Büyüme Mycobacterium tuberculosis Biyofilmler

Özet

Belli koşullarda kültüre zaman Mycobacterium tuberculosis ilaç hoşgörülü biyofilm oluşturmaktadır. Burada kültür M. yöntemleri tarif tuberculosis biyofilmler ve ilaç tolerans persisters sıklığını belirlenmesi. Bu protokoller M. ilaç hoşgörü mekanizmalarına daha sonraki çalışmalar için faydalı olacaktır tüberküloz.

Özet

Mycobacterium tuberculosis, insan tüberküloz etyolojik ajan, antibiyotikler de dahil olmak üzere çevresel streslere karşı hayatta kalabilmek için olağanüstü bir yeteneği vardır. Rağmen M. stres toleransı tüberkülozu, tüm tüberküloz ¹ 6 aylık uzun kemoterapi olasılıkla katkıda biridir, patojen bu özelliği fenotip altında yatan moleküler mekanizmaları tam olarak bilinmemektedir. Birçok mikrobiyal türlerin biyofilm ^2-4 olarak adlandırılan son derece organize, bağlı yüzey ve matris kapsüllü yapılarda kendine montaj tarafından stresli ortamlarda hayatta kalmak için evrildi. Topluluklarda Büyüme mikropların tercih edilen bir hayatta kalma stratejisi gibi görünüyor, ve yüzey eki, hücrelerarası iletişimi ve hücre dışı polimerik maddelerin sentezi (EPS) ^5,6 düzenleyen genetik bileşenleri yoluyla elde edilir. Çevresel strese toleransı olasılıkla physiolo belki de EPS kolaylaştırdı ve birbiyofilmlerin ⁷ karmaşık mimarisi içindeki heterojen mikroçevrelerde bireysel basilinin cerrahi adaptasyonu.

Son kağıtları bir dizi biz kurduğu M. tüberküloz ve Mycobacterium smegmatis'in fazla 50 kez anti-tüberküloz ilaçlar izoniazid ve rifampisin ^8-10 minimal inhibitör konsantrasyonları tolere edebilir biyofilm olarak adlandırılan organize çok hücreli yapılar büyümeye güçlü bir eğilimi, var. M. ortamı gibi bir atmosfer havası ile ⁹ arasında, sınırlı değişimi: tüberküloz, bununla birlikte, ilgi çekici tepe boşluğu özellikle 9:01 oranında olgun biyofilmlerde, oluşturmak için spesifik koşulları gerektirmektedir. Özel çevre koşullarının Gereksinimleri muhtemelen o M. gerçeği ile bağlantılı olabilir tüberküloz, zorunlu insan patojeni ve böylece doku ortamlara adapte olmuştur. Bu yayının biz kültür M. yöntemleri göstermek tüberkülozbir şişe ve bakteriyolojik yanı sıra genetik çalışmalar için uygun bir 12 de plaka biçiminde biyofilmler. Biz, M. olarak zayıflatılmış bir suş için protokol tanımlamışlardır patojen ⁹ in vivo büyüme için kritik olan iki lokus, panCD ve RD1, silinmek ile tüberküloz, mc ² 7000,. Bu şekil değiştirme güvenle ve böylece pahalı bir BSL-3 tesisinin ihtiyacı kaçınarak tuberculosis patojenin temel biyolojisi anlamak için bir BSL-2 çevreleme kullanılabilir. Yöntem diğer kültürleştirilebilir mikobakteriyel türlerin biyofilm büyümeye, medya uygun modifikasyon ile uzatılabilir.

Genel olarak, kültür mikobakteriyel biyofilm yeknesak bir protokol mikobakteri temel esnek özellikleri eğitim ile ilgilenen araştırmacılara yardımcı olacaktır. Ayrıca, büyüyen mikobakteriyel biyofilmlerin açık ve özlü bir yöntem de, klinik ve ilaç inv yardımcı olacaktırestigators potansiyel bir ilacın etkinliğinin test etmek için.

Protokol

1. M. yetiştirilmesi biyofilm Bir 250ml vida kapaklı şişe içinde tüberküloz

1. Ortam hazırlanması: su içinde 900 ml gliserol 60mL, ferrik amonyum sitrat ve 0.05g MgSO ₄ KH ₂ PO _4, 0.5g, L-asparagin 4g, sitrik asit 2g, 0.5g eritilir. NaOH ile pH 7.0 'a ayarlanır. Otoklav, serin ve hemen önce deney başlamadan,% 0.1 w bir son konsantrasyon steril ZnSO ₄ / ekleme v Mc ² 7000 pantothenat auxotroph olduğundan bu gerginlik de son konsantrasyon 10μg/mL az pantotenik asit gerektirir.

Not: Bu M. tüberküloz için kullanılan Sauton medya standart bir bileşimidir. Gerekirse Bununla birlikte, diğer özel ortam, aynı zamanda, diğer mikobakteriyel türler için de kullanılabilir.

2. Mikroorganizma hazırlık: M. Grow 0.05% 0.7 ila 1.0 arası bir hafta boyunca Tween-80, veya OD ₆₀₀ ile 7H9OADC tüberküloz. Culture doğrudan bir 1:100 azından aşı malzemesi olarak kullanılabilir.
3. Bir 250ml vida kapaklı polistiren şişe (Corning) için Sauton medyasının 25mL dağıtın. Çok sıkı, orta kap şişe inokulum 250μl ekleyin ve 3 hafta boyunca nemli 37 ° C inkübatör içinde bozulmamış yerleştirin. Hiçbir kirlenme var olmasını sağlamak için her gün bir kez şişe gözlemleyin.
4. Üçüncü haftanın sonunda, M. ve daha da büyüme izin vermek için şişe kap gevşetmek arayüzü de tüberküloz. Kap bu aşamada gevşek değilse o kapta yetersiz oksijen konsantrasyonu bakteri daha fazla büyümesini frenleyeceğini.

2. M. Büyüme 12-iyi plakaları tüberküloz biyofilm

1. Kesitler A1 ve A2 açıklandığı gibi mc ² 7000, medya ve inokulum hazırlayın.
2. Inokulum 600μl ile medya 60mL karıştırın. 4.5m DağıtmaPlakanın her oyuğuna karışımının L. Kapaklı Kapak plakası. Parafilm ile plakası birkaç kez kaydırmak. 5 hafta boyunca 37 ° C'de nemli inkübatörde rahatsız plaka inkübe edin.

3. M. ilaç tolerans persisters sıklığını belirlenmesi tüberküloz biyofilmler

1. M. Grow B. Bu bölümde tarif edildiği gibi, bir 12-gözlü formata tüberküloz biyofilmler yaklaşık 5-hafta toplam alacaktır.
2. Biyofilmler olgunlaştı edildikten sonra (kuluçka 5 hafta sonra), pipetle bir mikrotip kullanarak biyofilm altındaki medya içine istenen konsantrasyonda antibiyotik tercih enjekte.

Not: pellicles altındaki medya hacmi yaklaşık 3.0mL azaltır. Bu yüzden araştırmacılar buna göre ilaç miktarı hesaplamak gerekir.

3. Girdap antibiyotik iyice ortamda yayılır yavaşça böylece plaka. Istatistiksel olarak anlamlı sonuçlar için, antibiyotik enjektedört kuyu otik. Buna paralel olarak, antibiyotik diğer dört kuyu içinde eritildi içinde çözücünün aynı hacimde enjekte ve dokunulmamış plakasının son dört kuyu bırakın. Kapaklı Kapak plakası ve plaka etrafında parafilm taze katmanları koymak. Istenilen süre inkübatöre geri yerleştirin.
4. İnkübasyon sonunda, plaka açmak ve kuyu her birinde% 0.1 nihai konsantrasyonu (hacim / hacim) ile Tween-80 ekleyebilir. Girdap deterjan üniform dağıtılması için hafifçe tüm plaka. 15 dakika oda sıcaklığında inkübe plakası. Ki tüm içerik üniform bir 15 mL konik tüpe aktarılır, böylece pipetle birkaç defa, her sıra içeriği karıştırılır.
5. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 4000rpm tüpün içeriği aşağı doğru dönmeye başlayacaktır. Taze yıkama tamponu (% 10 gliserol ve% 0.05 Tween-80 ile birlikte PBS) ile 5ml pelletini. Yıkama üç kez tekrarlayın. 5 ml'lik yıkama tamponu içinde pelletini. O için rocker üzerinde tutun4 azından vernight ° C.

Not: düşük sıcaklıkta başlangıçta M. smegmatis (dispersiyon sırasında büyümesini en aza indirmek üzere) için geliştirilen ve aynı zamanda M. Tuberculosis için kullanılabilir olmasına rağmen, yavaş büyüyen türler, büyük olasılıkla sonucu üzerinde bir etkisi olmaksızın, oda sıcaklığında sallandı edilebilir. BSL-3 tesisi çalışma durumunda, oda sıcaklığında sallanan gerekli olabilir.

6. , Uygun boyuta geniş sonunda kesme şırıngaya oturtmadan ve parafilm ile sararak mikrotip (2-200μl) ile donatılmış steril bir şırınga hazırlayın. Ucuna takılmış şırınga yoluyla tüpün tüm içerik geçmesi ve yeni bir 15 mL tüpler birikir. Eğer oldukça homojen bir süspansiyon gözlemlemek kadar bu adımı 5 ila 6 kez tekrarlayın.
7. Her iyi canlı koloni sayısını belirlemek için 7H11OADC plaka üzerine süspansiyon ve plaka dilüsyonları seri dilüe. 37 ° C inkübatör üç hafta süreyle inkübe edin. Frekanslar belirleyinÇözücü muamele plakalar üzerinde elde edilenler ile muamele antibiyotik olarak elde koloni sayısı oranı hesaplayarak biyofilm popülasyonda persisters arasında cy.

4. Temsilcisi Sonuçlar

M. bir şişe kültüre, büyüme tüberküloz ilk hafta sonuna Şişenin taban görülebilir. Hava-medya arayüzü de büyüme üçüncü haftasında (Şekil 1A) sonunda sürekli görünür olmasına rağmen ikinci haftanın sonunda, hava-medya arayüzü üzerinde bakteri yamalı büyüme görülebilir. Bu zamanda, kabın duvarına bakteri eki de gözlemlenmiştir. Bu noktadan itibaren kültür büyüme esas olarak hava arayüzü ortam üzerinde oluşur. Yüzey büyüme altında sıvı açıktır. Tipik olarak, yapının beşinci hafta (Şekil 1B) sonuna kadar olgunlaşır. İnkübasyon uzamış ise, yapılar kabın dibine çöker başlayacaktır. Şaşırtıcı,Üçüncü haftanın sonuna kadar kapak sıkma sürecinde önemli bir adım olduğunu ve bilinmeyen nedenlerle gevşek kapaklı şişe önemli arayüz ⁹ büyüme başlatılması geciktirir.

12-gözlü formata olarak, hava-ortam ara yüzeyde sağlam bir biyofilm beş haftalık (Şekil 2A) sonunda her bir kuyu görülür. Plakalar tamamen sarılmış değilse o diferansiyel biyofilm büyüme gözlenmektedir. En kötü durumda, önemli medya buharlaşma bakterilerin büyümesini (Şekil 2B) aksaklık olabilir. Böylece, her iki plakanın sarma buharlaşmasını önlemek için de biyofilm (önceki paragrafta bakınız) için bir ortam sağlamak için gereklidir.

Bu teknik ile belirlenen Biyofilmlererde canlı basil sayısı oldukça tekrarlanabilir olması. M. Tepki tüberküloz biyofilmlerin antibiyotiklerin doğa ile değişir. Örneğin, rifampisin gibi bakterisidal antibiyotik için, canlılık kaybı bipha takip sic eğilim ^9. Nüfusun küçük bir yüzdesi ne olursa olsun antibiyotik veya maruz kalma süresi konsantrasyon antibiyotiklere tamamen inatçı kalan hangi kalıcı bir fazı izler ilk üç ile dört gün boyunca canlılık içinde hızlı bir düşüş. Şekil 3 rifampisin 50μg/mL için 7 günlük maruziyet (MIC göre 50 kat daha yüksek) sonra olgun Biyofilmlererde canlı basil sayısını gösterir.

M. Şekil 1A. Erken görünüm inkübasyon 3 hafta sonra bakterilerin hava-medya arayüzü tüberküloz basili.

Şekil 1B. M. biyofilm Vadesi inkübasyon beş hafta sonra hava-medya arayüzü tüberküloz.

820/3820fig2A.jpg "/>
M. Şekil 2A. 5 haftalık biyofilmler Tüberküloz 12-iyi biçimde büyüdü.

Şekil 2B. Parafilm olmadan 12-iyi plaka M. tuberculosis biyofilm büyümeye bir başarısız girişimi.

M. ilaç hoşgörülü persisters sıklığını gösteren 3. Bir temsilci arsa Şekil Tüberküloz 12-iyi biçimde büyüdü ve yedi gün boyunca Rifampisin ile 50μg/mL maruz Biyofilmler.

Tartışmalar

Mycobacterium tuberculosis enfeksiyonu nedeniyle tüberküloz (TB), küresel halk sağlığı için büyük bir tehdit olmaya devam etmektedir. Dünya nüfusunun yaklaşık üçte biri asemptomatik patojen ile enfekte olduğu tahmin edilmektedir, 9 milyon yeni vaka aktif verem ve enfeksiyonun yaklaşık 1,7 milyon kalıp her yıl ¹¹ belirtileri ile her yıl klinikte göstermek. Hastalık büyük bir yük öncelikle bir aşı ve altı ile dokuz ay boyunca uygulanan bir ilaca rejimi içeren bir derece ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Incubator	VWR international	Model # 1923/25
Polystyrene culture bottles	Fisher Scientific	03-374-300
12-well tissue culture plate	VWR international	62406-165
50-mL conical tubes	VWR international	89039-660
Rocker	Thermo Fisher Scientific, Inc.	57019-662
Chromatographic refrigerator	VWR international	55702-520
petri dish	VWR international	25384-342
KH2PO4 (monobasic)	EMD Millipore	PX1565-1
MgSO4	Fisher Scientific	M65-500
L-asparagine	Sigma-Aldrich	A4284-100G
citric acid	Sigma-Aldrich	C1857-100G
ferric ammonium citrate	Sigma-Aldrich	F5879-100G
glycerol	EMD Millipore	GX0185-5
NaOH	Sigma-Aldrich	S8045-500G
ZnSO4	Sigma-Aldrich	Z4750-500G
D-pantothenic acid	Sigma-Aldrich	P2250-25G
Difco Middlebrook 7H9 Broth	BD Biosciences	271310
Middlebrook OADC Enrichment	BBL	212351
Tween-80	Fisher Scientific	T164-500
250mL storage bottle	Corning	430281
12 well plates	Falcon BD	353043
rifampicin	Sigma-Aldrich	R3501-1G
methanol	JT Baker	9070-05
10mlLsyringe	BD Biosciences	301604
1-200μL pipet tips	VWR international	89079-458
parafilm M	VWR international	PM-996
15mL centrifuge tube	Greiner Bio-One	188-285
Difco Mycobacteria 7H11 Agar	BD Biosciences	283810
NaCl	Fisher Scientific	BP358-1
KCl	Sigma-Aldrich	P9333-500G
Na2HPO4 (dibasic)	Sigma-Aldrich	S0876-500G