Monositler ve İnsan Kan Küçük Örneklerden Dendritik Hücrelerde Lineage özgü Toll-like reseptör-aracılı Sinyali Kantitatif Görüntüleme

Özet

Biz (ImageStream teknolojinin kullanıldığını anlatmak Www.amnis.com), Hangi iyi tanımlanmış hasta kohortlarında primer immün hücrelerinin hücresel mekanizmaları ölçmek için, aynı anda yüksek-çözünürlüklü dijital görüntüleme ile kantitatif akım sitometri birleştirir. Çalışmalarımız konu kohortlarında küçük örneklerde soyunun spesifik hücresel tepkileri ölçmek için translasyonel araştırmalar için bir plan sunar.

Özet

Bağışıklık durumu bireysel farklılıkları enfeksiyona yanıtların saptanması ve hastalığın ciddiyeti ve sonuçları katkıda bulunmaktadır. Yaşlanma viral ve bakteriyel enfeksiyonlara karşı artmış duyarlılık ile ilişkili ve humoral iyi belgelenmiş düşüşün yanı sıra hücre-aracılı bağışıklık yanıtı ^1,2 ile aşılara yanıt azalır. Biz son zamanlarda Toll benzeri reseptörler (TLR), mikrobiyal enfeksiyon ve tetik antimikrobiyal konak savunma yanıtları ³ algılamak doğuştan gelen bağışıklık sisteminin kilit bileşenleri üzerindeki yaşlanma etkilerini değerlendirdik. Sağlıklı insan donör büyük bir kohort, biz yaşlılar o periferik kan monosit ifade ve belli TLR ⁴ ve dendritik hücreler benzer düşük TLR düzeyleri ve sinyalizasyon yanıtları (DC) fonksiyonu azalmış gösterdi, hayati önem taşıyor hücreler antijen sunan doğal ve kazanılmış bağışıklık ⁵ arasındaki bağlantı. Biz bir makrofajlarda TLR3 bozulmasına göstermiştirBatı Nil virüsü ^6,7 enfeksiyonuna yanıt olarak yaşlı donörlerden DC'lerin IFN d düşük üretim.

Immunosenescence anlayışımıza ve terapötik müdahale Paramount yanıt spesifik hücre tiplerinin ayrıntılı bir anlayış ve sinyal iletim mekanizması (s). FACS veya immunoblotting tarafından birincil hücre ve hücre ölçme belirteçlerin görüntüleme yoluyla bağışıklık yanıtları Geleneksel çalışmaları Ancak, bu çalışmalar genellikle hastalar mevcut küçük bir örnek hacmi ve birden çok karmaşık laboratuvar teknikleri yapmak yetersizlik teknik sınırlıdır, önemli ölçüde bizim anlayış gelişmiş var insan örnekleri. ImageStream eş zamanlı yüksek çözünürlüklü dijital görüntüleme ile kantitatif akım sitometri birleştiriyor ve böylece hasta duyarlılığının etkin bir şekilde yakalamak için eş zamanlı birden fazla hücre popülasyonlarının araştırılması kolaylaştırır. Burada DC'ler içinde ImageStream kullanımını değerlendirmek için göstermek TLR7 / 8fosforilasyon ve immün yanıtı ⁸ için kritik olan çok sayıda gen transkripsiyonu başlatan önemli bir transkripsiyon faktörü NF-KB, nükleer translokasyonu aktivasyon aracılı artar. Biz de son zamanlarda TLR5 sinyalizasyon ve ⁹ yaşlanma değişmiş immün yanıt katkıda bulunabilir yaşlı donörlerden monositlerde NF-KB yolunun daha önceden tanınmayan değişiklik gösterdiği, bu teknoloji kullanma.

Protokol

1. Bağışıklık Hücreleri İzolasyon ve uyarılması

1. Yerel Kurumsal Değerlendirme Kurulu kuralları uyarınca yazılı onam sonra sağlıklı gönüllülerden alınan 10-50 ml heparinize kan edinin. Yaşlanma veya hastalık çalışmalar için her bir gönüllü veya hasta için patogenezi, etme ve dışlama kriterleri açıkça belirlenmelidir.
2. CPT tüpler veya Ficoll-Paque kullanarak Plus, izolasyon ⁷ (Reaktifler, Tablo 1) gününde üreticinin talimatlarına (GE Healthcare, NJ) ve Deney göre insan periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC) ayırın.
3. Inkübe PBMC'ler (3 x 10 ⁶ / tüp) tek başına ortam içinde 0.6 ml 1.5 ml tüpler içerisinde ya TLR ligandları ya da başka bir aktive edici ajanlar, örn ile uyarılan TLR7 / 8 ligand R848 (0,6 ml, orta artı 10 mM TLR7 / 8 ligand 0.6 ul 10-60 dakika (InvivoGen, CA) ⁹ için 37 ° C'da R848, nihai konsantrasyon 10 uM).

2. LaboratuvarHücre eling

1. Etiket hücre soyu ve floresan-konjuge antikor kullanılarak canlı hücre süspansiyonları diğer yüzey belirteçleri. Etiket 3 x 10 4 azından 20 dakika boyunca ⁶ PBMC'ler ° monosit veya DC soyları (Tablo 2) spesifik yüzey antikor kokteyli ile 1.5 mL Eppendorf tüpüne PBS /% 2 FBS 100 ul C. Optimal antikoru dilüsyonları çok-üzere birçok varyasyon-aza indirmek için gruplar halinde işleme alınması gerekir ön deneyler ve örneklerde tespit edilebilir. 0.1 satıcı antikor stok için mg / ml antikor 5 ul (1:20 seyreltme) kullanın. Cihaz üzerinde floresan kanal kurmak için sadece tek bir renk konjuge etiketli hücre ayrı bir tüp kullanın.
2. Yüzey işaretlendikten sonra, oda sıcaklığında 10 dakika için% 4 PFA / PBS içinde hücreleri sabitlemek. Depolama için analiz zamanına kadar, analiz gününe kadar -80 de donmaya tampon içinde 500 xg ve Pastör pipetiyle hücreleri (% 90 FBS DMSO% 10 içeren) ° C'de santrifüj hücre.
3. Değerlendirme, sürecin partiler için odonörler bir grup f işlenmemiş ve uyarılan hücreler bir araya değişkenliği en aza indirmek için. Analiz gününde, çözülme hücreleri hızla 37 ° C su banyosu, donma tampon kaldırmak için 500x g santrifüj.
4. Hücre içi sitokinlerin veya diğer işaretleri, 100 ul BD Perm / Yıkama tamponu (BD Biosciences, NJ) içinde Pastör pipetiyle hücre süspansiyonları tespiti için hücre geçirgenliği artar. Örneğin, 20 dakika oda sıcaklığında, 500 x g'de santrifüj, aspirasyon süpernatan ve tavşan anti-NF-KB (p65) antikorun 01:20 seyreltme (nihai konsantrasyon 10 ug / ml, Santacruz Biotechnology, CA) ile hücre içi sinyal bileşenlerinin etiket 100 ul BD Perm Pastör pipetiyle hücre / keçi anti-tavşan IgG-Alexa647 (Invitrogen, CA) ihtiva eden 1:250 seyreltme tamponu yıkanır ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edilir.
5. Görüntüleme hemen önce, DAPI (0.2 mg / ml, Invitrogen, CA) veya propidyum iyodür (; 20 ng / ml, Invitrogen, CA PI) ile çekirdek counterstain.

3. ImageStream Analizi

1. Insan örnekleri arasındaki değişkenliği azaltmak için toplu örnekleri üzerinde ImageStream tarafından görüntüleme yürütün. 488 nm, 658 nm ve 405 nm 250 mW 10 mW 200 mW aşağıdaki gibidir: lazerlerin gücü Enstrüman ayarları idi.
2. Enkaz (düşük yoğunluklu PI) veya çoklu hücresel olayların tek hücre (R1) (ayırmak için: (yükseklik oranı genişliği) veri İlk dosyaları (Şekil 1), normal PI yoğunluğu ve yüksek PI boy oranı ile olaylara kapı analiz etmek yüksek PI yoğunluğu ve düşük boy oranı). Monositler CD14 pozitif hücreleri için bir kapı içinde bulunmaktadır. MDCS Lin-1 belirteçler (R3) için CD11c ve düşük CD4 (R2) için ve ayrıca düşük için yüksek hücreleri için bir kapı içinde bulunmaktadır.
3. Her bir hücre aktivasyonunun derecede etkin bir miktar ölçü sağlamak için (Amnis, OR) IDEAS yazılım kullanımı. Çekirdeğin (R4) içine translokasyonu göstermek için sitoplazmik transkripsiyon faktörü Nükleer boya PI ile NF-KB benzerlik (ya da ko-Lokalizasyon) belirler. NF-κB/PI locali yüksek bir korelasyonWHO yüksek bir benzerlik skoru yansıyan ve aktivasyon ¹⁰ derecesi belirtir.
4. Farklı tedavi grupları ya da hücrelerin göreceli işlevsel etkinliğini göstermek için hasta popülasyonları arasındaki benzerlik oranlarını karşılaştırın. Mutlak değerler veya kat farklılık istatistiksel karşılaştırma yoluyla örnekleri arasında veri miktarını. Nüfus dağılımlarını anahtar kesimleri (Şekil 2) hücrelerinin resimleri görüntülemek için FİKİRLER yazılımını kullanın.

4. Temsilcisi Sonuçlar

Biz TLR7 / 8 ligandı, R848 (Şekil 1) ile PBMC'ler uyararak bir model viral ligand yanıt olarak sayısal sinyal yollarının var. Biz örnek grupları (Şekil 2) hücresel yerleşimi görüntüleri ve nüfus istatistikleri hem de toplandı. ImageStream bize kapısı hücre alt doğrudan PBMC'ler ve görüntü hücresi yanıtlardan kapılı, ama Sıralanmamış hücre popülasyonlarının imkanı sağlar. Burada TLR s etkisi sayılabilirNF-KB (p65) nükleer lokalizasyonuna ignaling Lin1-, CD4 loş, CD11c + miyeloid DC'ler (MDCS). Başlangıçta, biz sitoplazmada transkripsiyon faktörü NF-KB (p65) ile unstimulated hücrelerinin yüksek oranda görülmektedir. Stimülasyon sonra, tedavi edilen hücrelerin NF-KB (p65) (ortanca benzerlik skorları sırasıyla, 1.52 ve 3.01 olduğu, Şekil uyarılmasından sonra çekirdek içine transloke belirten, nükleer leke PI ile NF-B anlamlı derecede daha yüksek benzerlik skoru (p65) var. 2). Benzer sonuçlar TLR5-uyarılmış monositlerin ⁹ belirtilmiştir.

Şekil 1.. Boyama ve insan MDCS üzerine stimülasyon etkileri ölçmek Ayırıcı Stratejisi. NF-KB transkripsiyon faktörü sayıda bağışıklık sistemi genlerin ekspresyonunu düzenler. Bu çalışma, TLR7 / 8 liga sonra bir temsilcisi konu ile MDCS NF-KB (p65) nükleer lokalizasyon ölçer nd stimülasyon. In-odaklanmak tek hücreler yüksek nükleer boy oranları (R1) ile PI pozitif olaylara gating ile belirlenmiştir. MDCS (Lin1-, CD4dim, CD11c +) R3 de bağımlı olmuştur. NF-KB (p65) Nükleer yerelleştirme R4 çizilir. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 2. . Uyarıldıktan sonra MDCS NF-KB'yi Yer Değiştirmesi stimülasyonu (R4) sonra çekirdeğin içine NF-KB (p65) ile translokasyon tedavi edilmemiş ve uyarılmış MDCS popülasyonları içinde tasvir edilmiştir; medyan benzerliği skoru arıtılmamış numunedeki 1,52 ve 3,01 olduğu Örnek uyarılmış (A). Tedavi edilmeyen veya R848-uyarılan hücre popülasyonlarının eşzamanlı toplanan dijital görüntüleri temsilcisi hücre ve hücre çekirdeği (B) transloke NF-B yoğunluğunu gösterir._upload/3741/3741fig2large.jpg "target =" _blank "> büyük rakamı görmek için buraya tıklayın.

Tartışmalar

Translasyonel çalışmalar ImageStream kullanımında önemli adımlar uygun karşılaştırma grupları ve optimizasyonu ve antikor özgüllük doğrulama seçimi vardır. Etiketli hedef konu grupları arasındaki farklar histogramlar ve hücre görüntüler arasında kolayca belli olacak. Ilgili reseptörler ve sinyal yolları değişikliklerin ayrıntılı bir analiz ile birlikte, bu veriler özel kohortlarında bağışıklık bozukluğunun altında yatan mekanizmalar hakkında değerli bilgiler sağlayacaktır. Te...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası
Ficoll-Paque Artı	GE Healthcare	17-1440-03
R848	Invivogen	tlrl-r848
Paraformaldehit (16%)	Elektron Mikroskopi Bilimleri	15710
BD Perm / Yıkama	BD Biosciences	554723
CD14-PE	eBioscience	12-0149-41
CD4-PacBlue	BD Pharmingen	68436
Lineage kokteyl 1 (lin 1)-FITC	BD Biosciences	340546
CD11c-PE	BD Biosciences	347637
CD123-PE	BD Biosciences	340545
tavşan anti-NF-KB (p65)	Santacruz	SC-372
Alexa647 F (ab ') 2 keçi anti-tavşan IgG	Invitrogen	A21246
DAPI	Invitrogen	D21490
ImageStream X	Amnis

Hücre tipi	FITC	PE	Alexa 647	PacBlue
Monosit		CD14	NF-KB (p65)
MDC	Lin1	CD11c	NF-KB (p65)	CD4
PDC	Lin1	CD123	NF-KB (p65)	CD4