Revealing Kompleksi Beyin Topografya Wholemount İmmünohistokimya

Özet

Nöral devreler topografik spesifik moleküler profilleri ile fonksiyonel bölme halinde düzenlenmiştir. Burada, çok yönlü bir wholemount immünohistokimyasal yaklaşımını kullanarak global beyin topoğrafya ortaya çıkarılması için pratik ve teknik adımları sağlar. Bu iyi anlaşılmış cytoarchitecture ve beyincik devre kullanarak yöntemin yardımcı göstermektedir.

Özet

Serebellumun tekrarlanan ve iyi anlaşılmış hücresel mimarisi beyin topoğrafya keşfetmek için ideal bir model sistem haline getirmektedir. Nispeten homojen cytoarchitecture altında yatan gen ve protein ifade parasagital etki karmaşık bir dizidir. Serebellumun moleküler kompartımanlara afferent liflerin anatomik ve fonksiyonel organizasyon tarafından yansıtılır. Tam serebellar organizasyonun karmaşıklığını anlamak için, daha önce fare serebellumda desenlendirme kusurları yüksek verimlilik analizi için wholemount boyama yaklaşım rafine. Bu protokol ayrıntılı reaktiflerin, alet ve başarıyla wholemount immun kullanarak erişkin fare beyincik protein ekspresyonu ortaya çıkarmak için yararlı olan pratik adımları açıklar. Adımları burada beyin ince topografisi ile ortaya edilebilir bir örnek olarak zebrinII / aldolaseC ifadesi kullanılarak bu yöntemin yardımcı sergilemektediryerli üç boyutlu yapı. Ayrıca açıklanan moleküler topografya karşılaştırmalı çalışmalar için afferent projeksiyonları ve büyük cerebella protein ifade görselleştirme izin protokolü için uyarlamaları vardır. Bu uygulamaları göstermek için, sıçan serebellumun afferent boyama veri dahildir.

Protokol

1. Hayvan Perfüzyon ve Beyincik Diseksiyon

1. Protein bağlı olarak, başarılı bir boyama ^1,2 perfüzyon için gerekli olabilir. Transcardiac perfüzyon anesteziklerin doğru kullanımı gerektiren bir invaziv olmayan, hayatta kalma işlemdir. Doğru eğitim, kurumsal onayı ve IACUC onayı tüm prosedürü başlamadan önce gereklidir. Her zaman deneysel gereksinimleri belirlemek ve doğru eğitim edinme konusunda yardım almak için kurumun veteriner danışmak iyi bir fikirdir. İşlem öncesi, hayvan derin anestezi ve bu tür ayak veya kuyruk tutam gibi uyaranları olmamalıdır. Kullanımı makas karın cilt ve kas duvarındaki bir kesim yapmak ve daha sonra her iki tarafta sternum sadece komşu keserek göğüs kafesini açmaya devam etmektedir. Buna ek olarak, deneyci diyafram çevreleyen fasya kesim tarafından daha büyük bir iç çalışma alanı oluşturabilirsiniz. Karın ve göğüs duvarı Superio kaldırarakrly, kalp şimdi maruz kalacak. Dışarı çıkacak ve hemen sol ventrikül içine perfüzyon iğne eklemek için kan sağlamak için sağ atrium küçük bir kesim olun. Temel bir hidrostatik pompa (detaylar için bakınız Tablo 1) perfüzyon çözümleri sunmak için tercih edilir. İlk olarak, 0.1M fosfat ile kan dışarı akmasına sıvı berrak bitene kadar (PBS, bkz. Tablo 3) tamponlu tuz. Sonra, hidrostatik pompa kapatmak hızlı PBS ile sulandırılmış% 4 paraformaldehit bir konteyner (PFA, bkz. Tablo 3) çözüm teslimat tüp geçiş ve sonra fiksatif sunmak için geri pompa açın. Bir pompanın kullanılması gerekli değildir: uygulama ile, iki şırınga PBS ile doldurulur ve% 4 PFA yavaş çözümler sağlamak için kullanılabilir.
2. Bu dikkatle dokuya herhangi bir lezyon tanıtımı olmadan kafatası beyin dışarı incelemek için çok önemlidir. Diseksiyon sırasında beyne bile küçük yaralanmalar yavaş yavaş görünür yarıklar içine genişletmek olacaktuzağı antikorlar ve doku (Şekil 2, örneğin kırmızı yıldız) ile işleme sırasında artefakt boyama neden olur. Serebellar disseksiyonlar için, başın orta aşağı cilt kesilmiş ve daha sonra yavaşça kafatası açığa kapakları dışında tease tipiktir. Dorsal orta hat boyunca posterior anterior gelen kafatası kesin, hem de yanal kafatasının her iki yanında. Bu beyincik nicklemek riskini taşır gibi bregma ötesinde kesmeyin. Forseps kullanarak hafifçe meninksler bağlı beyin dokusunun koparmak için dikkatli olmak beynin uzak kafatasının ön kısmını kaldırın. Beynin ventral tarafta kranial sinirler Sever.
3. Beynin geri kalan kısmından ayrılması serebellum iki nedenle önemlidir. İlk olarak, yerinde colliculi tarafından görünümünden gizlidir ön lobules ifade desen keşfine izin verir. Ikinci bir küçük, izole bölgeye ayrılması doku m olanak sağlamasıdırbazı proteinlerin boyama kolaylaştırabilir cevheri tam tespit,. Bu son adım, diseksiyon boyunca bakım forseps uçları ile serebellum dokunmayın dikkat edilmelidir. Üst ve alt colliculi ortasına forseps bir çift ipuçları yerleştirin. Forseps ikinci bir set yavaş beyincik gelen inferior colliculi uzak alay ile. Onun ön tarafı aşağı bakacak ve beyin sapı yukarı bakacak şekilde Sonra, beyincik yatıyordu. Beyin sapı ve lobülleri IX / serebellumun X arasındaki dördüncü ventriküle forseps yerleştirin. Her iki tarafta forseps sıkıştırarak peduncles kesilmiş ve daha sonra yavaşça beyin sapı uzağa serebellum kaldırın. Beyincik izole edildikten sonra, 24-48 saat arasında en az 4 ° C sıcaklıkta% 4 PFA batırılarak post it-düzeltin. Beyincik uzun bir süre için% 4 PFA saklanabilir. Meninksler önce veya ifade kalıpları daha iyi görüş için boyama sonrası ya çıkarılmalıdır.Deneyci beyincik sürecinde nicked olacağını güçlü bir olasılık vardır boyama önce meninksler kaldırmak için seçerse. Onlar zayıf arka plan boyama kazanmak ve post-processing zayıf olduktan sonra bulmak daha kolay hale gelir, çünkü boyama işlemi sonunda meninksler uzakta Peeling çok daha kolaydır.

2. Wholemount Boyama için Doku İşleme

Wholemount boyama yaklaşımı artık doku kesitlerinde, immünohistokimyasal daha alır, çünkü (Tablo 2) sağlanan örnek takvimde gösterildiği gibi deneyler her biri için zaman çizelgesi planlamak için yararlıdır. Başlamadan önce, akılda tutulması gereken birkaç temel unsur vardır. 1) doku içeren mikrotüplerdeki donma / çözülme sürecinde hariç, her zaman bir nutator üzerinde rotasyona tabi tutulmalıdır. 2) Birkaç çözümleri (çözüm tarifleri için Tablo 3) Her bir deney için taze yapılmalıdır. 3)Protokol boyunca, çözümler değiştirirken, yavaşça beyincik dokunmamak için değil, forseps ile beyincik çıkarmadan daha geçirdi çözüm dökün. Daha sonra, başka bir konteynır içerisinde yeni çözüm karıştırıldıktan sonra yavaşça tüpüne taze çözeltisi eklemek için bir pipetle kullanımı.

2.1 1. Gün:

1. 6-8 saat nutator hafifçe sallanan için oda sıcaklığında Dent düzeltme ³ serebellum sabitlemek. Metanol sizin antijen için yıkıcı ise, antijen alımı yöntemi ile 2.3a ile 2.1a adımları yerine düşünün. Antijen alımı için kullanılan ısı ve tamponlar antikor penetrasyon için doku hazırlamanıza yardımcı olacaktır.
2. 4 gece boyunca Dent Bleach ³ Bleach serebellum ° C

2.2 2. Gün:

1. 30 dk için oda sıcaklığında% 100 MeOH iki turda serebellum kurutmak.
2. Sonra, konu, çözümlerin penetrasyonu arttırmak içindonma / çözülme döngüsü bir dizi doku. 30 dakika boyunca kuru buz ve dondurma ile bir kapta tüp dikkatlice yerleştirin. Sonra, tüpü çıkarın ve 15 dakika boyunca yedek kulübesinde oda sıcaklığında bekletin. Donma / çözülme adım dört kez (en az) yapılmalıdır.
3. Dokusunda çözülme son sonra, bir gecede -80 ° C derin dondurucuya yerleştirilir.
4. Doku -80 azından uzun süre saklanabilir ° C hemen önce veya donma / çözülme adım sonra ya. Aksi takdirde, protokolü devam ettirilmelidir.

2.3 3. Gün:

1. 50% in yıkayarak serebellum rehidre MeOH/50% PBS,% 15 MeOH/85% PBS ve 60-90 dakika oda sıcaklığında her biri için 100% PBS.
2. Sonraki, yetişkin fare cerebella, konu 2-3 dakika PBS içinde 10μg/ml Proteinaz K ile enzimatik sindirimi için doku için. Hayır sindirim adım genç hayvanların cerebella (fare P5 veya genç) için gereklidir. Uzun digestion daha büyük beyinler için önerilmektedir. Örneğin, sindirim primat beyinleri ⁴ için 5-6 dakika kadar yüksek olabilir.
3. Sindiriminden sonra, hemen Proteinaz K kaldırmak için oda sıcaklığında 10 dakika için, her üç defa PBS içinde serebellum yıkayıp
4. 4 gece boyunca (bkz. Tablo 3) PMT içinde doku Blok ° C Ucuzdur, çünkü Süt tozu genellikle protein çalışmaları için engelleyici bir ajan seçiminde ilk seçenektir, etkin bir arka plan boyama düşürür ve genellikle antikor bağlayıcı veya antijen erişim engel değildir. Deneyi eklendi maliyet farkında olmalıdır ve birinci çapraz-reaktif imünoglobülinler ve parazit oranı optimal bir sinyal üretmek için yeteneği serum kalitesini test gerekse de hayvan serumlar da kullanılabilir.

2.4 Gün 4-5:

1. 4 ° C (larg azından 48 saat boyunca% 5 DMSO ile desteklenmiş PMT içinde seyreltilmiş Primer antikor olarak doku inkübeer cerebella) artış inkübasyon sürelerinde gerektirecektir.

2.5 6. Gün:

1. Ilişkisiz Primer antikor kaldırmak için 4 ° C'de 2-3 saat PMT in her biri için serebellum 2-3 kez yıka.
2. Sonra, 4 azından% 5 DMSO ile PMT ihtiva eden bir çözelti içinde sekonder antikor olarak doku inkübe ° C de bir gece (daha büyük cerebella gerektirebilir artış inkübasyon kez).

2.6 7. Gün:

1. 4 ° C'de 2-3 saat PMT in her biri için serebellum 2-3 kez yıka
2. Doku 1-2 saat boyunca PBT (bakınız Tablo 3) ile bir son yıkama verir. Bu adım, fazla süt kaldırır ve boyama netliğini artırır.
3. Optimum leke yoğunluğu elde edilinceye kadar son olarak, DAB (3,3 '-diaminobenzidin) çözelti içinde doku inkübe edilir. Kahverengi reaksiyon ürünü ~ 10 dakika içinde açıkça görülür olmalıdır. Hafif yağış için kromojen neden olarak karanlıkta DAB kullanmak en iyisidirarka plan boyama artırabilir te.

2.7

Optimum leke yoğunluğu ulaşıldığında,% 0.04 sodyum azid ile PBS içinde serebellum yerleştirerek reaksiyonu durdurmak. Doku bu çözüm, uzun vadeli saklanabilir. Sodyum azid bakteri büyümesini güçlü bir inhibitörü olan, ancak, aynı zamanda yaban turpu peroksidaz inhibe eden bu adım kadar kaçınılmalıdır.

2.8 Opsiyonel amplifikasyon prosedürü:

Normal protokol izleyin ama bu adımları Yukarıdaki adımları 2.5b-2.7 yerine yapılmalıdır.

1. 4 gece boyunca doku inkübe °% 5 DMSO ile PBST biotin-konjuge sekonder antikorlar (bkz. Tablo 3) C.
2. 2-3 saat için oda sıcaklığında PBST 3-4 değişiklikler her biri için doku çalkalayın.
3. 4 gece beyincik inkübe ° C PBST ABC karmaşık çözüm.
4. 2-3 saat için her bir doku durulamaPBS 3-4 değişiklikler oda sıcaklığında.
5. Yukarıda açıklandığı gibi, taze hazırlanmış DAB çözelti içinde dokusu, inkübe.
6. Boyama uygun olduğunda,% 0.04 sodyum azid ile PBS içinde serebellum yıkanarak reaksiyonu durdurmak.

3. Görüntüleme Vitray Doku

1. Wholemount görüntüleri örneğin kullanılarak yakalanan olabilir, bir Leica DFC3000 FX kamera Leica Application Suite FX yazılımı çalıştıran bir Leica MZ16 FA stereomikroskop üzerine monte edilmiş. Eğer istenirse, Dekonvolüsyonun mikroskopi her görüntünün kesin odak yalnızca tek bir lobülü sahip olacak şekilde farklı düzlemlerde çoklu fokal ardışık görüntü elde etmek için kullanılabilir. Sonra görüntüleri tek bir yığın ve bozulma kaldırmak için oluşturulan yazılım içine sıkıştırılmış olabilir. Son kompozit görüntü net odak Görünür tüm desenlendirme ile serebellar yüzey ekspresyonu örneklerle gösterecek.
2. PBS dalmış iken Wholemount boyanan doku (veya verecek başka bir ortama yansıması olmalıdırOptimal refraktif indeks). Kolay görüntüleme için wholemount konumlandırmak için, bir plastik Petri kabındaki% 1 agar jel olun. Jel içine küçük delikler kesilir. Delikler beyincik istenen yönelim içine sıkışmış izin verir.
3. Ham veri Adobe Photoshop CS4 ithal ve kontrast ve parlaklık seviyeleri için ayarlanır.

Hayvanlar

Tüm hayvan çalışmaları Albert Einstein Tıp Koleji kurumsal yönergelere göre onaylanmış bir IACUC hayvan protokol çerçevesinde gerçekleştirilmiştir. Erkek ve kadın outbred İsviçre Webster (Taconic, Albany, NY) farelerde bizim koloni bakımı ve tüm çalışmaları için kullanıldı. Ötenazi yetişkin sıçan nazik Dr Bryen Ürdün (Albert Einstein Tıp Koleji) tarafından sağlandı. Tüm hayvanlarda, en az bir aylık edildi.

4. Temsilcisi Sonuçlar

Beyincik dört enine bölgeye moleküler ifade tarafından bölümlere edilir:ön bölgesi (AZ: ~ lobülleri IV), merkez bölge (CZ: ~ lobüller VI-VII), posterior bölge (PZ: ~ lobülleri VIII-dorsal IX) ve nodüler bölge (NZ: ~ lobülleri IX ventral ve X ) 5. Her bir bölge parasagital çizgili ^1,2,5,6 (Şekil 1) eşsiz bir dizisini içerir. Purkinje hücrelerinde ifadesi ZebrinII AZ ve PZ (Şekil 2) ve CZ ve NZ (Şekil 2) üniform ifade çizgili ortaya koymaktadır. Purkinje hücrelerinin parasagital organizasyonu afferent liflerin terminal saha topografyası tarafından yansıtılır. Kokain ve amfetamin-düzenlenmiş transkript (CART) peptid tırmanma lifleri (Şekil 3a) alt kümeleri ile ifade edilen bir serebellar korteks ⁷ (Şekil 3b) moleküler tabakasında Purkinje hücre dendritlerin şeritler proje. Gibi amplifikasyon ⁷ gibi uygun değişiklikleri ile, wholemount protokolü nee olmadan olivocerebellar desen görselleştirme sağlarboyama doku kesitlerinde (Şekil 3b) bir zahmetli, zaman alıcı rekonstrüksiyon için d.

Şekil 1. A. ZebrinII / aldolaseC ifade beyincik enine bölümlerinde sagital bantları ortaya koymaktadır. Ölçek çubuğu = 500 mikron. B. ZebrinII / aldolaseC Purkinje hücre somata ve dendritler münhasıran ifade edilir. Ölçek çubuğu = 150μm (gl = granüler tabaka; pcl = Purkinje hücre tabakası; ml = moleküler tabaka).

Şekil 2. ZebrinII / aldolaseC anterior (AZ), santral (CZ) ve beyincik posterior (PZ) bölgelerinin görüntüleri Purkinje hücre çizgiler gösteren boyanan bir wholemount beyincik. Burada da serebellum nicklemek olumsuz sonucu bir örneğini gösterir. Sonuçta elde edilen artefakt boyama belirtilirkırmızı yıldız ile. Ölçek çubuğu = 1 mm (LS = lobulus simpleks; PML = paramedian lobül; COP = copula'sı pyramidis).

Şekil 3. A. CART moleküler tabaka fiber terminalleri tırmanma olarak ifade edilir. Ölçek çubuğu = 100 mikron. (Ml = moleküler tabaka; pcl = Purkinje hücre tabakası; gl = granüler tabaka) NZ CART ifade B. Wholemount immünhistokimya. Ölçek bar = 2 mm (COP = copula'sı pyramidis; PML = paramedian lobül; PFL = paraflokkulusun; FL = Flokulus).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Biz gelişmekte olan ve yetişkin beyninde açığa protein ekspresyonu için çok yönlü bir immunohistokimyasal yaklaşımı kullanarak başarılı wholemount boyanması için gerekli teknik detayları tarif var. Bu yaklaşım kullanılarak, karmaşık moleküler salgılanma modellerini analiz edilebilir ve beyin topografisi zahmetli ve zaman alıcı bir doku kesit prosedürler için gerek olmaksızın takdir.

Bu protokol, yetişkin ^1,2,8,9 ve erken doğum sonrası fare serebel...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Malzemeler	Protokolü Fonksiyon
Perfüzyon pompası (Fisher Scientific/13-876-2)	Tutarlı ve yavaş perfüzyon sağlar.
Keskin uçlu Makas (FST/14081-08)	Perfüzyon ve diseksiyon Genel kullanım.
Künt uçlu Forseps (FST/91100-12)	Perfüzyon iğne yerleştirilmesi için kalp stabilize etmek.
Forseps (Dumont AA/11210-10 tarafından FST)	Kafatası beyin diseksiyonu sırasında kullanım için ve beynin geri kalanından serebellum ayırmak için. Onlar diseksiyonu sırasında beyincik hasarı minimuma indirmeye yardımcı olur biraz yuvarlak ucu var, çünkü bu gereklidir.
Nutator (Fisher Scientific)	Kuluçka dönemlerinde hareket doku tutmak için kullanılır.
1.5 ml tüp (Sarstedt / Vida Kapağı Mikro Tüp)	Onun tüm adımlarıtochemistry protokolü bu mikrotüplerdeki yer almaktadır. Yuvarlak alt beyincik hareketli kalmasını sağlar.
Delikli kaşık (FST/10370-17)	Yavaşça geçirdi çözüm şişeden ise mikrotüplerdeki wholemounts tutmak için kullanılır.
Leica MZ16 FA mikroskop	Wholemount boyama incelemek için kullanılır.
Leica DFC3000 FX kamera	Wholemount görüntü yakalamak için kullanılır.

Tipik bir wholemount deney için örnek takvim
1. Gün	Dent düzeltme, oda sıcaklığında, 8 saat				Dent ağartıcı, 4 ° C, bir gece boyunca
2. Gün	% 100 MeOH, oda sıcaklığında, 2x, 30 dak, her			% 100 MeOH, Donma / çözülme, 4x, 30 min/15 dk			n = "2"> 100% MeOH, -80 ° C'de, bir gece boyunca
3. Gün	% 50 MeOH/50% PBS, oda sıcaklığında, 60-90 dak	% 15 MeOH /% 85 PBS, oda sıcaklığında, 60-90 dak		% 100 PBS, oda sıcaklığında, 60-90 dak		PBS içinde 10μg/mL Proteinaz K, oda sıcaklığında, 2-3 dakika	3x 100% PBS, oda sıcaklığında, 10 dak, her	PMT gece boyunca, 4 ° C,
Gün 4-5	PMT + 1 ° antikoru +% 5 DMSO, 4 ° C, 48 saat
6. Gün	PMT, 4 ° C, 2-3x, 2-3 saat, her			PMT + 2 ° antikoru +% 5 DMSO, 4 ° C, 24 saat (Veya ABC kompleksi ile amplifikasyon başlangıç ​​adımları)
7. Gün	PMT, 4 ° C, 2-3x, 2-3 saat, her		PBT, oda sıcaklığında, 2 saat			Optimum boyama görülünceye kadar PBS taze DAB inkübe

Tarifler (* = her zaman taze hazırlanması)
PBS (fosfat tamponlu tuz)	0.1M fosfat deiyonize su içinde tamponlu tuz. pH 7.2 (Sigma tablet; P4417)
PFA (Paraformaldehyde)	Üretilen ve saklanan çalışma çözüm için PBS içinde% 4 oranında seyreltilmiş sonra% 20 çözüm olarak dondurulmuş ve (; T353 Fisher Scientific)
Dent Sabitleme 3 *	4 parça metanol 1 parçası dimetilsülfoksit (DMSO; Fisher Scientific; D159-4)
Dent Bleach 3 *	4 parça metanol 1 parçası dimetilsülfoksit (DMSO; Fisher Scientific; D159-4) 1 kısım% 30'luk hidrojen peroksit
Enzimatik Sindirim	10 ug / proteinaz K (Roche Diagnostics; 03115828001) ml PBS içerisinde.
PBST	PBS içeren: % 0.1 Tween-20 (Fisher Bilimsel, BP337; Triton tüm durumlarda Tween-20 yerine de kullanılabilir).
PMT 25 *	PBS içeren: % 2 oranında yağsız yağsız süt tozu (Karanfil tercih edilir) % 0.1 Tween-20 (Fisher Scientific; BP337)
PBT 25 *	PBS içeren: % 0.2 sığır serum albumin (Sigma; B9001S) % 0.1 Tween-20 (Fisher Scientific; BP337)
DAB *	PBS 40 ml; 3,3-diaminobenzidin biri 10 mg tablet, (D5905 Sigma-Aldrich) içinde çözülür. ) Reaksiyonu başlatmak için% 30 hidrojen peroksit ve 10 ul ekleyin.
ABC Kompleksi Çözüm	Vectastain kiti (Vektör laboratuarlar, Inc; PK-4000)