Immünohistolojik Duyusal Nöron Dendritler Mikrotübüller Etiketleme, trakea ve kaslar Drosophila Larva Vücut Duvar

Özet

Nöron dendritler gibi karmaşık hücre şekilleri, geliştirme sırasında nasıl elde edilir anlamak için, bu, doğru tahlil mikrotübül organizasyonu edebilmek için önemlidir. Burada dendritik arborization duyusal nöron dendritler mikrotübül organizasyonu, trakea, kas incelemek için sağlam bir immünohistolojik bir etiketleme yöntemi açıklamak ve diğer Drosophila Larva vücut duvar dokuları.

Özet

Karmaşık hücre şekilleri farklılıklar nasıl elde edilir anlamak için, doğru mikrotübül organizasyonu takip etmek önemlidir. Drosophila larva vücut duvarı, hücre ve doku morfolojilerinden çalışma modelleri çeşitli hücre tipleri içerir . Örneğin trakea tüp morfolojilerinden ¹ ve Drosophila larva duyusal nöronlar, genel ve dendritik ^{farklılaşma} 2-5 ^ve 6 dejenerasyon nöron sınıf özel mekanizmaların aydınlatılması için birincil sistem haline gelmiştir dendritik arborization (DA) incelemek için kullanılır . .

Dendrit dallarının şekli nöron sınıflar arasında önemli farklılıklar ve hatta tek bir nöron ^7,8 farklı dalları arasında. DA nöronların genetik çalışmalar diferansiyel sitoskeletal organizasyon dendritik şube şekli ^4,9-11 morfolojik farklılıklar altında olduğunu göstermektedir. Biz sağlam bir immünolojik etiketleme yöntemiDA duyusal nöron dendrit çardak in vivo mikrotübül organizasyonu (Şekil 1, 2, Movie 1) ssay. Bu protokol ilk instar larva diseksiyonu ve immün aktif duyusal nöron dendrit akıbet ve dallanma organizasyon ^12,13 meydana gelen bir aşama göstermektedir.

Duyusal nöronlar boyama ek olarak, bu yöntem güçlü kas mikrotübül organizasyonu etiketleme (Film 2, 3), soluk borusu (Şekil 3, Film 3), ve diğer vücut duvarı dokulara ulaşır. Kontrol doku ve hücre şekli, bu mekanizmaların araştırılması vücut duvarı in situ mikrotübül organizasyonu analiz etmek isteyen araştırmacılar için değerli .

Protokol

1. Reaktiflerin hazırlanması

Başlamadan önce Notlar: Diseksiyon ve immünohistokimyasal bir manyetik odasında yapılmakta ve larva özel şekilli böcek pimleri kullanarak aşağı tutturulmuş. Manyetik bir odasının inşaat, ve bu pimlerin hazırlanması ile ilgili ayrıntılı talimatlar, ilgili ^referanslar 14,15 bulunabilir . Kısaca, bir 1x1cm kare delik bir manyetik levha ve küçük bir oda yapmak için kağıdın arka tarafına yapıştırılmış bir lamel bölünür. Odanın iki epoksi yapıştırıcı ile mühürlenir; sonra bu tutkal odası kullanmadan önce% 70 etanol ile birkaç kez yıkanır. Diseksiyon böcek pimleri istenilen şekil bükme tarafından hazırlanan ve daha sonra bir metal ^sekmesini 14,15 yapıştırılmış . Alternatif metal bir sekmesinde, bir cut-off sarı ucundan yapılan bir kolu ile ters bir düz başlı çelik raptiye kullandım. Bu manyetik oda düzenleme kullanın, yakın kontrolü ove sağlarr pin konumlandırma ve doku diseksiyonu sırasında germe.

DA nöronlar araştırmacılar farklı alt muhabiri gen ekspresyonu sürücü için birkaç farklı Gal4 hatları (Shimono ve arkadaşları ¹⁶ tarafından özetlenmiştir) kullanabilirsiniz. Bu satırları çoğu kamu stok merkezlerinden mevcuttur. Bu temsili protokolde, DA nöron iki zıt sınıfların ortak etiketli olduğu bir çizgi immün yürütmek en basit sınıf I ve en karmaşık sınıf IV (P10-Gal4 ^17,18, UAS-mCD8: Kusabira-Orange (KO)).

1. Ca ^{+ +} ücretsiz HL3.1 tuzlu su hazırlayın
   1. MM: 70 NaCl, 5 KCl, 20 MgCl _2, 10 NaHCO _3, 5 Hepes, 115 sakkaroz ve 5 trehaloz pH 7,2 ^19. Filtre sterilize ve 4 saklamak ° C Not: Ca ^{+ +} ücretsiz bir çözüm diseksiyonu sırasında kas kasılması önler.
2. 2x PHEM tampon hazırlayın
   1. MM: 130 BORU, 60 Hepes, 20 EGTA, 4 MgSO4, pH 7.0. Filtre sterilize ve 4 saklamak ° C

      Not: Bu malzemeler, pH 7.0 yaklaşana kadar çözülmez.

3. Fiksatif taze fiksasyon hemen önce hazırlayın.
   1. 50 ml Falcon tüp 25ml çözüm, ilk karışımı 2g paraformaldehid, 100μl 1M NaOH ve 10 ml su hazırlamak için.
   2. Çözüm netleşene kadar çırpıcı ile 55 ° C su banyosunda fiksatif çalkalayın. (Toplam hacmi 11.5 ml olacaktır.)
   3. Buz üzerinde soğuk fiksatif.
   4. 12.5ml 2x PHEM tampon ekleyin.
   5. 1M HCl ile pH 7.0 'a ayarlayın.
   6. Çözüm hacmi 25ml kadar su ile doldurun.
   7. Filtre whatman kağıt kullanılarak çözüm.

2. Larvaların diseksiyonu

Başlamadan önce Not: duyusal dendritler özellikle Mikrotubul ağları ve arıza diseksiyon başladıktan sonra hızla. Achemen fiksasyonu takiben en az beş dakika içinde hızlı diseksiyon hieving Bu protokolün başarısında önemli faktörlerdir.

1. Larva suda yıkayın ve hızlı bir şekilde saç bir döngü kullanarak bu düşüş içine taşıyabilirsiniz.
2. Orient camına larva dorsal yüzü yukarı ve ventral tarafta. Not: Bu yönelim ventral küme nöronlar incelemektir. Dorsal küme nöronlar incelemek için, yönünü ters çevirin.
3. Ön ucunu ağzına kanca yakın pin merkezinde böcek-pin kullanın. En iyi sonuçları elde etmek için sonuna kadar yakın pin yerleştirin.
4. Diseksiyonu odasında bir damla serum fizyolojik HL3.1 yerleştirin.
5. Microscissors ile larva çok arka ucu kesti. Not: Bu adım, microscissors (adım 2.7) için erişim sağlayacak larva posterior sonunda bir diyafram açılır.
6. Forseps larva arka sonunda diyafram dışarı alay bağırsak bölgesi tut. Bütün bağırsak yavaşça çekin.
7. Yeriventral orta hat boyunca öne doğru diyafram ve kesme yoluyla microscissors bir bıçak ucu.
8. Köşesinde pimleri kullanarak, ilk arka sonra ön artık ücretsiz köşelerinde, pin. Aynı zamanda larva fileto yavaşça açın germek.

3. Fiksasyon, engelleme, boyama, ve larva filetosu montaj

Başlamadan önce Notlar: Tüm fiksasyon ve boyama adımları diseksiyonu odasında yürütülür. Bu süreçte, bu doku hasarına yol açabilir larva tutan böcek pinleri devirmek için dikkatli olun. Deney kurumasını önlemek için, boyama nemlendirilmiş dokuları ile çevrili küçük bir Tupperware konteyner bütün adımları uygulayın.

1. Sarı bir uç kullanarak Ca ^{+ +} ücretsiz HL3.1 tampon aspire. Hemen başka bir pipetteman kullanarak fiksatif ekleyin.
2. Ca ^{+ +} ücretsiz HL3.1 tampon kalan izleri ile yavaşça fiksatif karıştırmak için aşağı yukarı pipet veOdanın. Hemen aspirat ve sonra odasına taze fiksatif ekleyin.
3. 20 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
4. PBST 6x 10mins (% 0.1 PBS içinde Triton X-100) yıkayın.
5. RT 20 dakika PBST% 5 keçi serumu ile engelleyin.
6. PBST% 5 keçi serumu seyreltilmiş primer antikorlar ile bloke çözüm değiştirin. Kullanılan birincil antikorlar fare anti-α-tubulin (DM1A) ve sıçan anti-CD8 (5H10) seyreltilmiş 1 / 1000.

   Not: Araştırmacı, fare anti-Futsch ^(22C10) 20,21 seyreltilmiş bazı durumlarda 1 / 1000 ile fare anti-α-tubulin (DM1A) yerine (tartışma) isteyebilirsiniz .

7. 4 (en az 16h) bir gece inkübe ° C
8. PBST 6x 10mins yıkayın.
9. PBST% 5 keçi serumu seyreltilmiş ikincil antikor çözüm ekleyin. Kullanılan sekonder antikor Alexa Fluor 488 keçi anti-fare IgG ve Cy3 eşek anti-sıçan IgG. Fluorofor önlemek için kapalı örnek tutun²² foto-kasar.
10. Ya iki saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin, ya da bir gecede 4 ° C oda sıcaklığında bir saat izledi.
11. PBST 6x 10mins yıkayın.
12. % 80 gliserol monte slayt aşağı manikür-yan larva fileto yerleştirin ve bir 'hızlı' monte etmek için oje ile lamel iki mühür.
    Not: gelişmiş doku temizleme ve kalıcı istikrarlı bir örnek için, DPX monte edilir, ^daha önce 23 açıklandığı gibi.

4. Temsilcisi Sonuçlar:

Floresan boyama konfokal bir mikroskop altında incelendi. Sayılarla dendrit bir çardak içinde 1-2 farklı dallarında farklı sitoskeletal organizasyon var. Şekil ^1, 1. instar larva aşamasında sınıf IV DA nöron mili bir bölge gösterir . KO ve ikincil bir anti-CD8 antikor ve floresan (Cy3) kullanarak tespit: bütün mili mCD8 ile işaretlenir. Tubulin anti-α-tubulin antikor ve Florlu kullanarak tespitescent ikincil (Alexa Fluor 488). Tubulin ana dalları için olumlu, bazı ince yan dalları tubulin negatif. Film 1 sınıf I DA nöron benzer bir boyama ile seri bölümleri bir dizi. Şekil ^2, 1. instar larva aşamasında Futsch ve CD8 karşı antikorlar ile boyanarak sınıf IV DA nöronun mili bir bölge gösterir . Ana dalları Futsch pozitif, bazı ince yan dalları Futsch negatif. Şekil 3. Trakea larva vücut duvarı karmaşık bir mikrotübül organizasyonu göstermektedir. Filmler 2 ve 3, vücut duvarı kasları ve trakea ile boyama seri bölümleri göstermektedir.

Şekil 1. Şekil ^1, 1. instar larva aşamasında sınıf IV DA nöron mili bir bölge gösterir . Bütün mili mCD8 ile işaretlenir: KO ve anti-CD8 antikor ve floresan ikincil (Cy3) kullanarak algılandı. Tubulin anti-&-Tubuli kullanarak tespitn antikor ve floresan sekonder (Alexa 488). Altta yatan Panelleri AC sıralı konfokal z bölümler (0.5μm) C'-C ", panel C. Örnek (sarı ok ucu) veya mikrotübül vurgulanır (mor ok ucu) olmadan şubeleri tek antikor boyama Kırmızı ok uçları vurgulamak mikrotübül epitel hücreleri.

Şekil 2. Şekil ^2, 1. instar larva aşamasında Futsch ve CD8 karşı antikorlar ile boyanarak sınıf IV da nöronun mili benzer bir bölgeyi gösterir . Bütün mili mCD8 ile işaretlenir: KO ve anti-CD8 antikor ve floresan ikincil (Cy3) kullanarak algılandı. Futsch Futsch anti-antikor ve floresan ikincil (Alexa 488) ile tespit edilir. Ana dalları Futsch pozitif, bazı ince yan dalları Futsch negatif. (Sarı ok ucu) ya da (mor ok ucu) Futsch olmadan şubeleri örneği vurgulanır.

Şekil 3. Trakea, yukarıda açıklanan anti-tubulin protokolü kullanılarak boyandı. Bu larva, üçüncü instar ve daha ^önce 23,24 açıklandığı gibi ^disseke. Movie 3, bir kare ile işaretlenmiş alan genişlemiş seri bölümleri gösterir.

Film 1 Seri bölümleri ben nöron bir sınıfın dendritik mili boyunca tubulin boyama izleme. KO (Kırmızı) ve ikincil anti-CD8 antikor ve floresan (Cy3) kullanarak tespit: bütün mili mCD8 ile işaretlenir. Tubulin (Yeşil) bir anti-α-tubulin antikor ve floresan ikincil (Alexa Fluor 488) kullanılarak tespit edilir. Ölçek: video görüntüsünün bir yan bölümünde 46.88μm karşılık gelir. Movie görmek için buraya tıklayın.

Bod tubulin boyama izleme Film 2 Seri bölümleriüçüncü bir instar larva y duvarı kasları. Tubulin anti-α-tubulin antikor ve floresan ikincil (Alexa Fluor 488) kullanılarak tespit edilmiştir. Ölçek: video görüntüsünün bir yan bölümünde 46.88μm karşılık gelir. Movie görmek için buraya tıklayın.

Film 3 Seri üçüncü bir instar larva Şekil.3 bir kare ile işaretlenmiş bir vücut duvar trakea, tubulin boyama izleme bölümleri. Tubulin anti-α-tubulin antikor ve floresan ikincil (Alexa Fluor 488) kullanılarak tespit edilmiştir. Ölçek: video görüntüsünün bir yan bölümünde 46.88μm karşılık gelir. Movie görmek için buraya tıklayın.

Tartışmalar

Ne kadar karmaşık hücre şekiller elde edilir anlamak için, doğru tahlil mikrotübül organizasyonu edebilmek için önemlidir. Burada dendritik arborization duyusal nöron dendritler tahlil mikrotübül organizasyonu sağlam bir immünohistolojik etiketleme yöntemi açıklar. Boyama duyusal nöronlar ek olarak, bu yöntem, trakea, kaslar ve diğer vücut duvarı dokuları sağlam immünohistolojik boyama ulaşır.

Biz DA nöronlarının gelişmekte olan duyusal dendritler mikrotübül...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktifi Adı	Şirket	Katalog numara	Yorumlar (Isteğe bağlı)
Forseps	Dumont	11251-20
Microscissors	FST	15000-08
Fare anti-α-tubulin (Klonlama: DM1A)	Sigma	T9026	Seyreltme 1 / 1000
Mouse anti-Futsch (Klonlama: 22C10) süpernatant	Gelişim Çalışmalar Hibridoma Bankası	22C10	Seyreltme 1 / 1000
Sıçan anti-CD8 (Klonlama: 5H10)	Caltag	MCD0800	Seyreltme 1 / 1000
Alexa Fluor 488 anti-fare IgG	Invitrogen	A-11001	Seyreltme 1 / 500
Cy3 anti-Rat IgG	Jackson Immunoresearch	712-166-150	Seyreltme 1 / 200