JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Amperometrik tekniği spontan dopamin oksitlenmeye tarafından üretilen oksidatif akımı algılayarak tek bir hücreden dopamin salınımını ölçer. Eşzamanlı gerilim kelepçe ve amperometri metodolojisi dopamin taşıyıcısı ve dopamin ters taşıma Bu faaliyetin düzenleyici rolünün genel "faaliyet" arasındaki mekanistik ilişki bulunmaktadır.

Özet

Sinaptik aralıkta dopamin içine yayımlanmasından sonra onun öncesi ve post-sinaptik hedeflere 1 yoluyla biyolojik özelliklerini uygular. Dopamin sinyali difüzyon 2-3, ekstraselüler enzimler 4, ve membran taşıyıcıları 5 ile sonlandırılır. Dopamin nöronlarının peri-sinaptik aralıkta bulunan dopamin taşıyıcısı, bir içe dopamin akı (uptake) aracılığıyla serbest aminler temizler. Dopamin taşıyıcısı da dışa aktarım veya dopamin 5 efflux denilen bir süreçle içeriden dışarıya aminler serbest ters yönde çalışabilir. . Ileri (uptake) ve ters (effluks) 5: daha 20 yıl önce Sulzer ark dopamin taşıyıcısı iki faaliyet modlarında çalışabilir bildirdi. Taşıyıcı aracılığıyla akış üzerinden serbest nörotransmitter olan hücre dışı alanı için dopamin büyük bir miktarı hareket edebilir, ve hücre dışı dopamin saat içinde önemli düzenleyici bir rol oynadığı görülmüştüromeostasis 6. Burada simultane yama kelepçe ve amperometri kayıt membran potansiyeli denetlenir milisaniyelik zaman çözünürlüğü ile effluks mekanizması yoluyla serbest dopamin ölçmek için nasıl kullanılabileceğini açıklar. Bunun için, tüm-hücre akım ve oksidatif (amperometrik) sinyalleri bir Axopatch 200B amplifikatör (Moleküler Cihazlar, tam hücreli geçerli kayıt için 1.000 Hz bir alçak geçiren Bessel filtre seti ile) kullanılarak eş zamanlı olarak ölçülür. Bir karbon fiber elektrot kayıt amperometri, ikinci bir amplifikatör (Axopatch 200B) bağlı olan ve plazma zarına bitişik yerleştirilen ve +700 mV tutulur için. Tüm-hücre ve oksidatif (amperometrik) akımları kaydedilebilir ve akım-voltaj ilişkisi bir voltaj adımı protokol kullanılarak oluşturulabilir. Konsantrasyon ile dönüştürülmesini gerektirir olağan amperometrik kalibrasyon aksine, mevcut etkin hacmi 7 dikkate alınmadan hemen rapor edilir. Bu nedenle, sonuçta elde edilen verilerBazı verici toplu çözüm için kaybolur, çünkü dopamin efflux bir alt limit temsil eder.

Protokol

1. Ekipman ve Malzemeleri

  1. Arka plan gürültüsünü azaltmak için anti-vibrasyon tablosu (TMI) üstüne bir Faraday kafesi monte edin.
  2. Eşzamanlı yama klemp amperometri kayıt sistemi mükemmel DIC optik ve uzun bir çalışma mesafesi lensi ile bir inverted mikroskop gerektirir. Bir araba aküsüne feneri mikroskop bağlayın. Bu sistem için DC ışık kaynağı daha fazla elektriksel gürültüyü azaltır.
  3. Hidrolik mikromanipülatörler (Siskiyou) daha azalma gürültü. Bizim yapılandırmada, tüm hücre kayıt için sağ elle manipülatör ve amperometri için uzattı sol kullanın.

2. Kayıt için elektrotlar hazırlayın

  1. P-2000 çektirmesi (Sutter) üzerine kuvars pipetler kullanarak yama elektrotları çekin. Bizim çekme iki ısı döngüleri, yaklaşık 5 saniye sürer. Bu ısı zaman bizim bütün hücre yama pipetler tutarlı direnci (MΩ 3-4) sonuçlandı.
  2. Ile elektrot doldurun2 mM dopamin ve sağ manipülatör üzerine monte içeren pipet çözüm. Alüminyum folyo ile DA içeren pipet çözüm tutarak kapsayıcı sarın. Buz üzerinde tutun. Dopamin okside olduğunu. Işıktan korunmuş buz üzerinde çözelti tutulması dopamin oksidasyon oranını azaltır.
  3. Yavaşça, saklama kutusu bir ProCFE (Dagan) düşük gürültü karbon fiber amperometrik elektrot kaldırmak amperometrik adaptörü (Şekil 1'de gösterildiği gibi) üzerine civa, bağlama ile doldurmak ve ardından sağ maniupulator üzerine monte edin. Karbon fiber ucunda tutarak zarar karbon fiber ucu koruyun. Ucu temiz ve sağlam olduğundan emin olmak için bir laboratuvar mikroskop ile elektrot inceleyin.
  4. Harici bir çözüm içeren bir cam alt Petri kabındaki elektrot koyarak amperometrik elektrot bütünlüğünü inceleyin. Dopamin yokluğunda bir temel akım kaydedin. Yemek için bir 1mM DA solüsyonu 10 ul ekleyin. İyi bir amperometrik elektrot yenidenkordonlar oksidatif Geçerli bir artış. Belirli amperometrik elektrot düzgün çalışır hale getirmek için her deney başlangıcında ve sonunda bu adımı yineleyin.

3. Glass Bottom Petri Yemekleri Dopamin Transporter ifade için tasarlanan Dopamin Nöronlar veya Hücreleri İlköğretim Nöronal Kültür hazırlayın

  1. Yavaşça sıcak dış çözeltisi ile hücre veya dopamin nöronları üç kez yıkayın.
  2. Mikroskop sahneye cam alt Petri kabı monte edin.

4. Hücre görselleştirin ve Deney gerçekleştirin

  1. Açıkça hücreleri görselleştirmek için doğru odak noktasını bulun. Yama elektrot üzerinde pozitif basınç yerleştirin. Sonra, yavaşça çözelti içerisine iki elektrot aşağı getirmek ve hücreye kapatın.
  2. Hücre (sol tarafta) ve sağdaki yama elektrot yanındaki amperometrik elektrot yerleştirin.
  3. Yama elektrot ile hücre üzerinde bir gigaohm mühür ulaşmak. Emme ile Rüptürü mühürtüm hücre yapılandırma elde.
  4. Hücre içine dopamin içeren iç çözüm diyaliz için 5-8 dk bekleyin.
  5. İstenilen voltaj adım veya rampa protokolü kullanın. Membran potansiyeli yama pipet aracılığıyla kontrol edilirken aynı anda yama pipet ve tüm hücre akımları ölçmek ve dopamin taşıyıcısı vasıtasıyla dopamin transport ters amperometrik elektrot hem veri elde.

Sonuçlar

Amperometri Kombine yama klemp voltaj bağımlı DAT-aracılı DA effluks. Şekil 2A intraselüler ortam ve membran potansiyeli tam hücreli yama pipet ile kenetlenir DAT-aracılı DA effluks temsilcisi deney yapılandırma ve kayıt gösterir ölçebilirsiniz. Bu tekniği kullanarak, YFP-DAT proteinleri ifade hücreleri olan gerilim-kenetlenmiş bir amperometrik elektrot plazma zarı (Şekil 2A) üzerine alınırken bir bütün hücre yama pipet ile. Bütün hücre elektrot 2 mM DA iht...

Tartışmalar

Eşzamanlı voltaj-klemp ve amperometri aşağıdaki faydaları vardır. Tüm hücre tipleri tarafından erişilebilir ve kayıt için kullanılabilir. Kayıtları yapılır hücreleri veya nöronun tespiti basit ve anlaşılırdır. Hücre floresan ilgili proteini ile bir floresan etiket ekleyerek işaretli olarak, özellikle deneyi kolaylıkla hedef hücre ya da nöron seçebilir. Konfigürasyonu deneysel yama pipet yoluyla, veya banyo solüsyonu 10, bu ajanların ilave edilerek ya da farmakolojik ajanlar i...

Açıklamalar

Çıkar çatışması ilan etti.

Teşekkürler

Biz bu elyazmasının eleştirel yaklaşım Dr Sanika Chirwa ederim. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (DA026947, DA021471 ve NS071122) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Ekipman
Anti-titreşim tablo w / faraday kafesi Teknik İmalat Corporation 63-500 serisi biz modeli 63-543 kullanın
Ters mikroskop Nikon TE-2000 Nikon üretilmiyor şimdi Eclipse Ti
İki düşük gürültülü yükselteçler axopatch 200b Molecular Devices 800-635-5577
1-CV 203 BU headstage Molecular Devices 800-635-5578
1-HL-U pipet tutucu Molecular Devices 800-635-5579
Digidata 1440A A / D dönüştürücü Molecular Devices 800-635-5580
İki manipülatörler Siskyou, solve sağ teslim Siskiyou MX6600R MX6600L 877-313-6418
Lazer pipet çektirmesi Sutter Aletleri P-2000 888-883-0128
Düşük gürültü karbon fiber amperometrik elektrot ProCFE www.dagan.com
Düşük gürültü kuvars pipet Sutter Aletleri QF100-70-7,5 888-883-0128
12-volt araç aküsü yaygın olarak kullanılabilir
Araç şarj cihazı yaygın olarak kullanılabilir
Reaktif
Sodyum klorür (NaCl) Sigma S7653
HEPES Sigma H3375
Üzüm şekeri Sigma G7528
Magnezyum sülfat (MgSO4) Sigma M2643
Potasyum fosfat tekbazlı (KH 2 PO 4) Sigma P5655
Potasyum klorür (KCl) Sigma P9333
Kalsiyum klorür dihidrat (CaCl2 • 2H 2 0) Sigma 223506
Magnezyum klorür hekzahidrat (MgCl2 • 6H 2 0) Sigma M2670
EGTA Sigma E0396

Referanslar

  1. Michael, A. C., Ikeda, M., Justice, J. B. Mechanisms contributing to the recovery of striatal releasable dopamine following MFB stimulation. Brain Res. 421, 325-335 (1987).
  2. Gonon, F. Prolonged and extrasynaptic excitatory action of dopamine mediated by D1 receptors in the rat striatum in vivo. J. Neurosci. 17, 5972-5978 (1997).
  3. Sulzer, D., Pothos, E. N. Regulation of quantal size by presynaptic mechanisms. Rev. Neurosci. 11, 159-212 (2000).
  4. Napolitano, A., Cesura, A. M., Da Prada, M. The role of monoamine oxidase and catechol O-methyltransferase in dopaminergic neurotransmission. J. Neural. Transm. Suppl. 45, 35-45 (1995).
  5. Sulzer, D., Maidment, N. T., Rayport, S. Amphetamine and other weak bases act to promote reverse transport of dopamine in ventral midbrain neurons. J. Neurochem. 60, 527-535 (1993).
  6. Salahpour, A., et al. Increased amphetamine-induced hyperactivity and reward in mice overexpressing the dopamine transporter. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4405-4410 (2008).
  7. Khoshbouei, H., Wang, H., Lechleiter, J. D., Javitch, J. A., Galli, A. Amphetamine-induced dopamine efflux. A voltage-sensitive and intracellular Na+-dependent mechanism. J. Biol. Chem. 278, 12070-12077 (2003).
  8. Goodwin, J. S., et al. Amphetamine and methamphetamine differentially affect dopamine transporters in vitro and in. , 284-2978 (2009).
  9. Kahlig, K. M., et al. Amphetamine induces dopamine efflux through a dopamine transporter channel. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 3495-3500 (2005).
  10. Swant, J., Chirwa, S., Stanwood, G., Khoshbouei, H. Methamphetamine reduces LTP and increases baseline synaptic transmission in the CA1 region of mouse hippocampus. PLoS One. 5, e11382 (2010).
  11. Gnegy, M. E., et al. Intracellular Ca2+ regulates amphetamine-induced dopamine efflux and currents mediated by the human dopamine transporter. Mol. Pharmacol. 66, 137-143 (2004).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

N robilimSay 69H cresel BiyolojiFizyolojiT pSimultane Patch Kelep e ve voltametripotansiyostatik In Vitro VoltametriDopaminOksidasyonT m h cre Patch Kelep eDopamin TransporterTers ula t rmaat k

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır