Post-mortem Doku gelen kardiyomiyosit Çekirdeklerin İzolasyonu

Özet

Kardiyak çekirdeklerin yoğunluğu sedimentasyon ile izole edilmiş ve akım sitometri kardiyomiyosit çekirdeklerinin belirlemek ve sıralamak için pericentriolar malzeme 1 (PCM-1) karşı antikorlar ile immunolabeled edilir.

Özet

En stratejileri sadece sitoplazmik protein işaretleyicileri ¹ güveniyor gibi kardiyomiyosit çekirdeklerinin belirlenmesi doku kesitlerinde zor olmuştur. Gibi çoğalması ve apoptosis gibi kardiyak miyositler Nadir olaylar kardiyak miyosit çekirdeklerinin doğru bir tanımlama homeostazında ve patolojik durumların ² hücresel yenilenme analiz gerektirir. Burada, pericentriolar malzeme 1 (PCM-1) ve sonraki akım sitometri sıralama karşı antikorlar ile yoğunluğu sedimantasyon ve immün tarafından otopsi doku kardiyomiyosit çekirdekleri izole etmek için bir yöntem sağlar. Bu strateji, taze doku ve dondurulmuş arşiv malzemesi gayet iyi çalışma avantajı ile yüksek verimlilik analizi ve izolasyon sağlar. Bu da zaten biyobankalar toplanan malzeme çalışma kolaylaştırır. Bu teknik uygulanabilir ve türler, geniş bir aralık içinde test edilmiştir ve karbon-14 ^3, hücre-CY olarak birden çok alt-uygulamalar için uygundurcle analizi ^4, timidin analogları görselleştirme (örneğin BrdU ve DUK) ^4, transcriptome ve epigenetik analizi.

Protokol

1. Kardiyak Çekirdek İzolasyonu

1. % 1 BSA / PBS kaplama solüsyonu 10 ml Coat ultrasantrifüjdeki tüpler (Beckman santrifüj tüpünde # 363.664). Tüpler Cap ve onları bir tüp rotator 30 dakika döndürün. Kaplama çözümü çıkarın ve santrifüj tüplerine hava kuru (fare kalp başına bir tüp farklı canlı türlerinin tek bir fare kalpleri, dönüşümlü olarak 5'e kadar fare kalpleri veya kalp dokusunun 1 gr analizi için gerekli izin (örneğin insan) işlenebilir bir tüp içinde).
2. Bütün aşağıdaki adımları buz üzerinde yapılmalıdır. Bistüri ile taze veya ek donmuş fare kalpten sol ventrikül parçalara ayır. Not, bu protokol fare kalp için optimize edilmiş değil, aynı zamanda sıçan veya insan kalp adapte edilebilir. Alternatif olarak, farklı canlı türlerinin kalp dokusunun 1 g kadar kullanabilirsiniz.
3. Bistüri ile küçük hücreler halinde numune kesin.
4. Lizis tamponu ile 15 ml ile doldurulmuş bir 50 ml Falcon tüp içine doku parçaları transfer edin.
5. Homojenize10 sn için 24,000 rpm bir T-25 Ultra-Turrax prob homojenizör (IKA) ile kalp dokusu.
6. 30 ml lizis tamponu eşit hacmi Homojenat sulandırınız.
7. Daha fazla doku ve serbest çekirdekler homojenize bir cam douncer (40 ml) kullanın. Büyük bir boşluk havaneli sekiz vuruş yapın.
8. Ham çekirdek, 100 mikron ile 70 mikron naylon örgü hücre süzgecinden (BD Biosciences), ardışık yoluyla izole geçirin.
9. Ham çekirdekler 10 dakika süreyle 700 xg'de bir soğutmalı santrifüj (4 ° C) izole aşağı Spin.
10. Ters tüpler tarafından dikkatle Süpernatantı ve kağıt havluyla tüpün içini silin. Çekirdekler pelet rahatsız dikkat edin.
11. Ham çekirdek çözümü birkaç kez pipetleme ve aşağı sakaroz tampon 5ml izole eritin. Çözünmüş pelet ile sükroz tampon, bir başka 25 ml ilave edilir.
12. Kaplamalı ultrasantrifüjdeki tüp (adım 1.1) için taze hazırlanmış sakaroz tampon 10 ml ekleyin.
13. Dikkatli bir şekilde adım 1.9 den sükroz tampon içinde yeniden süspanse çözünmüş çekirdekler pelet ile sükroz tampon katma 10 ml kaplamak.
14. Bir JS13.1 ücretsiz sallanan rotor koymadan önce santrifüj tüplerine dengelemek ve yüksek hızlı santrifüj (Beckman Avanti S-25) içine rotor yerleştirin.
15. 60 dakika süre ile 4 ° C'de 13,000 x g'de çekirdekler Örnek dönerler.
16. Spin tamamlandığında, rotor dikkatlice tüpleri çıkarın ve ters tüpleri ile süpernatantı atın ve kağıt havlu ile tüplerin içerisinden kalan enkaz silerek.
17. Çekirdeklerin depolama tamponu (NSB artı tampon) 1 ml içinde çekirdekleri pelet eritin. Not: NSB artı bir DNA stabilizatörü olarak 1.5 mM spermin içerir.
18. Kardiyomiyosit çekirdeklerinin İmmünoboyama, adım 2.1 ile devam edin.

2. Akım Sitometri için pozitif

1. Immünboyama için negatif kontrol hazırlayın. Bir çekirdek numunenin 20 ul dışında tablet ve bir atınNSB artı tamponu dd 980 ul.
2. Immunolabel kardiyomiyosit çekirdeklere 1:500 dilüsyon içinde çekirdek örnek anti-pericentriolar malzeme 1 antikoru (tavşan anti-PCM-1, Atlas Antikorlar) ekleyin. Adım 2,1 hazırlanan negatif kontrol etmek anti-PCM-1 antikoru ile aynı seyreltme, in izotip antikor ekleyin.
3. 4 ° C'da negatif kontrol ve numune inkübe edin.
4. NSB artı tamponu (10 dakika için 700 xg'de bir soğutmalı santrifüj (4 ° C) tüpler aşağı döndürün. Süpernatan atın ve NSB artı tampon 1 ml çekirdekleri pelet erimesi) ile en az bir kez negatif kontrol ve numune yıkayın.
5. 1:1000 dilüsyon negatif kontrol ve numune tüpüne anti-tavşan floresan sekonder antikor (FITC veya APC) ekleyin.
6. 1 saat boyunca 4 ° C de negatif kontrol ve numune inkübe.
7. NSB artı tamponu (10 dakika için 700 xg'de bir soğutmalı santrifüj (4 ° C) tüpler aşağı spin ile en az bir kez negatif kontrol ve numune yıkayın. Süpernatant atın ve) NSB artı tampon 1 ml çekirdekleri pelet çözülür.
8. Akım sitometri analizi ve sıralama ile devam edin.

3. Akım Sitometri

1. Adım 1.1 'de tarif edildiği gibi sıralama akış sitometrisi başlamadan önce,% 1 BSA / PBS çözeltisi ile Coat çekirdekler toplama tüpleri (Falcon 15 ml).
2. Örnek 30 um ve bir hücre süzgecinden negatif kontrol filtre ve (BD Akın) ilk akış sitometresi ile negatif kontrol yerleştirin. Forward scatter (FSC), forward scatter darbe genişliği (FS darbe genişliği) ve yan dağılım (SSC) (Şekil 2a ve b) dayalı, çekirdekler ve mayoları (tek çekirdek) tanımlamak için birinci ve ikinci kapısı tanımlayın. Örnek leke bir DNA (DRAQ5 (1:500)) ekleme başlangıçta çekirdek nüfusu belirlemek için yardımcı olabilir.
3. Immunolabeled örnek yükleyin ve non-kardiyomiyosit çekirdek (PCM-1-negatif) gelen kardiyomiyosit çekirdeklerin (PCM-1-positve) izole etmek için üçüncü kapısı tanımlar. Sıralama başlayın(Şekil 2 c ve d).

İsteğe bağlı: nükleer DNA içeriği (ploidi) analiz etmek ve çekirdekleri (örn. Hoechst 33342 veya DRAQ5) (Şekil 2e) için leke uygun bir DNA eklemek hücre döngüsü analizi gerçekleştirmek için.

4. Flow sitometri sıralama sonra, buz çekirdekleri yerleştirin ve sıralama saflık (Şekil 3a ve b) belirlemek için yeniden analiz.
5. 15 dakika için soğutmalı santrifüj 1500 xg'de toplama tüpleri içinde sıralanır çekirdekleri aşağıya Spin.
6. Aşağı uygulama ile uyumlu bir tampon içinde çekirdekler pelet içinde çözülür.

4. Temsilcisi Sonuçlar

Çekirdek morfoloji ve DNA bütünlüğü lekeleri tarafından değerlendirilmeli ve mikroskobu (Şekil 1) ile görüntülenebilir. Başarılı PCM-1 etiketleme Epifloresans mikroskop ile ve akım sitometri (Şekil 1 ve Şekil. 2c ve d) tarafından değerlendirilebilir. PCM-1-positiettik ve negatif popülasyonunda (Şekil 2c ve d) birbirinden ayrılmalıdır. Fare sol ventrikül tüm çekirdeklerin yaklaşık% 30 (Şekil 2d) kardiyomiyosit çekirdeklerinin olmalıdır. Saflık Sıralama sıralanır çekirdeklerin (Şekil 3a ve b) yeniden analiz edilerek değerlendirilebilir. Her iki çekirdek popülasyonları% 95 aşan bir sıralama saflıkta olmalıdır.

Şekil 1.. PCM-1 kardiyomiyosit çekirdekler tanımlar. Kardiyak çekirdekler (a) PCM-1 (b) ve yetişkin bir fare kalbinde Nkx2.5 (c) antikorları ile boyanmış edilir. (D) PCM-1-etiketli çekirdekleri kardiyomiyosit sitoplazma (miyozin ağır zincir (MHC)) ile çevrilidir ve PCM-1 boyanmasının (ölçek çubukları 20 mikron ve 10 kardiyomiyosit çekirdeklerinin doğru kimlik belgeleyen, transkripsiyon faktörü Nkx2.5 ifade edilir mikron (d, inset)). (E) DNA ile görselleştirildiği Kardiyak çekirdekleri izole DRAQ5 leke. (F ve g) CardiomyocYTE çekirdekler PCM-1 (ölçek çubuğu 10 mikron) karşı antikorlar ile etiketlenir. Not, doku bölümünde miyosit çekirdek ve izole çekirdek (oklar), PCM-1 epinuclear boyanma paterni.

Şekil 2. Kardiyomiyosit çekirdeklerinin Akış sitometrik sıralama. (A) Kardiyak çekirdeklerin forward scatter (FSC) ve yan dağılım (SSC) ile tanımlanır. (B) ikinci bir kapısı FSC ve FS darbe genişliği ⁵ ile tek çekirdek tanımlar. (C, d) Fluorescent perdeleme kalp dokudan kardiyomiyosit çekirdeklerin ayrılması (PCM-1-pozitif) ve non-kardiyomiyosit (PCM-1-negatif) çekirdekler sağlar. (E) Fare kardiyomiyosit çoğunlukla (>% 80) diploit (2n) olan, sadece küçük bir alt kümesini (4n) ⁶ tetraploid olduğunu. Not, insan kardiyomiyositlerin poliploidi çekirdeğinin daha yüksek bir frekans (> 2n) ^7,8 içerir.

Şekil 3. Sıralanır kardiyomiyosit ve non-kardiyomiyosit çekirdeklerin saflığı analizi. Sıralanır non-kardiyomiyosit (a) ve kardiyomiyosit çekirdekler (b) yeniden analizi. Hem nüfusları% 99 aşan bir sıralama saflık göstermektedir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Kardiyomiyosit çekirdeklerinin doğru tespit miyokard ^2,3 rejeneratif süreçlerinin analizi için çok önemlidir. Taze dokudan kardiyomiyositler izole etmek için, geleneksel teknikler özellikle hücre dışı matris proteinlerine enzimatik sindirimi ve düşük hızlı santrifüjleme ile interstisyel hücreleri daha sonra saflaştırma dayanmaktadır. Embriyonik kök hücreler (ESC) ile yaşayan kardiyomiyositlerin saflaştırma gibi Sirpa ⁹ veya mitokondriyal boyalar ¹⁰ gibi yüzey...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Lizis Tampon
Reaktif Adı
0,32 M sakaroz
10 mM Tris-HCl (pH = 8)
5 mM CaCl2
5 mM magnezyum asetat
2.0 mM EDTA
0.5 mM EGTA
1 mM DTT

2. Sakkaroz tampon

Reaktif Adı

2.1 M sakkaroz

10 mM Tris-HCl (pH = 8)

5 mM magnezyum asetat

1 mM DTT

3. Çekirdekler depolama tamponu (NSB plus)

Reaktif Adı

0,44 M sakaroz

10 mM Tris-HCl (pH = 7,2)

70 mM KCl

10 mM MgCl2

1,5 mM spermin

Reaktifler ve Ekipmanları	Şirket
Izotip tavşan IgG-ChIP Grade # ab37415	Abcam
Tavşan anti-PCM-1 antikoru, # HPA023374	Atlas Antikorlar
Eşek sn. antikoru, anti-tavşan Alexa 488 Fluor, # A-21206 veya eşdeğer san. floresan antikor	Yaşam Teknolojileri
DRAQ5	Biostatus
Hücre süzgeçler 30 mikron, 70 mikron ve 100 mikron	BD Biosciences
Cam douncer (40 ml) ve"L" havaneli	VWR (Wheaton Sanayi A.Ş.)
T-25 Ultra-Turrax Homojenizatör	IKA Almanya
Aracı S25 N-18 G Dispergatör	IKA Almanya
Beckman Avanti Santrifüj	Beckman Coulter
Falcon tüpler 15 ml ve 50 ml	VWR
Beckman Santrifüj Tüpleri # 363664	Beckman Coulter
JS13.1 ücretsiz sallanan rotor	Beckman Coulter
Akını sitometresi	Beckman Coulter
Tüp Rotator	VWR