Azoxymethane (AOM) ve Dekstran Sülfat Sodyum (DSS) ile Modelleme Kolit-İlişkili Kanser

Özet

Biz hızla pro-inflamatuar ajan dekstran sülfat sodyum (DSS) üç kür takip ve sürekli insan kolit görülenler ile morfolojik ve moleküler benzerlikleri olan farelerde kolon tümörleri oluşturur genotoksik ajan azoxymethane (AOM) hangi yönetiminde bir protokol göstermek kanserle ilişkili.

Özet

Gibi Crohn hastalığı (CH) ve ülseratif kolit (ÜK) gibi enflamatuar barsak hastalığı olan bireyler (İBH), sağlıklı bireyler üzerinde kolorektal kanser (CRC) yakalanma riski altındadır. Bu risk yaygın kolon tutulumu ile köklü UC olan bireylerin% 30 gibi yüksek bir kümülatif insidans, hastalık süresi ve kapsamı ile orantılıdır. İBH ve ilişkili kolit kansere (CAC) ¹ Kolon displazi sonucunda geliştiği düşünülmektedir Bu hücrelerin kronik inflamatuar bir sitokin ortamda kalmış ise. ² spontan ve kolit ile ilişkili kanserler olmak adenokarsinomların kalitesi paylaşmakla birlikte epitel hücre hasarı ve onarım tekrarlanan döngü, altta yatan moleküler olaylar dizisi farklı olduğuna inanılıyor. ^3. Bu ayrım CAC belirli hayvan modelleri için ihtiyaç savunuyor.

Birkaç fare modelleri anda CAC çalışma yapılmamış. Dekstran sülfat Sodium (DSS), kolon epiteli üzerine doğrudan toksik etkileri olan bir ajan, kronik inflamatuar bir devlet oluşturmak için birden fazla döngüleri farelere içme suyu tatbik edilebilir. Yeterli süre ile bu farelerin bazı tümörler gelişir. Yanlısı bir kanserojen ortamda yönetilen eğer ⁴ tümör gelişimi bu modelde hızlandırdı edilir. Bunlar, tümör oluşumunun yollar genetik mutasyonlar ile fareler (APC, p53, Msh2) yanı sıra, fareler genotoksik ajanlar (azoxymethane [AOM], 1,2-dimetilhidrazin [DMH]). ⁵ ile ön tedavi içermektedir

Kolit ilişkili kanser için bir model olarak AOM ile DSS kombinasyonu, tekrarlanabilirlik, kudret, düşük fiyat ve kullanım kolaylığı için popülerlik kazanmıştır. Bunlar ortak bir mekanizmaya sahip olsa da, AOM DMH daha çözelti daha kuvvetli ve stabil olduğu tespit edilmiştir. Diğer modellerde tümör gelişme genellikle gerektirir iken birkaç ay, AOM ile enjekte ve sonradan DSS ile tedavi edilen farelerde bir yeterli tümörler gelişirnin 7-10 hafta kadar az. ^{6, 7} Son olarak, AOM ve DSS belirli bir tümörojenik suşu ile melezlenmesi herhangi bir genetik arka fareler (Transgenik, vs nakavt) ile tatbik edilebilmektedir. Burada, biz 10 haftalık dönemde DSS üç yedi günlük döngüleri takip AOM tek bir enjeksiyon kullanan farelerde inflamasyon odaklı kolonik tümörogenez için bir protokol göstermektedir. Bu model yakın insan CAC meydana benzeyen histolojik ve moleküler değişiklikler tümör uyarıcı ve bu hastalıkta karsinojeneze ve kemoprevensiyonu çalışması için son derece değerli bir model sunar. ⁸

Protokol

1. Kolit ile ilişkili Kanser İndüksiyon

1. Seks kafesleri ve deney ve kontrol grupları için kullanılacak yaştaki 6-8 haftalık farelere kenara koyun. Fare tek kuyruk işaretleri veya kulak klipleri ile etiketli olabilir.
2. 0. günde, kayıt baz ağırlıkları ve 10 AOM çalışma çözeltisi mg / kg (dH2O içinde 10 mg / ml stok solüsyonundan seyreltilmiştir izotonik salin içinde 1 mg / ml, -20 ° C de tutulur) ile her bir fare intraperitoneal (ip) enjekte . Deneyimlere dayanarak, bu doz 7-14 mg / kg ve / arasında ayarlanabilir veya erken denemede tekrar edilebilir.

Dikkat: AOM bir uçucu genotoksik ajan ve ekteki MSDS göre dikkatli bir şekilde ele alınmalıdır. Sulandırma, kimyasal bir davlumbaz hazırlanan buz üzerinde muhafaza ve kuruma özgü protokoller sonrasında atılmalıdır.

3. 0.22 mikron selüloz asetat ile f (2,5 g/100 ml) distile su ve geçişte DSS çözüm% 2.5 olunvakum tarafından ilter. Bu doz fare zorlanma ve ortamına bağlı olarak 1-3,5% arasında ayarlanabilir. 1 hafta kadar için hazırlandıktan sonra, DSS çözümü buzdolabında muhafaza edilebilir.
4. On günde 7, içme suyu olarak farelere tedarik DSS çözüm. Yaklaşık 250 ml / kafes yeni DSS 5 fare / kafes bir süre için verilmektedir her zaman gerekli olacaktır, ancak, bunlar sadece tahmindir ve hayvan tesisinde kullanılan su şişeleri türüne bağlı olarak değişiklik gösterecektir.
5. Yedi gün boyunca DSS sürekli bir kaynağı sağlamak için, DSS çözüm bu dönemde temiz şişeler üç kez (2-3 gün) değiştirilmesi gerekir. Bazı araştırmacılar pozlama bir tedbir olarak yeni bir çözüm ile değiştirmeden önce tüketilen DSS miktarını ölçmek.
6. 14. günde, iki hafta için geri standart içme suyuna kafeslere geçiş.
7. Tekrar adım (1.4) - (1.6) gün 28 ve 49 üzerinde DSS bir ikinci ve üçüncü çevrimi sağlamaktır. Bir DSS "döngüsü" içme suyu DSS bir hafta oluşurDüzenli (otoklav) su 2 hafta izledi.

2. Klinik Değerlendirme Kolit ve Tümör progresyonu

1. Fare tartılır / haftada 2-3 kez uyulmalıdır. Bazal yüzde ağırlık kaybını kolit şiddetinin bir vekil ölçüsü olarak kullanılır. Rektal kanama, ishal veya prolapsusu Düzenli değerlendirmeler çeşitli skorlama sistemlerine göre deneysel hedeflerine bağlı olarak yapılmış ve rapor edilebilir. ^{9, 10}
2. Ishal ve rektal kanama 2-3 gün ile birlikte% 10 kadar bir kilo kaybı DSS (günlük gözlem hemen bu post-DSS dönemde faydalı olabilir) tam bir döngü izleyen bir hafta içinde beklenebilir.

Bazı fareler kurtarmaz olasıdır; kendi ağırlığının% 20'den fazla kaybetme farelerin hayatta kalmak için daha az olasıdır ve erken ötenazi gerektirebilir. 0.5 tek bir IP enjeksiyon - Böyle farelerde 1.0 ml serum fizyolojik flui düzelterek doğru yararlı bir destekleyici tedbir olabilir d hacmi ishal nedeniyle kaybetti.

3. Mürin Endoskopi (İsteğe bağlı)

1. DSS ikinci ya da üçüncü döngü sonrasında Endoskop önce kurban in vivo tümör büyümesini teyit etmek için yapılabilir. AOM / DSS modelinde tümör üretiminde oldukça güvenilir olduğu için, bu genelde bir adım gerekli değildir. Bu fare tümörleri bozmaya potansiyeline sahip olarak sadece birkaç fare, bu yöntem kullanılarak değerlendirilmelidir. ^11.
2. Inhale veya enjektabl sedasyon ile fare uyuştur.
3. Fare uyuşturulduktan sonra, kuyruk ve göğüs bandı ile düz bir tahta için fareyi sabitleyin.
4. Fare rektum yavaşça intralüminal görünümü iyileştirmek ve fekal içeriği kaldırmak için şişirmek ve sulanmasında tuzlu kullanarak içine fare endoskop ilerletin. (Endoskopi de tuzlu bir alternatif ve bu tekniği gibi hava insüflasyonu kullanılarak yapılabilir unutmayın tümörün gelişmiş görselleştirme sunabilir. ¹²⁾

e "> 4. Fare Kurban ve Kolon Hasat

1. Günde 70, her AOM / DSS tedavi fare birden kolon tümörlerinde liman ve değerlendirme için hazır olmalıdır. Büyük tümörler istendiğinde bu tarihten haftalar veya aylar gecikebilir. (Unutmayın ki, prolabe ciddi rektal ile farelerin kurumsal hayvan bakımı komiteleri başı olarak hayvanların aşırı rahatsızlık önlemek için erken ötenazi gerekebilir.)
2. Otopsi öncesinde, bireysel izofluran ve servikal dislokasyon (veya diğer kurumsal onaylı yöntem) ile fareler ötenazi. Nihai ağırlık ve diğer ölçümleri şu anda yapılabilir.
3. Bir kesme tahtası üzerinde maruz olan ventral tarafı fare yatırın. Kolon çıkarma sırasında karın içeriğinin karışmasını tüyleri önlemek için% 70 etanol ile karın örtün.
4. Karın orta hat kavramak ve periton açığa küçük bir kesi yapmak için forseps kullanın.
5. Kostal margi boyunca karın her tarafında bu kesi uzatınn.
6. Kolon anorektal kavşağına kadar hasat edilebilir böylece pelvis kesmek için makas kullanın. DSS kolit yaralanma distal rektum büyük olduğunu ve buna, bu büyük tümör gelişme bölgesi olduğu için bu önemlidir.
7. Böyle mezenterik lenf düğümleri gibi ek dokular da şu anda hasat edilebilir.

5. Makroskopik Analiz Kolon hazırlanması

1. 5 ml'lik bir şınngaya bağlanmış bir 18G iğne kullanılarak gavaj, buz gibi soğuk fizyolojik yönde sıvı çıkar ki salin (PBS) gibi fosfat-tamponlu kolon ile yıkayın. Kolon dokusundan RNA veya protein bazlı analiz için kullanılacaksa, önceden soğutulmuş işi tepsiler kullanılarak soğuk muhafaza edilebilir.
2. Soğuk tepsiye onun mezenter ve boya boyunca uzunlamasına kızarmış kolon açın. Tümörler kolon karanlık bir yüzeye yerleştirildiğinde daha kolaylıkla görülebilmektedir. Alternatif olarak,% 1 Alsiyan mavisi boya t vurgulamak için uygulanabilirumors. Bir cetvel veya dijital kumpas ile tümörün boyutunu ve sayısını değerlendirin.
3. Tümör ve komşu normal doku küçük bölümlerini histolojik değerlendirme için kalan kolon kısmını bırakarak, RNA, protein, veya immünohistokimyasal (İHK) yöntemlerle gelecek analizi için bu noktada eksize edilebilir.

Derhal adım 5.2 izleyerek brüt kolon örneklerinin Dijital fotoğrafçılık yukarıda açıklandığı gibi iki nokta üst üste önemli bölümlerini analiz diğer formları için eksize, özellikle tümör yükünü hassas analizi için yararlı olabilir. Tümör yük (%) gibi ImageJ gibi serbest yazılım kullanarak tümör alanı / toplam kolon alanı olarak hesaplanır.

6. Histolojik Değerlendirme Kolon hazırlanması

1. Şırınga veya parmak ile soğuk tepsi üzerinde kalan kolon% 10 formalin uygulayın. Dokusu bu şekilde en az 30 saniye düzeltmek için izin fiksasyon havza aktarımı sağlıyor. Formalin olun rezidüel wip olduğunued off öncesinde aynı tepsi üzerinde yeni açılan kolon boyama.
2. % 10 formalin ile dolu bir leğene kolonların aktarın ve kenarlarından aşağı pin.
3. Fiksasyon 3 saat sonra,% 70 etanol için kolonlar aktarın. Kolonlar süresiz% 70 etanol içinde muhafaza edilebilir.
4. Kolon (rektum / distal, orta, proksimal) Üç boyuna kesitlerde% 2 agar stabilize ve parafine gömme için sunulabilir. Proksimal kolon ve kolon / rektum distal her fare için düzgün bir şekilde odaklı olduğundan emin olunuz.
5. Displazi, crypt hasarı ve enflamasyon önce yayınlanmış protokolleri doğrultusunda deneyimli bir birey tarafından açıklanan ve değerlendirilmesi mümkün olabilir. Deneyci erken displastik olayları algılayabilecek ilgi ise ^{10, 13-15} Fare gün 70 öncesinde kurban edilebilir.

7. Temsilcisi Sonuçlar

Burada tarif AOM / DSS modeli araştırmacı güvenilir farelerde kolon tümörleri oluşturmasına olanak sağlar.Bu modelde Tümör büyüme direkt olarak ilişkili enflamatuar proses tarafından etkilenir. Kolit şiddeti diyare / hematokezya Zayıflama ve varlığı (Şekil 2) takip ederek klinik olarak izlenmelidir. Hastalık aktivitesi bu belirtileri DSS kaldırıldıktan sonra DSS kürün 5 ile ve dört veya daha fazla gün için başlamak eğilimindedir. Nadiren, önemli bir rektal tümör yükü olan farelerin rektal prolapsus gelişebilir. Ikinci veya üçüncü DSS döngüsü ishal kalıcı hale gelebilir sonra. Genellikle tümör öncesinde DSS üçüncü aşama (Şekil 3) murin kolonoskopi ile mevcut ve tanımlanabilir. Ek zaman ve hasat zamanı (Şekil 4), daha büyük tümörlerde DSS sonuçları üçüncü bir ders. Leke Topikal olarak uygulanan Alsiyan mavisi kullanarak tümör (Şekil 5) vurgulamak için kullanılır. Kolon tümörlerinin Fotoğraf kantitatif tümör üretim ve boyutunu karşılaştırmak için kullanılabilir tümör ölçümler yaratmaya yardımcı olacak,Deney grupları arasında (Şekil 6). Sabit ve parafin kolon örneklerinin ardından histolojik veya immünohistokimyasal boyanma kullanımı (Şekil 7 ve 8) ile değerlendirilebilir.

Şekil 1. AOM ve DSS yönetiminin şematik. AOM (10 mg / kg) 0. günde enjekte edilir. İkinci hafta (günde 7) başında,% 2.5 DSS çözümü kendi içme suyu farelere uygulanır. DSS Yedi gün boyunca otoklava su, iki hafta ile takip edilir. DSS ek bir iki kür feda öncesinde uygulanır.

AOM ve DSS yönetimi sırasında başlangıca göre Şekil 2. Fare ağırlığı. Hafta, fareler los her DSS döngü sonrasında unutmayın vücut ağırlığının e% 5-10. Bu deneyde Kilo kaybı kolit şiddeti için vekil marker olduğunu.

Şekil 3. AOM / DSS tedavi günde 50 murin endoskopi yoluyla distal kolonda tümör görüntüleme. Normal kolon göre distal kolon lümeni engelleyen çoklu polipoid kitle (b, c) (a) not edin.

Şekil 4. Boyuna tümörlerin brüt görünümünü gösteren fare kolon açıldı. Kolon / rektum (sol üst resim) distal yüksek tümör yükü ve küçük bir tümör büyüme ile proksimal kolonda (sağ üst resim) karakteristik rugated doku unutmayın. Distal kolon görünümü kadar yakın bir farklı boyutlarda (aşağıda) çok sayıda tümörler gösterir.

ove_content "fo: keep-together.within-page =" always ">
Alcian blue uygulama tarafından vurgulanan Şekil 5. Tümörler leke. Boya kolon ve normal doku hem de her bir tümör sınırları vurgular kullanıldığını not edin. Bu tür boyama cetvel veya dijital ölçüm ile tümör alanlarının hassas ölçümü yararlı olabilir.

Şekil 6. AOM / DSS ile tedavi fare başına tümörlerin ortalama sayısı Temsilcisi dağılımı. Tümörlerin çoğu distal kolon içinde yer alan not edin ve boyutunu <2 mm 'dir.

Şekil 7. Parafin (yukarıda) kaset kolon boyuna kesitlerH & E izleyerek slayt d (aşağıda) leke. O artık Alcian leke mavi H & E boyama ile karışmaz unutmayın. Büyük tümör slayt görüntüsü (işaretli) döndürülür. Belirtme "distal", "orta" ve "çekum ve anüs arasında üçte tüm kolon kesit proksimalinde" sonucudur.

Şekil 8. Distal kolonda AOM / DSS yönetiminin kaynaklanan bir tümörün Temsilcisi histolojisi. H & E, BrdU, ve (Üst panel) 50X ve 400X de β-katenin boyalı kesitler (Alt panel) sırasıyla kolon insan adenokarsinoma benzer displastik değişiklikler göstermektedir.

Tartışmalar

Hızlı ve etkili modeller insan kolit ile ilişkili kanser AOM ve DSS ile farelerin tedavisi. Kolit ile ilişkili kanserlerin katkıda bulunan faktörleri kalıtsal ilişkin Hipotezler kolayca genetiğiyle oynanmış farelerin ile ele alınabilir. ^13. Alternatif ^16, kolit ilişkili kanser farmakolojik hedefler etkisi wild-tip fareler kullanılarak incelenebilir.

Bu model son derece inflamasyon ortamda kolon tümör gelişimini çalışmaya ilgilenenler tarafından değ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
C57BL/6J Fare	Jackson Laboratuvarı	000664
Azoxymethane (AOM)	Sigma Aldrich	A5486-100mg	Stok çözeltisi: seyreltilir 10 0.5 kadar -20 ° C'de muhafaza edilmesi için distile su içinde mg / ml - 1 ml alikotları. Çalışma çözüm: izotonik içinde 1 mg / ml (% 0.9) serum fizyolojik stok sulandırmak
Dekstran Sülfat Sodyum (DSS)	TDB Danışmanlık	Db001	MW 40 kDa (diğer kaynaklardan 36-50 kDa hazırlıklar kabul edilebilir; aynı lot tek bir deney için kullanılmalıdır) 6
Coloviewminiendoscopic sistemi	Karl Storz	Çoklu	Ekipman ve kurulum ayrıntılı açıklama için Becker ve ark. Bkz. 11.
DYP Rapid FILTERMAX 500 ml Şişe-Filtre, 0.22 mikron PES	Midwest Scientific	TP99500	Herhangi bir standart doku kültürü filtresi kabul edilebilir
Etil Alkol 200 Proof ASC / USP	Farmakoterapötik AAPER (veya diğer)	11ACS200	Distile su içinde% 70 sulandırınız
İzofluran, USP	Butler Hayvan Sağlığı Kaynağı	4029405	Gazlı bez ya da anestezi batırılmış küçük bir bezle cam kavanoza koyun fare
18G Düz Gavaj İğne	Braintree Bilimsel	N-008
Fosfat Salin (PBS) Tamponlanmış	SigmaAldrich	P5493	Distile su 1X (0.01 M) seyreltin
Soğuk Kaset (Tissue Tek II Soğuk Plate)	Fisher Scientific	NC9491941	-20 ° C'de saklayın
ImageJ Yazılım	NIH (ücretsiz)		http://rsbweb.nih.gov/ij/
Formaldehit (% 37)	Fisher Scientific	F79-500	PBS içinde% 10 ile seyreltilir
BD Bacto Agar	Fisher Scientific	DF0140-01-0	Distile su içinde% 2 çözelti oluşturmak için ısı plakası kullanarak
Miltex Göz Giyinme Forseps	MedPlus A.Ş.	18-780
Miltex Göz Makas	MedPlus A.Ş.	18-1430	Kavisli noktaları açılması sırasında kolon hasar görmesini engellemek.
Alsiyan Mavi 8GX (toz)	Sigma Aldrich	A5268	100 ml% 3 asetik asit (3 ml glasiyal asetik asit + 97 ml damıtılmış su) ile 1 g toz ekleme
Intradermal konik iğne ekli 26 G x 3/8 ile 1 ml tüberkülin şırıngası	BD	305946	AOM enjeksiyon için