Sıçan Embriyonik Nöral Hücre İzolasyonu ve Kültür: Bir Hızlı Protokol

Özet

Biz kemirgen embriyolardan hipokampal ve kortikal nöronlar yalıtmak ve kültürüne hızlı bir metodoloji tanıtılmıştır. Bu protokol bize neredeyse saf nöronal kültürlerin gerekli olduğu deneyler yapmasına imkan tanıyor.

Özet

Biz E15-17 rat embriyoları hipokampal veya kortikal nöronların ayırmak ve kültür için hızlı bir yöntem tarif edilir. Prosedürü fare ve insan birincil nöronlar ve sinir progenitörlerin izolasyonu başarıyla uygulanabilir. Ayrışmış nöronlar ila birkaç hafta serum içermeyen aracı madde içinde muhafaza edilir. Bu kültürler nucleofection, immünsitokimya, nükleik asit hazırlanması yanı sıra elektrofizyoloji için de kullanılabilir. Büyük nöronal kültürler da iyi bir verim lentiviral transdüksiyonu ile oranı ve daha az etkin bir şekilde, kalsiyum fosfat ya da bu gibi lipid lipofektamin bazlı yöntem ile transfekte edilebilir.

Protokol

1. Poli-D-Lizin (PDL): Hazırlanması

1. 1 mg / ml 'lik bir stok solüsyonu elde etmek için PDL 5 mg steril GKD ₂ O 5 ml ilave edilir.
2. Birkaç kez pipetleme tarafından stok solüsyonu karıştırın.
3. Hemen kullanın veya 2-8 Poly-D-Lizin Çözüm saklamak ° C

2. Poly-D-Lizin (PDL): Kaplama Plastik Hücre Kültürü Yemekleri

1. Steril GKD ₂ O ile 10 ug / ml 'lik nihai konsantrasyona PDL stok solüsyonu ile seyreltilir.
2. Kültür yüzey alanı (60 mm çanak için 3 ml) kapsayacak şekilde 60 mm çanak pipetleyin yeterli bir çözüm.
3. Kültür yüzey hatta kaplama sağlamak için hafifçe sallayın.
4. Gece boyunca oda sıcaklığında (RT) az kaplı inkübe edin.
5. Ertesi gün, genellikle diseksiyon gün, aspirasyon tarafından Poly-D-Lizin Çözüm kaldırmak ve steril GKD ₂ O 3 ml kısaca yıkayın Bu adımı yineleyin. İkinci yıkamadan sonra, aspirasyon tamamen su çıkarmak.
6. Plakalar üç hafta için 4 ° C'de saklanabilir.

3. Poly-D-Lizin (PDL) ve Laminin: Cam hazırlanması ve Kaplama İki odacıklı Slaytlar

1. Sırasıyla, 10 ve 5 ug / ml, nihai konsantrasyon Steril GKD ₂ O karışımı PDL (1 mg / ml) ve laminin (1 mg / ml) stok çözeltileri.
2. Cam bir kuyu iki odacıklı slayt kültür yüzey alanı (2 hatta cam çift odacıklı slayt her iyi için 1 ml) kapsayacak şekilde pipetleyin yeterli bir çözüm.
3. Kültür yüzey hatta kaplama sağlamak için hafifçe sallayın.
4. Gece boyunca oda sıcaklığında kaplı inkübe edin.
5. Ertesi gün, aspirasyon yoluyla Poly-D-Lizin-Laminin kaplama çözümü kaldırmak ve steril GKD ₂ O. 1 ml ile iki kez kısaca yıkayın İkinci yıkamadan sonra, aspirasyon tamamen su çıkarmak.
6. Odacık slaytlarınızı üç hafta için 4 ° C'de saklanabilir.

Not: Herhangi bir cam haznesi slayt izlemeye kaplanabilirg bu protokol. Her bir slayt kontrolü test Deneysel ortamda (örneğin tedavi edilmezse karşı tedavi, untransfected karşı transfekte) sağlar çünkü çoğu zaman çift odacıklı slaytlar kullanın.

4. Nöronal Diseksiyon ve Kültür

1. 37 ° C su banyosunda aşağıdaki reaktifler Isınma:
   • Orijinal 100 ml şişe üzerine TrypLE Express.
   • Neurobasal/B27 tam orta (tablo görüyorum). Isıttı hacmi (on 60 mm kaplamalı yemekler örneğin 30 ml) kaplamalı olarak yemeklerinin sayısına bağlıdır.
2. Dört adet 60 mm'lik kültür kaplarına ve 15 ml BD Falcon yüksek netlik polipropilen konik tüpe 13 ml soğuk Hazırda E çözeltisinden 3 ml ekleyin.
3. Üç 100 mm'lik kültür kaplarına her birine soğuk diseksiyon orta (tablo II, Dr Olimpia Meucci, kişisel iletişim bakın) 25-30 ml ekleyin. Orta büyük bir hacmi içeren bu plakaları, hemen sonra embriyo yıkamak için kullanılacaktıramniyotik kese (adımları 4.7 ve 4.8) kaldırılması.
4. Laboratuvar Hayvanları Humane Bakımı ve Kullanımı Halk Sağlığı Hizmetleri Politikası'na uygun olarak ve kurumsal olarak onaylanmış hayvan bakım altında CO ₂ tarafından bir E17 zamanlı gebe sıçan Euthanize ve protokolünü kullanır.
5. % 70 EtOH ile alt karın püskürtün ve rahim ve embriyoların açığa bir makas ile deri ve kas yoluyla mediale kesti.
6. Bütün fetuslarda çıkarın ve soğuk diseksiyon orta (25-30 ml, adım 4.3 'e bakınız) aşırı içeren steril 100 mm tabağına yerleştirin.
7. Amniyotik kese makas küçük bir çifti kullanılarak embriyo kesin ve soğuk diseksiyon orta içeren ikinci 100 mm tabağına yerleştirin.
8. 5-10 saniye hafifçe eğerek 100 mm çanak ile oda sıcaklığında embriyoların yıkayın. Daha sonra, diseksiyon orta içeren üçüncü 100 mm çanak Durulanmış embryo transfer. Aşırı orta İki yıkama genellikle kan tüm izlerini silmek için yeterlidir. Bununla birlikte, eğer imalatıaçıklı, soğuk diseksiyon orta 25-30 ml içeren taze bir 100 mm çanak ile bir kez daha yıkayın.
9. Stereomikroskopta ve kavisli bir forseps kullanarak, deri ve kafatası çekerek her rat embriyo beyni ayıklayın. Soğuk Hazırda E. ile 60 mm yemekleri (genellikle, tabağı başına en fazla 5 beyinleri ile) buz üzerinde bu plakalar tutun birinde bütün beyin yerleştirin.
10. Seferinde bir çanak alın ve bir mikroskop altında, hemisfer ayırmak ve orta beyin ve meninks çıkarmadan serebral korteks izole.
11. İsteğe Bağlı: orta hat boyunca kesme beyinleri, hipokampi ayıklamak ve hipokampal nöronlar yalıtmak için aşağıdaki prosedürü izleyin.
12. Tüm diseksiyonlar tamamlanıncaya kadar buz üzerinde serebral korteks bırakın soğuk Hazırda E. 13 ml içeren 15 ml berrak konik tüp tüm diseke korteksleri toplayın. Kendi küçük boyutları nedeniyle, disseke hipokampi yerine 15 ml tüp bir 1.5 ml Eppendorf tüp toplanabilir. Ya da bu adım korteksleri az, eğer istenirsehipokampi 1 ml'lik bir şişe içinde cryotube yerleştirilebilir hazırda E + 2 +% B27 gentamisin (50 ug / ml) 2-4 korteksleri veya şişe başına 2-4 hipokampi oranında + Fungizone (250 ng / ml). Beyin dokusu kadar bir hafta (daha sonraki dönemlerde henüz test edilen değil) için karanlıkta 4 ° C'de saklanabilir. Gerektiğinde, Hazırda E içeren 15 ml tüp için beyin dokusu aktarmak ve daha sonra nöronlar yalıtmak için aşağıdaki protokolü takip ince pens kullanın.
13. Bir doku kültürü kaput tüp aktarın. Korteksleri tüpün dibe sonra dikkatlice süpernatant kaldırmak için izin verin.
14. , 15 ml konik tüp taze Hazırda E 13 ml ekleyin korteksleri tüpün dibe çöktüğünden izin ve dikkatli supernatant çıkarın. Bu adım 2 kez daha tekrarlayın ve son yıkamadan sonra, özenle tüm medya çıkarın.
15. Sıcak Tr; enzimatik 1-2 ml (hipokampi izolasyonu için daha az kullanın korteksleri sayısına bağlı olarak) ekleyerek serebral korteks sindirmekypLE Express. Parafilm ile tüp kap kapatır ve 10 dakika boyunca 37 ° C'de su banyosu içinde tüp yüzer.
16. Kap açılmadan önce% 70 etanol ile tüp püskürtmek ve korteksleri borusunun alt kısmında yerleşir ve süpernatan kaldırmak için izin hazırda E. 10 ml ilave edilir. Bu adım TrypLE Express yıkanmaya üç kez tekrarlayın. Son adım olarak, dikkatle tüm medya çıkarın.
17. Yavaşça (4-5 kez) bir yangın-parlatılmış cam Pasteur (çapı yaklaşık 1 mm) kullanılarak Neurobasal/B27 tam medyum 2 ml korteksleri öğütmek. Kabarcıkları önlemek için dikkatli olun.
18. Çapında küçük bir steril cam Pasteur pipeti (yani çapı 1/2-3/4 mm pipet) ile başka bir 4-5 kez tekrarlayın. Bir Pasteur pipeti bu küçük kullanmayın veya hücreleri yok edecek.
19. Yerleşmek için (eğer varsa, genellikle çok az) doku kalan parçaları izin verin.
20. Doku parçaları yerleşmiş bırakarak, yeni bir 15-ml tüpüne üst tek bir hücre süspansiyonu transfer edin. KürkNeurobasal/B27 tam orta 10-12 ml hücre süspansiyonu kadar sulandırmak incele.
21. İyice karıştırın ve bir 1.5 ml Eppendorf tüp 50x Sayma Çözüm (Tablo III) 490 ul hücre süspansiyonu 10 ul ekleyerek sayım için hücre seyreltik.
22. 5.0 x 10 ⁴ / cm ² arasında derişimde PDL-kaplı levhalar üzerine plakası hücreleri. Nucleofection yapılmasını mümkün olmaması durumunda, daha yüksek bir konsantrasyonu (8-10 x 10 ⁴ / cm ²⁾ de hücrelerin kaplama önermektedir.
23. Yaklaşık 13 x 10 ⁶ nöronların her E17 fetus türetilen Normal olarak, biz, Deneme başına 9-10 fetus incelemek. Daha fazla embriyoların gerekirse, tüm prosedürü iki saatten fazla sürecek olmadığından emin olun.
24. Eğer istenirse, 24 saat sonra izole, sitosin-β-D-arabinofuranoside (AraC) 10 uM glial proliferasyonu önlemek amacıyla, her bir çanak eklenebilir. Neurobasal/B27 orta glial proliferasyonu inhibe Bununla birlikte, bu adım gerekli değildirGibi üreticinin önerilerine (Invitrogen / Gibco).
25. Kesin zaman istenen türev aşaması bağlı olmasına rağmen, nöronlar, in vitro olarak 4-5 gün sonra deneyler için kullanılabilir. Biz hayatta önemli bir azalma (Şekil 1) olmadan 4 hafta için kültürlü nöronlar var.
26. Genişletilmiş kültür için, taze hazırlanmış Neurobasal/B27 tam orta her hafta kültür ortamı değiştirin.

5.. Temsilcisi Sonuçlar

Cam haznesi slaytlar nöronlar üzerinde kültive immünsitokimya tabi tutulabilir. Şekil 1 kültüründe beş gün sonra sabit ve nöronal işlemleri gösteren anti-MAP-2 antikoru ile immunolabeled bir kortikal nöron tipik bir görüntüsü gösterilmektedir.

Şekil 2 kültüründe 3 hafta sonra bir sıçan hipokampal nöron bir temsilcisi görüntüsünü gösterir. Tamamen farklılaşmış hücre nöronal morfoloji MAP-2 tarafından vurgulanır immunolabeling (MAP-2 nöronal belirteç, fare monoklonal antikor klonunun AP-20, Gene Tex, Irvine, CA), daha önce tarif edildiği gibi ¹ standart bir prosedür izlenerek,. Görüntüleri EXi aqua kamera (Qimaging), motorlu Z ekseni ve SlideBook5 kazanım / Dekonvolüsyonun yazılımı (Akıllı Görüntüleme Yenilikler, Inc, Denver, CO) ile donatılmış Nikon Eclipse E400 dik floresans mikroskobu ile görüntülenmiştir. Her bir resmin üç boyutlu görüntüleri bir dizi birini iki boyutlu resme deconvoluted ve çözünürlüğü artırmak için yakın maksimal yoğunluğu sinyali kesme ayarlayarak çözüldü.

Şekil 3 nöronal kültürlerin saflığı gösterir. Protein lizatları DIV7 sıçan nöronal kültürlerin (ctx) gelen ve insan glioblastoma (GBM) bir durumda elde edilmiştir. Beklenildiği gibi, nöronal lizat nöronal protein MAP-2 ve astrositik işaretleyici GFAP negatif için güçlü bir şekilde pozitif olduğu; GBM proteini lizat negatif f ikenya GFAP MAP-2 ve pozitif.

Bizim protokol biz orta diseksiyon ve durulama olarak yıllarca Hazırda E kullanarak rağmen, son zamanlarda biz daha fazla kullanmak için beyin dokuları korumak için ek bir ve çok pratik kullanım incelemiş bulunuyoruz. Şekil 4 in vitro 5 (DIV5) bir gün göstermektedir embriyosu kendi orijinal Diseksiyon sonra hazırda E + B27 in bir hafta süreyle 4 ° C de muhafaza korteksleri izole sıçan kortikal nöronların kültürü. Nöronlar daha önce tarif edildiği gibi PDL ve laminin ile kaplanmış bir cam iki bölmeli kayar üzerine ekildi. Elde edilen görüntü SlideBook5 toplama / yukarıda tarif edildiği gibi Dekonvolüsyonun yazılımı (Şekil 2) kullanılarak deconvoluted edildi.

Şekil 1. PmaxGFP (Amaxa, Lonza, Walkersville, MD) ile nucleofected ve MAP ile immunolabeled bir kortikal nöron Temsilcisi görüntü-2 Antikor, kırmızı. Orijinal büyütme 100x.

Şekil 2. Kültür 3 hafta sonra hipokampal nöronların, kırmızı, MAP-2 immün gösteren Temsilcisi görüntü. DAPI boyama, mavi, hücre çekirdeği gösterir. Orijinal büyütme 40x.

Nöronal hücre kültürlerinin saflığı gösteren Şekil 3. Western blot. Sıçan ve insan nöronal protein GBM lizatlarının 30 ug elektroforez ile ayrılmış ve standart prosedürler takip ¹ Western blot analizi tabi tutuldu. Anti-MAP-2 Hücre Sinyalleşme (Danvers, MA) ile bir tavşan poliklonal olarak, anti-GFAP antikoru Chemicon (Millipore, Billerica, MA) ile bir fare monoklonal, ve fare monoklonal antikoru, anti-Grb2 BD Transduction Laboratories (yapıldı Sparks, MD). Grb2 bir yükleme kontrol olarak kullanılmıştır.

Şekil 4. Temsilcisi in vitro 5 gün resimleri (DIV5) sol korteks elde edilen sıçan kortikal nöronların Hazırda E onların diseksiyonu sonrası bir hafta boyunca, 4 ° C + B27. Bir cam çift odacıklı slayt kültüre nöronlar A) Faz kontrast. Orijinal büyütme 20X. B) İmmünofloresan yeşil, nöronal süreçleri MAP-2 ekspresyonu gösteren; kültür astrositik işaretleyici GFAP negatif idi. DAPI boyama, mavi, hücre çekirdeği gösterir. Orijinal büyütme 40x.

Tartışmalar

Rat hipokampal ve kortikal nöronların diseksiyon ve kültür yöntemi burada açıklanan kimyasal olarak tanımlanmış bir orta (Şekil 3) yetiştirilen yaklaşık saf nöronal kültürlerin kullanıldığı deneyler sağlar. Serumsuz medya kültürü neredeyse saf nöronlar için protokolleri daha önce ^2,3,4 tanımlanmış olmasına karşın, bizim yöntem yapılan önemli değişiklikler vardır. Geleneksel protokolleri farklı (yani Banker ve ark.) ^5, biz TrypLE Express, dah...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif	Konsantrasyon
Neurobasal	% 98
B27	% 2
Glutamax	0.5 mM

Reaktif	Konsantrasyon
Glikoz	16 mM
Sakaroz	22 mM
HEPES	10 mM
NaCl	160 mM
KCl	5 mM
Na 2 HPO 4	1 mM
KH 2 PO 2	0,22 mM
Gentamisin	50 mcg / ml
Fungizone	250 ng / ml
pH	7.4
Osmolarite	320-330 mOsm

Reaktif	Hacim (ul)
Neurobasal/B27 tam medyum	240
Tripan Mavi% 0.4 Leke	250
Toplam	490

Reaktif	Şirket	Cat. numara
Hazırda D	Brainbits	767171
Neurobasal	Gibco, Invitrogen	21103-049
B27	Gibco, Invitrogen	17504-044
Fungizone	Gibco, Invitrogen	15290-018
Gentamisin sülfat	Sigma Aldrich	G1264
Glutamax 200 mM	Gibco, Invitrogen	35050
TrypLE Express w / o fenol kırmızısı	Gibco, Invitrogen	12604
Sitosin-β-D-arabinofuranoside hidroklorür	Sigma Aldrich	C6645
Poli-D-Lizin	Sigma Aldrich	P6407
Laminin 1 mg / ml	Millipore	CC095
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
Tripan Mavi% 0.4 Leke	Gibco, Invitrogen	15250

Ekipman	Şirket	Cat. numara
Stereo Mikroskop	Olympus	SZ61
Büyük Forseps	FST	11022-14
İnce uçlu bir pens	Moria	MC40B
Mikro ince uçlu pens	Moria	MC31
Keskin makaslar	Roboz	RS-6820
Mikro Kesme makas	FST	91460-11
Mikro Eğri makas Dissecting	FST	14067-11
Cam 2 odacıklı slaytlar	Lab-Tek	154461
60 mm yemekleri	BD Falcon	353002
100 mm yemekleri	Corning	430167
15 ml'lik tüplere	BD Falcon	352099
1.5 ml cryo tüp flakon	Nunc	375353