Diyabetik Sıçanlarda Termal Nosiseptif Eşik Hızlı Belirlenmesinde

Özet

Burada, biz, sıçan ya da fare nocifensive davranışı göstermek olduğu en düşük sıcaklık belirlemek için hızlı, güvenilir ve basit bir prosedür tarif Yani Termal nosiseptif eşiği (TNT). Eğer varsa bu yöntem hayvanlara, stres, en az TNTs hassas ve tekrarlanabilir bir tahmini sağlayan bir yavaş artan termal uyaran de geçerlidir.

Özet

Ağrılı diyabetik nöropati (PDN) hiperaljezi, yani zararlı uyarana artmış duyarlılığı ve allodini yani, normalde zararsız ¹ uyaranlara karşı aşırı duyarlılığı ile karakterize edilir. Hiperaljezi ve allodynia ² diabetes mellitus, birçok farklı kemirgen modellerinde incelenmiştir. Ancak, Bölcskei ark, hayvan modellerinde "acı" nın belirlenmesi belirttiği kendi öznel doğası ³ dolayı zordur. Ayrıca, zararlı termal uyaranlara davranışsal tepkileri belirlemek için kullanılan geleneksel yöntemler genellikle tekrarlanabilirlik ve farmakolojik hassasiyeti ³ yoksundur. Örneğin, Ankier ⁴ arasında sıcak plaka yöntemi kullanılarak, kılını, yoksunluk ve / ya da arka-ve / veya ön-pençelerin yalamaya sabit bir yüksek ısı uyarıcılar (52-55 ° C) refleksi olarak ölçülür. Ancak, termal uyarana hiperaljezik hayvanların tekrarlanabilir yeniden farklılıklar görünmüyorbu supra-eşik sıcaklıkları ^3,5 kullanarak esnek gecikmeleri. Bölcskei ve ark. ⁶ arasında yakın zamanda açıklanan bir yöntem olarak, burada açıklanan prosedürler farelerde ve sıçanlarda termal nosiseptif eşiklerinin hızlı, hassas ve kesin olarak belirlenmesi (TNTs) sağlar. Metodu fare / sıçan plantar yüzeyinin derisine uygulanmış çok yavaş artan termal uyaran kullanır. Yöntemi gibi PDN gibi hiperaljezik devletleri sırasında, anti-nosisepsiyon incelemek için duyarlıdır. Körük açıklanan prosedürler Almasi ark ⁵ ve Bölcskei ark ³ ile detaylı olarak yayınlanan olanlar dayanmaktadır. Prosedürler Laboratuar Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (LACUC), Wright State University onaylanmıştır Burada anlatılan.

Protokol

Fare ve sıçanların TNTs kullanılarak belirlenir artan sıcak-plate metre [iHPAM, IITC A.Ş. Yaşam Bilimleri (Woodland Hills, CA)]. ; Veri toplama için bir ısı kontrol ünitesi, yazılım (IITC Bölüm # Yumuşak Serisi 8), bir PC (kişisel altındaki ısıtma sistemi ve yukarıda bir pleksiglas gözlem odası ile bir alüminyum plaka (10 x 20 cm): ekipmanları birkaç bileşenden oluşur bilgisayar) ve bir ayak pedalı uzaktan başlangıç ​​için, durdurmak veya birimin kontrol sıfırlayın. Isıtma sistemi de başlangıç ​​/ durdurma / ekipman önünde bir tuş takımı üzerinden manuel ısıtma sürecinin sıfırlamayı sağlar. IHPAM çeşitli ısıtma hızları, bekleme / eşik sıcaklığa ayarlanabilir.

1. Ekipman Set-up

1. Test hayvanları önce, görsel olarak seçilen ısıtma hızı (örneğin, 6 ° C / dk), başlangıç ​​bekleme ve kesme son sıcaklıklarda (örneğin 28 ° C ile 55 ° C, sırasıyla) corroborate üniteyi inceleyin.
2. Tüm bağlantıları kontrol edin. Sonuçlarının elektronik kopyasını tutmak için, birim Yazılım Serisi 8 çalıştıran bir bilgisayara bağlı olması gerekir. Alternatif olarak, sonuçların sabit kopya birim seri port üzerinden dışarı basılabilir.
3. Ekipmanı test edin. İlk bekleme, son kesme sıcaklıkları ve kesme sıcaklığa ulaşması için gereken saniye cinsinden zamanı: Yazılım Serisi 8 kayıtları veri emin olmak için bir kez ayak basın.
4. Bir başka kontrol testi olarak, deney dahil araştırmacılar kendilerini cihazı tecrübe gerekebilir. Ağrı algı anı (46-48 ° C) saçtan elini çekme ne cilde zarar ne de daha sonraki herhangi bir rahatsızlık oluşturur gerekir.
5. Birimi kurmak ve adımları 1.3 ve 1.4 sonuçları kaydedildi kez onlar karşılaştırılabilir. Bu ünitenin kullanımı geçersiz olabilecek olası sorunları tespit etmek yararlı olur. Örneğin, başlangıç ​​/ nihai bekleme kesme tempe arasındaki uyumsuzluklarratures ve gerçek biriminin okunması ve / veya birimi ve elle çekilmesi için gerekli olan gerçek plaka sıcaklığı ile gösterilen sıcaklıkları arasında farklılıklar.

2. Normal Hayvanlar Test

Ya genç veya yetişkin Wistar rat [post-natal (p) yaşı 21-25 gün], veya herhangi bir genetik arka plan veya cinsiyet farelerde (p21-25) kullanılabilir. Deneylerde kullanılan farelerin suşu C57BL/6J taşımaktadır.

1. Deneyler yapılacak gece önce, iHPAM yerleştirilir bankta kafese koyarak hayvanlar alıştırıldı. Testleri yapılmadan önce iki saat, birimin arka plan gürültü ile hayvanları tanıtmak iHPAM açın. Bu noktada, iHPAM kurmak ve (Adımlar 1) düzgün fonksiyonu doğrulamak için test edilebilir. Yiyecek ve su hayvan (Basamak 2.1) gözlem odacık içinde olması durumu dışında, test boyunca ad libitum sağlanır.
   Not: Bu impdavranışsal deneylerde laboratuar koşullarında varsayılan tarafından kontrol edildiğini varsaymak değil ortant. Özel dikkat davranışsal çalışmalar ⁽⁷ Yorumlar) sonucunu etkileyebilecek genetik ve çevresel faktörlere dikkat edilmelidir.
2. Yavaşça birim ısıtma plakası üstünde Pleksiglas gözlem odasında normal bir fare / sıçan yerleştirin. Hayvan rahat bir davranışı gösterir kadar hayvan ısıtılmış yüzey (° C ile 28 olarak belirlenmiştir) gelmesini bekleyin.
   Not: Bu koşullar altında normal erişkin sıçan koklama sırasında zaman zaman gözlem odasının kapağı yukarı doğru duran, bir ilk keşif davranışı göstermektedir. Birkaç dakika sonra, sıçanlar damat gündelik nöbetleri ve rahat bir davranış gösterebilir. Raslantı Çevreyi koklama ederken Bazen, fareler rahat bir vücut postürü (eğilimli uzantısı) ile yatıyordu. Normal fare genellikle sıçan daha aktiftir. Ancak, fareler i birkaç dakika sonra rahat bir keşif davranışı göstermekgözlem odası n. Bu ya (örneğin, atlama, gözlem odasından kaçmaya çalışırken) kaçan davranışlar veya savunma tutumları (örneğin, squealing) gözlemlemek oldukça nadirdir. Farelerin bir fare diğerine ⁸ ağrı iletişim dikkat etmek de önemlidir. Bu nedenle, ayrı kafeslere yerleştirilir testi fareler için önemli olabilir.
3. Yeri her açıda gözlemler izin vermek, gözlem odasının arka yansıtır. Bir dijital video kamera tutan bir üçayak nocifensive (ağrı kaçınarak) davranış ortaya çıkmıştı hangi anı belirlemek için yardımcı olabilir.
4. Bir kez hayvan ayak basarak plakası kadar gözlem odasında sıcağında rahat. Plaka sıcaklığı 6 ° C / dakika hızında ısındığı zaman, normal hayvanlar ya arka-pençe içeren nocifensive davranışlar 46 ila 48 ° C ^3,5,9,10 için öfkeli * Genellikle sıcaklıklar. Böylece, hayvan gözlemler, tipik çıkarıldı formuduryaklaşık 3 dakika sonra ation odası.
   Not: sallayarak ve / veya kaldırma sırasında bir fare ya da fare yani tipik nocifensive yanıtı gözlemek, arka-pençe, yalama, termal uyaran sona erdirmek için yeterlidir. Bu, ayak pedalı presleme ile elde edilir. Bu noktada, yazılım plaka sıcaklığı kaydeder ve plaka hemen bekleme sıcaklığında (28 ° C) kadar soğur (~ 0.5 dakika) ulaşılır. Bu sıcaklık, yani herhangi bir nocifensive tepki uyandıran bir normal (kontrol) hayvanın zararlı ısı eşiği (TNT) olarak kabul edilir.
   * Bazen, özellikle farelerde, zararlı sıcaklığına nocifensive davranışı ilk görülen veya her iki forepaws (örneğin, otururken yalama), birkaç saniye arka-pençeleri önce olabilir. Bununla beraber, ön-pençe yalamaya bakım davranış normal bir bileşendir. Bundan dolayı, sadece arka pençe-reaksiyonlar değerlendirilir. Durumlarda ise farelerin de onların arka-pençeleri damat olabilir. Ancak, normal bir tımar n doBirkaç saniye öteye ot, yalama yoğun içermez ve genellikle onun pençeleri temizledikten sonra sona erer.
5. Yavaşça plakadan hayvan kaldırmak ve ilgili kafese yerleştirin. Isı eşik ölçümleri daha sonra diğer kontrol (normal) bir hayvan için tekrarlanır.
   Not: TNTs gözlem odasından gelen hayvan çıkarmadan 1-2 dakika aralıklar ile tek bir hayvanda tespit edilebilir. Sıçan ya da fare TNT tespitler birkaç gün içinde birkaç kez tekrarlanabilir. Bu, ortalama bir birey hayvanın TNT yanı sıra, yaş ile değişimlerini belirlemek için özellikle yararlıdır.
6. Kontrol hayvanları TNT, üç ya da daha fazla eşik ± SEM ortalaması olarak ifade edilir.
7. Elde edilen verilerin istatistiksel analizi farelere veya sıçanlara farklı tedavi grupları karşılaştırmak için yapılır. Varyans analizi de dahil olmak üzere Parametrik prosedürler uygun veriler normal dağılım nerede kullanılır ve tedavi gruplarının homo nerede olabilirskedastic; bu koşullar aşağıdaki yaklaşımlar uygulanabilir tatmin edildiğinde. Ile birlikte / tedavi edilmeden veya farklı zaman noktalarında (örn., Şekil 3 içinde verilerin) bireysel TNTs tekrarlanmıştır birden ölçümleri yani farklılıklar tespit etmek için Newman-Keuls testi, ardından varyans analizi. Eşleştirilmiş Student t-testi ilaç tedavisinden sonra vs önce iki veri grupları, yani TNTs karşılaştırmak için kullanılabilir; t-testi eşleştirilmemiş (örneğin araç ile tedavi edilen hayvanlar vs uyuşturucu tedavi edilen TNT değişiklikler farklılıkları belirlemek için kullanılabilir Şekil 4, veri).

3. Diyabetik Hayvanlar Test

Streptozotosin (STZ) ile diyabet sıçan PDN mekanizmaları incelemek ve analjezik ilaçlar ve tedaviler ^11,12 değerlendirmek için en sık kullanılan hayvan modelidir. Sıçanlar STZ bir intraperitoneal tek doz (60 mg / kg) olabilir b tarafından yapılan diyabetike diyabet ¹¹ başlangıcından sonra ^3. haftasında termal hiperaljezi için test. O değil tüm diyabetik sıçanlarda PDN geliştirmeye dikkat etmek önemlidir. Bununla birlikte, hiperaljezi (~% 50) geliştirmek mi hayvanların kolayca tespit edilebilir. Gerçekten de, kendi TNTs Normal * daha düşüktür.

C yerine, 28 * STZ-diyabetik sıçan TNTs belirlemek için, 15 bir başlangıç ​​plaka sıcaklığı ° C kullanılır. Bu değişimin nedeni PDN ile en diyabetik hayvan hiperaljezik ^2,11 olması bekleniyor olmasıdır. Bu nedenle, normal zararlı ısı eşikleri daha düşük olacaktır (örneğin, <45 ° C).

1. A, diyabetik sıçan test cihazının üst kısmında gözlem haznesi yerleştirilir. Hayvan, hayvan rahat bir davranışı gösterir kadar plaka yüzeyine gelmesini izin verilir.
   Not: Tipik olarak, bir diyabetik sıçan normal davranış çok göstermez. Diyabetik sıçanlarda uyuşuk, genellikle hipoaktif vardır; genellikle gösterenhareket kısıtlılığı ve yavaş tımar. Bu gözlem odasının kapağı doğru sıralamalar gözlemlemek nadirdir. Birkaç dakika sonra, diabetik ratlarda sakince rahat çevrenin koklama ile, odanın bir köşesinde kalabilirsiniz.
2. Diyabetik hayvan gözlem odasında rahat bir kez diyabetik sıçan arka / ön pençesini ya içeren nocifensive davranışlar gösterebilir Adım 2.3 gibi, plaka ısıtılır. Bu genellikle zararlı olmayan plaka sıcaklıkları (örneğin, <45 ° C), ya da 6 ° C / dk sıcaklık artışı ile birlikte odasında en fazla 5 dakika sonra olur.
   Not: Bir genç erişkin diyabetli sıçanlarda nocifensive tepkisi normal bir sıçan bu farklı değildir. Ancak, bu tür davranışları çağrıştıran en düşük sıcaklık önemli ölçüde azaltılmaktadır.
3. Adım 2.4 bak
4. Deney günü içinde üçten fazla eşiklerinin ortalama ° C olarak ifade edilen ortalama ± SEM diabeti bir zehirli ısı eşik olarak kabul edilirc hayvan.
   Not: birine benzer bir paradigma normal veya diabetik ratlarda için açıklanan ısı eşiklerinde analjezik termal anti-nocifensive etkisini belirlemek için takip edilebilir.

4. Test Analjezi

Ilaçların anti-nosiseptif özellikleri (örn., analjezikler) yanı sıra, bu en az etkili bir doz olarak farmakolojik parametrelerinin belirlenmesi kolayca yukarıda anlatılan aşamalara göre elde edilebilir. Bu sıçanlar / farelere bir analjezik uygun dozlarda kendi TNTs artacağı tahmin edilmektedir. Bu termal hiperaljezi ³ olan hayvanlarda, özellikle duyarlıdır. Ancak, sonuçların yorumlanması önyargı önlemek için, bir hayvan grubunun davranış gözlem katılan araştırmacılar bilmek ya da hayvanların tedavi veya değil olsaydı farkında olmamalıdır. Ayrıca, gözlemci tarafından enjekte edilecek ilaçların başka bir araştırmacı tarafından hazırlanan ve etiketli olabilirA, B, C, vb Dozaj tanımlanan hayvan başına tek tek doz listeleyen bir çıktı sağlanmaktadır.

Test edilecek ilaç ile ilgili olarak, potansiyel bir analjezik farklı dozlar normal veya diabetik hayvanlar 5-15 dakika önce, davranış testleri için de uygulanabilir. Uygun denetimleri dahil (örneğin, taşıt enjekte yaştaki hayvanlar tek başına ve / veya PDN olmayan diyabetik sıçan) ve (plaka örneğin, aynı başlangıç ​​sıcaklığı) aynı koşullar kullanılarak test edilmelidir. Ilaçların kronik etkileri de test edilebilir.

5.. Temsilcisi Sonuçlar

Genç yetişkin, normal olmayan sıçanlarda veya farelerin ya arka-pençesinde nocifensive reaksiyonlar çağrıştıran düşük plaka sıcaklığı 2-6 aşağıdaki adımları 2-1 belirlendi. Şekil 1 normal, genç yetişkin sıçan ve farelerin TNT gösterildiği gibi idi 47.2 ± 0.2 ° C ve 47.5 ± 0.5 ° C idi.

Biz obse varbireyin TNTs (Şekil 2A), ne de aynı yaştaki bireylerin (Şekil 2B) arasında TNTs önemli değişiklikler SVEd ne önemli günlük değişim. Cinsiyet nedeniyle TNT farklar (gösterilmemiştir) görülmedi.

Genç erişkin STZ-diyabetik sıçan TNTs normal farelere (Adımlar 3,1-3,3) için de benzer bir şekilde belirlenmiştir. Ancak, başlangıç ​​plakası sıcaklığı 15 ayarlandı ° C yerine 28 ° C STZ-diyabetik sıçan nocifensive davranışının bir birey içinde ve onbir gün post-STZ enjeksiyon başlangıç ​​günlük bir şekilde, en az üç kez değerlendirildi. Şekil 3, STZ-diyabetik sıçan TNT önemli bir düşüş (p <0.01) 'de gösterildiği belirgindir iki hafta post-STZ enjeksiyon hale gelir. STZ-diyabetik sıçanların ortalama TNT 45.6 ± 0.1 ° C (n = 16, 14-23 gün birikintilerini değerleri).

Norma göre anlamlı derecede düşük TNT sergileyerek Diyabetik sıçanlardal PDN olarak değerlendirildi. Bunlar, sıçanlar, bir analjezik, anti-akut nosiseptif özellikleri (bileşik A) test etmek için kullanıldı. TNTs beş dakika testinden önce tek başına bileşik veya aracı ya tek bir dozunun enjekte normal ve diyabetik sıçan belirlendi. Aracın tek başına (45.6 ° C vs 47.6 ° C, sırasıyla) ile tedavi edilen sıçanlarda karşılaştırıldığında, Şekil 4'te gösterildiği gibi, bileşiğin tek bir doz periton içi önemli ölçüde diyabetik sıçan TNTs artmıştır. Bileşik A ve anti-nocifensive etkisi ayrıca normal farelere görülmüştür;. Önemlidir (p <0.01), bu daha az belirgin (47.4 ° C vs 48.0 ° C, sırasıyla) olmasına rağmen,

Şekil 1.. Normal yetişkin genç sıçan veya fare TNTs Tayini: erişkinlerde sıçanları (p21-24) veya farelerin (P20-21) arasında TNTs adımları abo anlatılanlara iHPAM test edilmiştirettik. 12, sıçan ve farelerin 25 arasında olan toplam test edildi. Ölçümleri birkaç gün içinde yapıldı ve sonuçlar toplandı. Sonuçlar ortalama ± SEM olarak ifade edildi. Bu fareler kaydedilen minimum ve maksimum değerler TNT 46.2 ° C ve 48.6 ° C idi. Farelerin durumunda, kayıt maksimum ve minimum değerlerinin TNT sırasıyla 48.8 ° C ila 44.9 ° C idi.

Şekil 2. Sıçanlar ve fareler TNTs Yaşı-bağımlılık: A) çizilen 5 gün boyunca en az günde üç kez tespit yaş 21 gün dört normal ratlar (n = 4) TNTs olan B) farelerin TNTs belirtilen bir kez tespit littermates. yaşları. Her belirlenmesi nokta üst üste sayılar kullanılır littermates sayısını temsil eder.

Şekil 3. Diyabetik sıçanlarda hiperaljezik 3 haline bizDiyabetin başlangıcından sonra eks: altı (n = 6) yaşça genç erişkin STZ-diyabetik sıçan TNTs 11 gün diyabet sonrası indüksiyon başlangıç ​​her gün belirlendi. TNT günlük ortalamalar (ortalama ± SEM) gösterilir. 11-13 gün sonrası STZ enjeksiyonu arasında tespit Diyabetik TNTs normal sınırlarda (kırmızı çizgi) içinde idi. STZ enjeksiyonu TNTs 45.1 olarak ölçüldü İki hafta sonra ± 0.4 ° ​​C (p <0.05).

Şekil 4. STZ-Diyabetik sıçanlarda bileşik B Akut anti-nocifensive etkiler. Genç erişkin normal farelere (mavi grubu n = 12) ve yaş STZ-diyabetik sıçan hiperaljezik (yeşil grubu n = 6) araç intraperitoneal sonra iHPAM test edilmiştir eşleştirilmiş (koyu çubuklar) ya da bileşik, A (açık çubuklar). Her bir işlem (aracın kontrolü ya da bileşik, A-arıtılmış) için ortalama ± SEM TNT gösterilmiştir. Asteriskler istatistiksel olarak farklılık göstermek(P <0.05).

Tartışmalar

Benzer şekilde termal hiperaljezi ^4,13 ölçmek için klasik hot plate testi, nosisepsiyon tayininde burada açıklanan sıçanlar ve fareler nocifensive davranışı ölçmek için hızlı ve güvenilir bir şekilde izin verir. Ancak, klasik test aksine, artan sıcak-levha yöntemi non-invaziv ve neredeyse stressiz olduğunu. Dizginlemek bazı (yani, hayvanın gözlem odasında olmalı) testi gerçekleştirmek için gerekli olmakla birlikte, sıçan ya da fare benzeri alanlarda (örneğin,...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isim	Şirket	Katalog numarası
Artımlı Hot-Plate Analjezi Metre	IITC A.Ş. Yaşam Bilimleri	Part # PE34
Yumuşak Serisi 8	IITC A.Ş. Yaşam Bilimleri	Part # Series8
Streptozosin	Calbiochem	572201