Amyotrofik Lateral Skleroz için Fare Modeli (ALS) Klinik Test ve Omurilik Kaldırma

Özet

Amiyotrofik lateral skleroz (ALS) için bir fare modelinde klinik ve davranışsal incelenmiştir. Beraberindeki immünohistolojik analizi için bir önkoşul olarak omurilik hazırlanmasında detaylı bir şekilde anlatılır.

Özet

Amyotrofik lateral skleroz (ALS) motonöronlar ilerleyici dejenerasyon ile sonuçlanan ölümcül bir nörodejeneratif hastalıktır. Başlangıçlı Tepe sporadik hastalık ve ailesel hastalık için 50 yıl 60 yıl civarındadır. Ilerici seyri nedeniyle, hastaların% 50 semptom başlangıcından itibaren 30 ay içinde ölür. Bu hastalığın tedavisi için yeni bir seçenek değerlendirmek üzere, ALS genetik fare modelleri gibi SOD1 (G93A) mutasyonu olarak SOD geni insan ailevi mutasyonlar, esas oluşturulan edilmiştir. Modelinde değerlendirilmesi gerekir en önemli husus, genel sağkalım, klinik seyir ve motor fonksiyon vardır. Burada, klinik değerlendirme göstermek, iki davranışsal motor testleri ile iletim göstermek ve tüm parametreler için kantitatif skorlama sistemleri sağlamaktadır. ALS fare modelinin kapsamlı bir analizi genellikle spinal kord bir immunohistokimyasal inceleme gerektirdiğinden, biz bunu uygulayarak ayrıntılı olarak hazırlanması göstermekrsal laminektomi yöntemi. Örnek histolojik bulgular gösterilmiştir. ALS fare modeli üzerinde çalışmalar tasvir muayene yöntemlerinin kapsamlı bir uygulama araştırmacının güvenilir sonra insan klinik araştırmalar için bir temel sağlayabilir gelecekteki tedavi seçenekleri test sağlayacaktır.

Protokol

Hayvanlar Jackson Laboratory (# 002.726) ¹ den satın alınmıştır. Onlar klinik attı ve motor fonksiyon (rotarod testi) ve kas gücü (tel deneyi asılı) bir teste tabi tutulmaktadır. Tüm bu testleri ve hayvanların daha sonra öldürülmesi omurilik hazırlamak amacıyla hayvan deneyleri bir şekilde yürütülmesi için Yerel yönergelere çok yakın uygun olarak yapılmıştır.

1. Klinik Puan

Apart vücut ağırlığı fareler için değerlendirme aşağıdaki 4 nokta skorlama sistemi ² ile motor defisit belirtileri açısından incelenir:

4 puan: Normal (motor disfonksiyon bulgusu)

3 puan: kuyruk tarafından askıya zaman arka bacak titreme belirgindir

2 puan: yürüyüş anormallikleri mevcut

1 puan: en az bir arka bacak sürükleyerek

0 puan: simetrikfelç, kendisinin sağ yeteneksizliği ve maksimum vücut ağırlığının% 20 kaybı, bu durumda, hayvanlarda hemen ötenazi ve deney sona erdirilir

2. Motor Fonksiyon Testleri ve Kas Gücü

Tel Hanging

Bu test, kas gücü ^{3, 4} değerlendirmek için kullanılmıştır. Tüm hayvanlar en az bir veya iki gün rotarod testinden sonra bu testi yapın. Her fare 0.8 cm aralıklarla özel yapılmış tel kapak yerleştirilir ve dikkatli tepetaklak olur, bir saman üstünde 60 cm alt kaplı. En az 180 s art arda üç kez eğitim aldıktan sonra düşmeye gecikme ölçülür. Her fare, 180 s maksimum ve en uzun süre kaydedilir için ters kapak üzerinde tutmak için üç deneme verilir.

Rotarod Testi

rotarod aparatı (Ugo Basile, Comerio, İtalya) motor koordinasyon, denge ve motor yetenek ^{3, 4} öğrenme ölçmek için kullanılmıştır. İyi bir performans sensorimotor koordinasyonu yüksek derecede gerektirir. Makine test hayvan için Distraktif uyaranlara önlemek için sakin ve rahatsız edici olmayan bir ortamda yer almalıdır. Bu beş fareler için bir bilgisayar kontrollü motorlu dönen milli ve beş şerit oluşur. Farelerin Falls altındaki bir plastik levha üzerine basınç ile otomatik olarak tespit edilir. 15 rpm bir hayvan dönen çubuk kalabilecekleri süreyi sabit bir hızda en az 180 s art arda üç kez eğitim ölçülür sonra. Her hayvan düşüyor kaydedilir olmadan üç denemeler ve uzun gecikme uğrar. Motor koordinasyonu açısından önemli farklılıklar çoğunluğu bu süre içinde tespit edilir, çünkü 180 s zaman kesme süresi olarak seçilmiştir.

3. Omurilik Hazırlık

1. Hayvanlar Yerel yönergelere uygun olarak CO ₂ insuflasyon tarafından öldürüldü ve hemen% 4 paraformaldehit çözümü takip PBS çözeltisi ile transkardiyal perfüze edilir.
2. Kurban fare spinal kord hazırlamak için, bir farenin arka tarafı açığa çıkarmak için hayvanın bir işlem tablosu üzerine yerleştirilir ve dört ayaklarının tarafında sabitlenir.
3. % 70 etanol çözeltisi ile kısa bir yıkama diseksiyon sitesi temizler ve saç kat düzleştirir.
4. Sonra cildin orta hat keskin bir bisturi ile insize edilir. Cilt her iki taraf için gerilir kesme kolaylaştırmak için. Bacak kasları hazırlanacak olursa, onların deri de insize lazım.
5. Cilt insizyonu tamamlandıktan sonra, vücudun alttaki fasyaya maruz cımbız ile kenara çekilir.
6. Boyun ve ense ligament kas ca kaldırılması gerekir ve vardırrefully hazırlanır. Derin ve lezyon omuriliğe kesilirken dikkat edin. Omuz kaslarının daha iyi omurga ortaya koymak için çıkarılabilir.
7. Sonra paravertebral kas tamamını omurga kaldırılır.
8. Omurga çok laminektomileri yapılması gerekir açmak üzere. Bir atlanto oksipital eklem yerinde üst kranial kısmından başlamalıdır.
9. Bu üst iki ekstremite fiksasyon kaldırmak ve ilk vertebra laminektomi gerçekleştirmek için daha iyi yapabilmek için boyun yayılmacılık en kolay yoldur. Bunlar maruz servikal spinal kord dokunmadan çekti edilir.
10. Daha çok omurun açılı ilk makasla her iki tarafında vertebra kemerler transecting ve sonra dorsal işlemleri üzerinde çekme ile kaldırılır. Vertebra Kalan yan kısımlarında omurilik sonra tümüyle kaldırılmasını kolaylaştırmak için çıkarılmalıdır.
11. Lomber spina bir anatomik dönüm noktasıl kordonu da spinal kord mevcuttur kabarma olup.
12. Tüm omurilik laminektomi bitirdikten sonra, aynı zamanda tüm ventral kökleri transeksiyonu ve menenjlerin duramater gelen spinal kord serbest olduğundan emin olun.
13. Daha sonra servikal spinal kord kranialine kesilmiş ve omurilik kaldırmak başlatın.
14. Son olarak omuriliğe de tamamen serbest olması distal kauda-equina kesilir.
15. Sonuçta, omurilik gecede postfixating çözüm (örneğin% 4 paraformaldehit) yerleştirilir ve daha fazla işlenebilir. Biz genellikle immünohistolojik analiz hazırlamak için omurilik cryosection.

4. Temsilcisi Sonuçlar

Omurilik hazırlama tekniği bu video makalenin odak temsil eder. Daha sonra doku kesit ve sonuçta spina ile immünohistolojik analizi için gerekli bir ön koşuldurl kablosu bölümler. Bir sonuç bir örnek olarak, bir wild tip bir fare lumbar spinal kord (wt) ön boynuzu bölge ve bir SOD G93A transgen (Tg) ve bir ayırma işlemlerine tabi tutmak immunohistokimyasal fare gösterilmiştir. Motor nöronlar, bir primer, anti-ChAT antikor ve bir ikincil Cy3 antikoru ile sonradan flüoresan etiketleme ile tespit edilebilir. Buna ek olarak, DAPI (4,6-diamidino-2-fenilindol) ile bir karşı-Nükleer leke (Şekil 1) yapılmıştır.

Şekil 1. Anti-ChAT antikor (kırmızı) ve wild tip (ağırlık), fare lomber spinal kord ön boynuz (solda) ve bir DAPI (mavi) ile hücresel çekirdekleri karşı leke ile motonöronlar ve İmmuno görselleştirmek Floresan fotomikrografı Bir SOD G93A transgenik (tg) (sağda) 130 gün yaşındayken fare. Ölçek çubuğu: 40 mikron.

Ve immünohistokimyasal analiziSOD G93A farelerin bu makalenin ana kapsamında değildir bu transgenik fareler karakterize edildiği orijinal yayın ve diğer referans ^{1, 5, 6} yönelik tedavi yaklaşımları incelemek daha yeni olanlarla danışın. Tedavi edici etkileri açıkça tanımlanmış immünohistolojik düzeyde ayırt edilir ise kantitatif değerlendirme algoritmaları stereolojik bir yazılım (örneğin ⁷⁾ tarafından desteklenen uygulanan edilmelidir.

Tartışmalar

SOD1 (G93A) genetik fare modelinde insan Amyotrofik lateral skleroz ⁸ karşılaştırılabilir ilerleyici motor nöron kaybı, hastalığın klinik seyrini incelemek için değerli bir hayvan modelidir. Farklı tedavi paradigmalarının çeşitli bu modelin içinde değerlendirilerek daha sonra insan klinik çalışmalarda ^8-10 test için bir temel temsil edilmiştir. Bu farelerde deneysel bir tedavi çalışmasında önemli farklılıklar tespit edebilmek için, en az 24 çöp eşleştirilmiş cin...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
	Üretici	Sipariş Bilgileri
Davranışsal test
Fareler için Rota-Rod	Ugo Basile, Comerio, İtalya	# 47600
Tel cihazı Hanging	Ismarlama
Omurilik Hazırlık
Ameliyat Masası Çalışma lambası Koruyucu eldivenler
Tarafına açılı "Iris" Makas,	Güzel Bilim Araçlar, Heidelberg, Almanya	14063-09
Cohan-Vannas Bahar Makas, düz	Güzel Bilim Araçlar, Heidelberg, Almanya	15000-10
Mikro forseps	Hammacher, Solingen, Almanya	HWC 111-10
Neşter "präzisa plus"	Dahlhausen, Köln, Almanya	11.000.00.510, ŞEKİL 10