamalı.

Şekil 2. Şematik kitosan mikroküreler üzerine kök hücrelerin tohumlu süreci resmediyor. Procmikron gözenek büyüklüğü membran kültür plaka insert - ess bir 8 CSM ile birlikte kültür ASC içerir. 24 saat sonra, mikroküreler ekleme kaldırılır ve bir biyomateryal matris içine almasi için hazırdır.

Şekil 3. ASC ile CSM yüklü morfolojik karakterizasyonu. B panelinden konfokal floresan mikroskobu ile elde edilen bir resim ile üst üste aynı görüş alanını gösterirken Panel A, ASC-yüklü CSM bir ışık mikroskobu resmediyor. ASC kalsein AM (yeşil) ile önceden yüklenmiş edildi. Panel D mikroküre (yıldız) yüklenmiştir hücreleri gösterirken Panel C, yüksüz bir mikroküre bir SEM görüntüsü bir görüntü resmediyor. Panel E TEM görüntü yüksüz mikrosfer bir kesitini göstermektedir. Gözenekler ve çatlaklar yapan çok sayıda mikroküre çapında bulunmaktadır. Panel F hücreleri ile kesitli mikroküre (oklar) eklenmiş ve CRE içine filopodia uzanan gösterirmengene. Orijinal büyütme: A & B = 70X; C = 500x, D = 2,000 x; E & F = 2,500 x.

Şekil 4. Üç boyutlu bir yapı iskelesi kollajen içine CSM gelen ASC göçü. Paneller A ve B hücreleri uzak mikroküre geçiş ve 3. günde kollajen matriks (A, oklar) içine CSM betimliyor. Panel B 12 gün sonra, benzer bir kültür gösterir. Transmisyon elektron mikroskobu (TEM) görüntüleri C, D ve C ve D E. Asteriskler tasvir hücreleri mikroküre (oklar) uzak göç ile kesitli olan bir mikroküre göstermektedir. Panel D'nin yüksek büyütmede paneli E tasvir ve kollajen fibriller (ilave) hücresine bağlı filopodia gösterir. Orijinal büyütme: A & B = 100x; C & D = 6,000 x; E = 20.000 x, inset = 150,000 x.

Şekil 5.Şematik rejeneratif tıp ve ilaç teslim CSM geniş kullanım resmediyor.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Kök hücre tabanlı tedavinin başlıca engellerden biri tamir için belirtilen bölgelere hücrelerin teslimat için etkin yöntemler geliştiriyor. Hastadan hastaya olan değişkenlik nedeniyle, doku tipi, yaralanma boyutu ve derinliği; teslim kök hücre yöntemi bir vaka ile ayrı ayrı tespit edilmelidir. Bir matris içinde kök hücreleri gömerek ve yara yerine onlara teslim doku mühendisliği için bir sonraki mantıklı bir yaklaşım gibi görünse de, bazı teknik engeller devam etmektedir. Bu matris yapı...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif / ekipman Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Hanks BalancedSalt Çözüm (HBSS)	Gibco	14175	Sarf
Sığır fetüs serumu	Hyclone	SH30071.03	Sarf
Kollajenaz Tip II	Sigma-Aldrich	C6685	Sarf
70 mikron naylon gözenekli filtre	BD Biosciences	352350	Sarf
100 mikron naylon gözenekli filtre	BD Biosciences	352360	Sarf
MesenPRO Büyüme Orta Sistemi	Invitrogen	12746-012	Sarf
L-glutamin	Gibco	25030	Sarf
T75 Doku Kültürü Flask	BD Biosciences	137787	Sarf
Chitosan	Sigma-Aldrich	448869	Sarf
Asetik asit	Sigma-Aldrich	320099	Sarf
N-oktanol	Acros Organics	150630025	Sarf
Sorbitan-Mono-oleat	Sigma-Aldrich	S6760	Sarf
Potasyum hidroksit	Sigma-Aldrich	P1767	Sarf
Aseton	Fisher Scientific	L-4859	Sarf
Etanol	Sigma-Aldrich	270741	Sarf
Trinitro benzensülfonik asit	Sigma-Aldrich	P2297	Sarf
Hidroklorik asit	Sigma-Aldrich	320331	Sarf
Etil eter	Sigma-Aldrich	472-484	Sarf
8-um Doku Kültürü Plaka Uçlar	BD Biosciences	353097	Sarf
1.5 ml Mikrosantrifüj Tüpler	Balıkçı	05-408-129	Sarf
MTT Reaktif	Invitrogen	M6494	Sarf
Dimetil Sulfoxide	Sigma-Aldrich	D8779	Sarf
Qtracker Hücre Etiketleme Kiti (Q tracker 655)	Molecular Probes	Q2502PMP	Sarf
1 Kollajen Tip	Travigen	3447-020-01	Sarf
Sodyum Hidroksit	Sigma-Aldrich	S8045	Sarf
12-Peki Doku Kültürü Tabaklar	BD Biosciences	353043	Sarf
Santrifüj	Eppendorf	5417R	Ekipman
Orbital Çalkalayıcı	New Brunswick Bilimsel	C24	Ekipman
Hava-% 5 CO2 ile nemlendirilmiş Kuluçka	Thermo Scientific	Model 370	Ekipman
Tepegöz Karıştırıcı	IKA	Visc6000	Ekipman
Manyetik Karıştırıcı	Corning	PC-210	Ekipman
Vakum Desikatör	-	-	Ekipman
Parçacık Boyut Analiz Cihazı	Malvern	STP2000 Spraytec	Ekipman
Su Banyosu	Fisher Scientific	Isotemp210	Ekipman
Spektrofotometre	Beckman	Beckman Coulter DU800UV/Visible Spektrofotometre	Ekipman
Girdap	Diagger	3030a	Ekipman
Mikroplaka Okuyucu	Molecular Devices	SpectraMax M2	Ekipman
Floresan / Işık Mikroskobu	Olympus	IX71	Ekipman
Konfokal Mikroskop	Olympus	Konfokal Mikroskop FV-500 Lazer	Ekipman
Taramalı Elektron Mikroskobu	Carl Zeiss MicroImaging	Leo 435 VP	Ekipman
Transmisyon Elektron Mikroskobu	JEOL	JEOL 1230	Ekipman