İçte düzeltici Potasyum Kanallarının Küçük moleküllü Modülatörler için Yüksek throughput Eleme

Özet

Içe doğru doğrultucu potasyum (Kir), yüksek verim Bileşik elemesi için kanal aktivitesini ölçmek için nicel bir floresan deneyi geliştirilmesi ve doğrulanması için yöntemler sunulmaktadır.

Özet

Içe doğrultucu potasyum (Kir) kanal aile Özgül üyeleri hipertansiyon, atriyal fibrilasyon, ve ağrı ^1,2 dahil olmak üzere çeşitli hastalıkları için ilaç hedefleri öne vardır. Çoğunlukla, ancak, onların terapötik potansiyeli hatta temel fizyolojik fonksiyonlarını anlamak doğru ilerleme iyi farmakolojik araçların eksikliği yavaşlatıldı. Nitekim, dahilde doğrultucu ailesinin moleküler farmakoloji kadar nanomolar-afinite ve yüksek selektif peptid toksin modülatörleri sayısı ³ keşfedilmiş olan voltaj bağımlı potasyum (Kv) kanalları, S4 süperailesinin gerisinde kalmıştır. Arı zehiri tertiapin toksin ve bunun türevleri ^4,5 Kir1.1 ve Kir3 kanallarının potent inhibitörleri olan, fakat peptidler deneysel tedavi edici olarak hem de sınırlı kullanımlı bunların antijenik özelliklere ve zayıf biyo-, metabolik stabilite ve doku penetrans bağlıdır. Güçlü bir geliştirmeve gelişmiş farmakolojik özellikleri ile seçici küçük moleküllü probları tam fizyoloji ve Kir kanallar terapötik potansiyelini anlamak için bir anahtar olacaktır.

Akademik bilim adamları daha iyi farmakoloji ⁶ ihtiyacı moleküler hedefler ve sinyal yolları için prob keşif kampanyalar başlatmak için Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenen Moleküler Kütüphaneler Sondalar Üretim Merkezi Ağ (MLPCN) (NIH) Ortak Fon fırsatlar yaratmıştır. MLPCN araştırmacılar sanayi ölçekli tarama merkezleri ve tıbbi kimya ve bilişim genler ve gen ağlarının işlevi aydınlatmak için küçük-molekül probları geliştirmeniz için size destek erişim sağlar. MLPCN giriş kazanıyor kritik adım yüksek çıktılı tarama (HTS) için müsait bir sağlam hedef veya yol özgü testinin gelişmedir.

Burada, bir floresans tabanlı talyum (Tl ⁺⁾ akı assa nasıl geliştirileceğini açıklaryüksek verimli tarama bileşik ^7,8,9,10 Kir için kanal işlevi y. tahlil geçirgenlik K ⁺ K ⁺ türdeş Tl ⁺ için kanal gözenek dayanmaktadır. Ticari olarak kullanılan floresan Tl ⁺ raportör boya gözenek içinden Tl transmembran akı ⁺ tespit etmek için kullanılır. BTC, FluoZin-2, ^7,8 ve FluxOR: Tl ⁺ akı deneyleri için uygun olan, en az üç ticari olarak temin boyalar bulunmaktadır. Bu protokol, FluoZin-2 kullanılarak analiz gelişimi açıklanmaktadır. Aslında gelişmiş ve çinko göstergesi olarak pazarlanan rağmen, FluoZin-2 sergiler Tl üzerine floresans emisyon ⁺ bağlayıcı bir sağlam ve doza bağımlı artış. Biz FluxOR ^7,8 sunulmuştu ve böylece ^9,10 yapmaya devam etmişlerdir önce FluoZin-2 ile çalışmaya başladı. Ancak, test geliştirme adımları her üç boyalar için temelde aynıdır, ve kullanıcılar kendi özel n için en uygun olan boya belirlemelidireeds. Biz de MLPCN giriş için dikkate alınması gereken ulaşmış olmalıdır test performans kriterleri tartışacağız. Tl ⁺ kolayca en K ⁺ kanalları nüfuz bu yana, tahlil en K ⁺ kanal hedeflerine uyarlanabilir olmalıdır.

Protokol

1. Kararlı Poliklonal Hücre Hatları Üretimi

1. Ilgi Kir kanalı ifade eden bir yüksek kalite istikrarlı hücre hattı kurulması sağlam yüksek çıktılı tarama testi geliştirme yolunda önemli bir ilk adımdır. Kurucu K ⁺ kanal ekspresyonu hücre ölümü yollar, kararlı hücre hattı dejenerasyon ve tahlil performans kaybı aktivasyonuna yol açabilir. Bu potansiyel sorunları önlemek ve analiz gelişimi için uygun bir iç kontrol (aşağıya bakınız) sağlamak için, bir tetrasiklin indüklenebilir ekspresyon sistemi ⁸ tavsiye edilir.
2. Kültür ebeveyn T-Rex HEK293-B-(DMEM büyüme ortamı% 10 FCS, 50 U / ml penisilin, 50 ug / ml streptomisin ve 5 ug / ml Blasticidin S içeren), standart teknikler kullanılarak hücreler. Transfeksiyon ve istikrarlı klon seçimi için erken geçiş hücreleri (sıvı azot depolama çözdürme yana örneğin 3-4 pasajlar) kullanın.
3. Bir Plak 4 milyon t-rex-HEK293 hücrelerine75 ^cm2 şişeye böylece şişenin yaklaşık% 80 oranında konfluent ertesi gün olmasıdır. 37% 5 CO ₂ inkübatör gecede Kültür ° C.
4. Üretici protokolüne göre 10-15 pcDNA5/TO-Kir DNA mikrogram ve lipofektamin LTX / Artı reaktifi kullanılarak hücrelerin transfekte. 5 saat sonra, B-orta ile transfeksiyon ortamı değiştirin.
5. 24 saat transfeksiyon sonra, B-orta istikrarlı klon seçimi başlamak için 250 mcg / ml higromisin (BH-orta) ihtiva eden B-orta değiştirin. Taze BH-orta ile 2-3 günde hücre besleyin.
6. Hücrelerin% 90 daha dengeli transfekte edilmiş bir hücre küçük koloniler geride bırakarak, sonraki 7 gün boyunca kalıp gerekir. Koloniler genişletilmesi için 175 cm ² şişesine bölünmeden önce ek bir 10-14 gün büyümeye izin verin.
7. Kriyoprezervasyon için 3 dondurmak x 10% 45 içeren ortamlarda ⁶ hücre / ml BH-orta,% 45 antibiyotik içermeyen serum içeren DMEM ve% 10 DMSO klimalıdır. Dondurmak-80 gecede hücreler daha sonra ° bir hücre dondurma kabı C ve uzun süreli depolama için sıvı azot taşımak. Invitrogen önerdiği protokolü kullanılarak sıvı azot hücreleri çözülme. Bu işlem sırasında% 75 oranında konfluent daha büyük olan bir şişeyi dondurulur ise hücrelerin canlılığı alt olacağına dikkat ediniz.

2. Kararlı Monoklonal Hücre Hatları Üretimi

1. Iki değerlikli içermeyen HBSS ile istikrarlı bir poliklonal hücrelerinin bir alt-konflüan 75 ^cm2 şişeye yıkayın. 37% 5 CO ₂ inkübatör 3-5 dakika tripsin ve inkübe 1 ml ekleyin ° C. Tripsin aktivitesini inhibe ve tam hücreleri ayırmak (örneğin, 5 kez) art arda öğütmek için şişeye BH-orta 5 ml ekleyin. Dikkatle süspansiyon neredeyse tamamen tek hücre oluşur sağlamak için mikroskop altında hücreleri inceleyin. Bu monoklonal hücre çizgilerinin elde edilmesi olasılığını artıracaktır.
2. Hücre yoğunluğu belirlemek ve seyreltik20 ul başına 0.7 hücre konsantrasyonu süspansiyon. BD PureCoat amin-kaplı (veya eşdeğer bir poli-D-lizin kaplı) 384 oyuklu plakalar her oyuğuna çok kanallı bir pipet, pipet hücre süspansiyonu 20 ul kullanılması. Prensip olarak, kuyuların% 70'i bu kaplama koşulları ile bir hücre almalıdır. Bu nedenle, bir 384-kuyucuklu plak analiz etmek için, 200'den fazla klon içermelidir. 37, _bir% 5 CO2 kuluçka makinesi içinde kültür hücreleri ° C'de devam edin
3. Bir hafta sonra, tek koloniler içeren kuyular için mikroskop altında plakaları inceleyin. Gelecekte başvurmak için kalıcı bir kalem ile kapak üzerindeki konumuna dikkat edin. Ayrıca unutmayın ve birden kolonilerini barındıran kuyu dışlamak için emin olun. Bu en kolay yanı birden fazla taraftan büyüyen kolonilerin görünümü tarafından tanınır. Buharlaşma plaka kenarına yakın kuyulardan daha çabuk meydana eğilimindedir unutmayın. Önemli buharlaşma oluştu kuyulara BH-orta ekleyin. Aksi takdirde, bu gereksiz thücreler besleme o.
4. Sonraki 7-10 gün boyunca daha sık kuyu izleyin. Hücreler, ilgi kuyu en az% 50 konfluent olduğunda bölmek için hazır hale gelir.
5. 384-kuyucuğu çoğaltmak için hücreleri bölün, kültür monoklonal hatları devam etmesi için Tl ⁺ akı ve diğer içlin bir tabak. İlgi hücre soyları içeren kuyu ortamı aspire. Iki değerlikli-serbest HBSS ile yıkayın hücrelerini, her bir kuyu için tripsin 20 ul ekle ve 15-20 dakika için bir 37 ° C kuluçka makinesi ile levha aktarın. Hücre kültürü başlık geri hareket eden plaka sonra, her bir kuyucuğa BH-orta bölgesinin 20 ul ekle ve hücreler ayrıştırmak için birkaç kez öğütmek. Hücreleri tamamen uzaklaşılmış sağlamak için mikroskop altında kuyuları kontrol edin. Hücreler sıkıca bağlı olacak, bu durum pipetleme arasında çok sayıda mermi gerektirebilir. Hücreler ayrılmış olduğunda, bir yeni BD PureCoat amin-kaplı 38 kuyu çoğaltmak için her bir hücre süspansiyonu 10 ul aktarmakPlaka 4-iyi. Iyi kaynağı arasındaki ilişki dikkat ve sağlam Kir kanal aktivitesini (aşağıya bakın) gösteren klonlar orijinal de geri izlenebilmektedir böylece hedef kuyuları yinelenen emin olun. 37% 5 CO ₂ inkübatör kalan hücreleri besleyen ve kültürü devam onları iyi orijinal kaynak ° C'ye BH-orta 20 ul ekleyin
6. Hedef plaka hücreleri yapışır ve bir hafta için büyümeye izin verin. Klonların en azından% 50 izdiham ulaştıklarında, onlar Tl kullanarak Kir kanal aktivitesini değerlendirilebilir ⁺ akısı testi aşağıda açıklanmıştır.
7. Tahlilinden önce gün, kültür ortamı aspirat ve% 10 diyalize FBS içeren BH orta ile değiştirin. Bu tetrasiklin kontamine serum doğabilecek istenmeyen kanalı ifade önler. 1 ug / ml tetrasiklin ile de dahil olmak üzere her bir klon için yinelenen kuyu yalnız birini ifade Kir kanal meydana getirir. Iyi uninduced yinelenen bir olarak hizmet verecek"Arka plan" kontrolü. Sonraki açıklandığı gibi Tl ⁺ akı testleri gerçekleştirin.

3. Genel Tl ⁺ Akı Test İşlemi

1. Tl, bir önceki gün ⁺ akı deneyi, hücre ayrıştırmak ve bölümler 2.1 ve 2.2 'de tarif edildiği gibi hücre süspansiyonu yoğunluğunu ölçmek. Levha 20.000 monoklonal hücreler stabil bir Thermo Multidrop Kombi veya çok kanallı pipet kullanarak BD PureCoat amin kaplı 384-plaka Her iyi ilgi bir kır kanal geni ile transfekte. Kaplama için% 10 diyalize FBS içeren BH ortamı kullanın. Bazı hücreler Kir kanalı ifade uyardığı 1 mg / ml tetrasiklin gecede kültüre olacak unutmayın, diğerleri olmaz ise. Indüklenmiş ve uninduced hücrelerin yer deney, her tip için farklı olacaktır ve Şekil 1 de gösterilmiştir.
2. Ertesi gün, hücreler yapışık olduğundan emin olmak için, bir mikroskop altında plakaları denetlemeyi ve eşit alt genelinde dağıtılankuyu. Kuyular% 80-90 birleştirilebilmeli.
3. 20 ul başına da 20 mM Hepes ihtiva eden HBSS deney tamponu ile hücre kültür ortamı değiştirmek ve NaOH ile pH 7.3 'ye tamponlanmış bir ELx405 Mikrolevha Yıkayıcı kullanın. Alternatif olarak, bir tabak ters ve bir atık kabı içine orta çıkarmak için keskin bir düşüşle tersledi ve sonra geri kalan ortamı çıkarmak için yığılmış kağıt havlu üzerine okşadı, neyin "flick ve slam" yöntemini kullanabilirsiniz. Hemen kuruttuktan gelen hücreleri önlemek için plaka ile HBSS tahlil tampon ekleyin.
4. FluoZin-2 hazırlayın, boya yükleme çözümü AM. Kısaca tüp santrifüjleme sonra, susuz DMSO 100 ul içinde FluoZin-2 tozu 50 mg çözülür. Bu noktada, 1.000 x stok solüsyonunun bir oyuktan daha sonra kullanılmak üzere -20 ° C'de muhafaza edilebilir. Zaman kullanıma hazır, yumuşak pipetleme ile boya ve karışımı hacim Pluronic F-127/DMSO çözümü başına% 20 kilo 50 ul ekleyin. Pluronic F-127 eklendi kez olarak, boya dondurma etmeyindüşük sıcaklık yüzey aktif çözeltiden çökelebilir neden olabilir. FluoZin-2 150 ul hacim, HBSS tahlil tampon AM/Pluronic-F127 100 ml ekleyin ve boya yükleme tampon yapmak için hafifçe karıştırın. Bir Multidrop Kombi veya çok kanallı pipet kullanarak, HBSS deney tamponu her iyi zaten içeren 20 ul boya yükleme tampon 20 ul ekleyin. Yaklaşık olarak 1 saat ile (gerekli olduğu herhangi bir direkt kanıtlar olmasına rağmen, genellikle kuluçka, koyu yapılmıştır) ve oda sıcaklığında hücreler inkübe edin.
5. Hücreleri boya ile yükleme yaparken, bir Tl ⁺ uyarıcı plaka hazırlamak. Taze 1 mM magnezyum sülfat, 1.8 mM kalsiyum sülfat, 5 mM glükoz, 10 mM HEPES ve 12 mM Tl ⁺ sülfat ihtiva eden 5x Tl ⁺ uyarıcı tamponu ve 50 ml sodyum bikarbonat ve 0.5 g çözülür. Örneğin, çözelti pH karbon dioksit arasında çok dar bir aralık ve kayıp içinde tutulmalıdır, alternatif olarak, sodyum bikarbonat, sodyum glukonat ile değiştirilebilirbir husustur. Karbon dioksit kaçış sınırlamak ve sodyum bikarbonat çözeltisi içine girene kadar birkaç kez ters çevirmek için sıkıca tüp kapak takın. Çok kanallı bir pipet kullanarak, bir polipropilen 384-kuyucuklu levha (Tablo 1) her bir oyuğa 50 ul solüsyon ilave edin.
6. Hücreler FluoZin-2 yüklendikten sonra, AM, bir ELx405 Mikrolevha Yıkayıcı ile tabakları yıkamak veya yukarıda bölüm 3.3 'te açıklandığı gibi, "flick ve slam" yöntemini kullanarak. Tl ve tipi ⁺ gerçekleştirilmesi akı deney bağlı olarak, sırt 20 ul ya da her bir kuyucuğa HBSS tahlil tamponu 40 ul ilave edin. Plakaları artık deneyler için hazırız.
7. Bir Hamamatsu Fonksiyonel Uyuşturucu Madde Tespit Sistemi (FDSS) veya tümleşik sıvı dağıtım yetenekleri ile eşdeğer kinetik görüntüleme plaka okuyucu içine hücre ve Tl ⁺ plakaları. Böyle Fluo-4 olarak floresein / floresein-bazlı boyalar için uygun filtreleri kullanın.
8. Tek eklenti protokol ayarlama 10 ul 5x Tl böylece ⁺HBSS dizi deney tamponu 40 ul ihtiva eden hücre plaka tekabül eden oyuklara ilave edilir. En az 10 sn için 1 Hz örnekleme frekansında Tutanak taban floresans. Optimum hücre kaplama, yıkama ve boya yükleme koşulları oluşturulmuştur kez hali-de floresans plaka üzerinde üniforma ve kararlı olmalıdır. Entegre bir 384-pipet kanalı eşzamanlı olarak her bir kuyucuğa Tl ⁺ uyarıcı tampon eklemek için kullanılır.
9. Tl, floresan in ⁺ kaynaklı artışın ve tepe off-line analiz için çekilir, böylece en az 2 dakika süreyle kaydedin.

4. Optimal Tl + Konsantrasyonu Tayini

1. Tl ⁺ kolayca en içe düzeltici K ⁺ kanalları nüfuz eder. Tl ⁺ konsantrasyonları Tl dinamik aralığını aşmamasını sağlamak için, raportör ⁺ boya FluoZin-2, bir ampirik bir yüksek-t kullanılmak üzere en uygun Tl ⁺ konsantrasyonunun belirlenmesi gerekirhroughput ekranı. Bu kanalın azami aktif koşullar altında, maksimum flüoresans yanıt (EC _80)% 80 uyandıran bir Tl ⁺ konsantrasyonu önerilir.
2. Levha, boya yük ve her bir kuyu HBSS içinde deney tamponu 40 ul bırakarak, Bölüm 3, yukarıda tarif edildiği gibi BD PureCoat amin-kaplı ya da eşdeğer poli-D-lizin kaplı 384 oyuklu plakalar içinde hücreleri yıkayın. Şekil 1A, sütun 1 ve A1-A23 tetrasiklin ile indüklenen edilmemiştir ve bu nedenle faiz Kir kanalı ifade etmezler hücreleri içermelidir satır plaka haritada gösterilmiştir. Uninduced kuyulardan FluoZin-2 flöresan sinyalleri, örneğin Na gibi endojen yoluyla Tl ⁺ akı seviyesini belirlemek için kullanılır ⁺ - normal olarak ifade edilir K ^+-ATPaz pompası ve voltaj kapılı K ⁺ kanalları, HEK- 293 hücreleri.
3. Bir hazırlamak için pipetleme bir Agilent Bravo Otomatik Liquid Handling Platform veya manuel kullanınHBSS deney tamponu onbir nokta Tl ⁺ konsantrasyonu dilüsyon serisi. Tipik olarak,% 100 Tl ^+% 0.002 arasında değişen bir seri 3-kat seyreltme serisi deneyinde değerlendirilmiştir. Tl ⁺ çözümleri son testte 1:05 seyreltilmiş konacağından serisi 5x konsantrasyonunda kadar yapılmalıdır. 5x Tl, 1 mM magnezyum sülfat, 1.8 mM kalsiyum sülfat, 5 mM glukoz ve 10 mM HEPES içeren ^+-serbest tampon ile bölüm 3'te tarif edilen standart 5x Tl ⁺ tampon seyreltilmesi ile seyreltme serisi hazırlanır. Yine, taze Şekil 2A'da gösterilen plaka haritasına göre 384-kuyucuklu plak, bir polipropilen kaplama hemen önce son Tl ⁺ tampon 50 ml sodyum bikarbonat ve 0.5 g çözülür.
4. FDSS içine hücre ve Tl ⁺ uyarıcı levhalar yerleştirin. 10 ul 5x Tl ⁺ serisi HBS 40 ul ihtiva eden hücre plaka tekabül eden oyuklara ilave edilir ve böylece bir tek-add protokol ayarlamaS deney tamponu. Tl ekleyerek ⁺ plaka önce 10 saniye Tutanak bazal FluoZin-2 floresan. Sonuçların tekrarlanabilirliği kurmak için 3 ayrı günlerde deney tekrarlayın.

5. DMSO için Assay Hassasiyet Belirlenmesi

1. Bir yüksek hacimli ekran şekilde sorgulandığı küçük moleküller kendisi tayinin performansını etkileyebilir organik çözgen dimetil sülfoksit (DMSO) içinde çözülür. Bu nedenle, DMSO için test hassasiyeti ilk ekranında izin verilen en yüksek DMSO konsantrasyonu kurmak için muayene edilmelidir.
2. Levha, boya yük ve her bir kuyu HBSS içinde deney tamponu 20 ul bırakarak, Bölüm 3, yukarıda tarif edildiği gibi BD PureCoat amin kaplı 384 oyuklu plakalar içinde hücreleri yıkayın. Tüm plaka tetrasiklin (Şekil 3A) ile uyarılan hücreler edilmiştir içermelidir.
3. On bir nokta D hazırlamak için pipetleme bir Bravo Otomatik Liquid Handling Platform veya manuel kullanınHBSS deney tamponu içinde MSO konsantrasyon seyreltme serisi. Tipik olarak,% 10 dan% 0.01 hacim / hacim DMSO ile 2 arasında değişen bir kat inceltilmiş serileri tahlilinde etkinlik için değerlendirilir. DMSO çözümleri nihai tahlil yarı yarıya seyreltilmiş olacak çünkü serisi 2x konsantrasyonda kadar yapılmalıdır. Seyreltme serisi Şekil 3A'da gösterilen plaka haritasına göre, 384-kuyucuklu plak, bir polipropilen kaplanacaktır.
4. AK ₈₀ veya optimal Tl 4. bölümde belirlenen ⁺ konsantrasyonuna dayalı olarak 5x Tl ⁺ uyarıcı levha hazırlayın.
5. FDSS içine hücre, DMSO ve Tl ⁺ uyarıcı levhalar yerleştirin. 2x konsantrasyonda DMSO dizi 20 ul tahlil tampon HBSS 20 ul ihtiva eden hücre plaka tekabül eden oyuklara ilave edilir, böylece bir, iki ekleme protokol ayarlayın. Hücreler bir ekran sırasında küçük molekül araç maruz kalacağı aynı zaman miktarı için hücreler üzerinde DMSO bırakın. At için kayıt başlangıç ​​FluoZin-2 floresansen az 10 saniye hücre plakanın her için 5x Tl ⁺ tamponu 10 ul eklemeden önce. Sonuçların tekrarlanabilirliği kurmak için 3 ayrı günlerde deney tekrarlayın.
6. Tahlil bileşikler 10 uM bir konsantrasyonda test edildiği tipik bir yüksek hacimli ekran için en az% 0.1 v / v konsantrasyonlarda DMSO ile toleranslı olması gerekir.

6. Bilinen Farmakolojik Modülatörler için Assay Hassasiyet Belirlenmesi

1. Testin optimum Tl ⁺ konsantrasyonu ve DMSO hoşgörü belirledikten sonra, etkileri incelenmelidir Kir kanalı aracılı Tl ⁺ akı üzerinde farmakolojik aktif maddeler bilinmektedir. Bu deney serisi etkinliği şekilleri (örnek aktivatör inhibitörü) dayanan bileşikler sınıflandırır, ve daha sonra kullanılmak üzere iyi davranışlı kontrol bileşikleri belirlemek için bu etki, yeteneklerine bağlı olarak sayı sıralı bileşikler tahlil hassasiyeti, yeteneği değerlendirecek tahlil development ve ekran.
2. Levha, boya yük ve her bir kuyu HBSS içinde deney tamponu 20 ul bırakarak, Bölüm 3, yukarıda tarif edildiği gibi BD PureCoat amin kaplı 384 oyuklu plakalar içinde hücreleri yıkayın. Sütun 1 satır ve A1-A23 tetrasiklin (Şekil 4A) ile uyarılan edilmemiş hücreler içermelidir.
3. HBSS deney tamponu bilinen modülatörlerin on bir noktaya konsantrasyon dilüsyon serisi hazırlamak için pipetleme bir Bravo Otomatik Liquid Handling Platform veya manuel kullanın. Tipik olarak, 100 uM 2 nM e kadar değişen bir 3-kat seyreltme serisi tahlilinde etkinlik için değerlendirilir. DMSO çözümleri nihai tahlil yarı yarıya seyreltilmiş olacak çünkü serisi 2x konsantrasyonda kadar yapılmalıdır. Seyreltme serisi Şekil 4a'da gösterilen plaka haritasına göre, 384-kuyucuklu plak, bir polipropilen içinde üç kopya halinde kaplanacaktır. Seyreltmeler nihai DMSO konsantrasyonu ilaç tedavileri ve daha az tha arasında aynı şekilde yapıldığından emin olun n veya bölüm 5 tanımlanan maksimum izin verilebilir DMSO konsantrasyonuna eşittir.
4. 4. bölümdeki belirlenen optimum Tl ⁺ konsantrasyonuna dayalı olarak 5x Tl ⁺ uyarıcı levha hazırlanır.
5. FDSS içine hücre, bileşik ve Tl ⁺ uyarıcı levhalar yerleştirin. 20 ul 2x HBSS konsantrasyon bileşiğin seri deney tamponu 20 ul ihtiva eden hücre plaka tekabül eden oyuklara ilave edilir, böylece bir, iki ekleme protokol ayarlayın. Elektrotları, hücre plakası için bileşikler ekleme ve 20 dakika için inkübe edilir. Arka plan oranı en iyi sinyali tespit etmek için bir bileşik için en uygun inkübasyon süresi birkaç farklı inkübasyon sürelerinde seçilen bir dizi deney ile tespit akan dikkat ediniz. Hücre plakanın her için 5x Tl ⁺ tamponu 10 ul eklemeden önce, en azından 10 saniye için kayıt taban FluoZin-2 floresan. Sonuçların tekrarlanabilirliği kurmak için 3 ayrı günlerde deney tekrarlayın.

_title "> 7. Dama Analizi

1. Deneyler sonraki seride, testin homojenlik ve tekrarlanabilirlik bir "dama" analizi kullanılarak değerlendirilecektir. Şekil 5A'da gösterildiği gibi, tipik olarak, bir kontrol inhibitörü, bir 384-kuyulu plakanın her satır ve sütun her bir başka yanı olarak kaplıdır. Dikkatli bir tahlil içinde gürültü değerlendirilmesi için, inhibitör konsantrasyonunun bir EC ₈₀ kullanılmalıdır. DMSO araç kontrolü olarak diğer oyuklara ilave edilir. Tl ⁺ akı DMSO-ve ilaç ile tedavi edilen hücreler Z asal, kuyu iki nüfus arasında iyi-to-iyi değişkenliğin istatistiksel bir ölçü için bir değer hesaplamak için kullanılır. Z asal formül kullanılarak hesaplanır:
   Z asal = 1 - (3SD _p + 3SD _n) / | demek _p + _n demek |
   SD standart sapma; burada p sınır tanımayan akı ve n, tam akı değerleri inhibe edilir. 3 ayrı günlerde daha büyük ya da 0.5 'e eşit Z' değerleri içeren bir tahlil s kabul ediliryüksek verimli tarama uitable.
2. Levha, boya yük ve her bir kuyu HBSS içinde deney tamponu 20 ul bırakarak, Bölüm 3, yukarıda tarif edildiği gibi BD PureCoat amin kaplı 384 oyuklu plakalar içinde hücreleri yıkayın. Tüm plaka tetrasiklin ile uyarılan gerektiğini not edin.
3. Çok kanallı bir pipet kullanarak, bir 384-kuyucuklu polipropilen levha içine pipetle bir bileşik / DMSO plaka edin ul / kuyucuk hedef Kir bölüm 6.5 'de tespit edilen konsantrasyon kanal, ve% 0.1 hacim / hacim DMSO, bilinen bir inhibitörü 80 taşıt, Şekil 5A'da gösterilmektedir. Kadar iyi B24 için çok kanallı pipet ve iyi B2 ve böylece alternatif kullanarak A1 kuyusunda başlayan bilinen inhibitörü ekleyin. DMSO de A24 üzerinde çok fazla B1 kuyusunda başlayan ve bu işlemi tekrarlayın. Plaka son düzen bir dama eşdeğer olması gerekmektedir.
4. Optimal Tl dayalı bir 5x Tl ⁺ uyarıcı levha ⁺ 4. bölümde belirlenen hazırlayın.
5. Hücre, bileşik ve T yükleyinl ⁺ FDSS içine uyarıcı levhalar. 20 ul 2x HBSS konsantrasyon bileşiğin seri deney tamponu 20 ul ihtiva eden hücre plaka tekabül eden oyuklara ilave edilir, böylece bir, iki ekleme protokol ayarlayın. Elektrotları, hücre plakası için bileşikler ekleme ve yukarı oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edilir. Hücre plakanın her için 5x Tl ⁺ tamponu 10 ul eklemeden önce, en azından 10 saniye için kayıt taban FluoZin-2 floresan. Sonuçların tekrarlanabilirliği kurmak için 3 ayrı günlerde deney tekrarlayın.

8. Pilot Ekranı

1. Tahlil gelişiminin son aşamasında, büyük ölçekli, yüksek-throughput ekranında sonunda kullanılacak koşullar altında test performansını değerlendirmek için birkaç bin bileşiklerin bir pilot ekran gerçekleştirin.
2. Her bir kuyudaki HBSS deney tamponu 20 ul bırakarak Plaka, boya yük ve Bölüm 3, yukarıda tarif edildiği gibi BD PureCoat amin kaplı 384 oyuklu plakalar içinde hücreler yıkama).Tüm plağı Kir kanalı ifade uyarmak için tetrasiklin ile gecede kültüre gerektiğini unutmayın.
3. Test edilmesi için yaklaşık 2,000 3,000 yapısal çeşitli bileşikler seçin. Genellikle uygun ve potansiyel olarak iyon kanalı modülatörler için zenginleştirilmiş bilinen faaliyetleri ile bileşikler koleksiyonlar kullanmak daha uygun olur. Böyle bir koleksiyon Spektrumu Koleksiyonu (MicroSource) ve LOPAC toplama (Sigma) içerir. Buna ek olarak, bu pilot ekran ilgi Kir bilinen modülatörleri dahil etmek mantıklıdır. İdeal olarak, bu bileşikler, daha sonra tarif isabet çekme yöntemleri tarafsız bir test izin vermek için bir kör bir şekilde oyuklara ilave edilir. Hedef plakalar MLPCN toplama (kaynak plakaları) arasından seçilen bileşik DMSO içinde uygun bir hacim transfer etmek için bir sıvı Labcyte Echo Tutucu ya da uygun bir araç kullanılarak 384 pim oyuklu polipropilen plakalar (hedef plakaları) içinde bileşikleri hazırlamak test bileşikleri olduğuna dikkat yalnızca sütun 3-22 içinde;Sütun 1, 2, 23 her bir başka yanı ise, 24 Bölüm 7 de olduğu gibi tam olarak tespit Kir inhibe ettiği bilinen bir konsantrasyonda bir bilinen önleyici ekleyin. Sütun 1, 2, 23, 24 ve kalan kuyularda DMSO konsantrasyonu eşlemeli araç kontrol üretmek için DMSO uygun miktarda ekleyin. Multidrop Kombi kullanırken Assay Buffer ile bütün kuyuları seyreltin. Tipik olarak test bileşikleri 2-kat hedef tarama konsantrasyonunun üzerinde 20 uM, olacaktır.
4. 4. bölümde belirlenen optimum Tl ⁺ konsantrasyonu esas Tl ⁺ uyarıcı levhalar olun.
5. Pilot ekranı yürütün. Pilot tarama vadede plakalar arasında tutarlı bir zamanlama korumak için protokol yürütme adımları stagger özen gösterin.
6. Pilot ekran tamamlandıktan sonra, Z-asal denklemi kullanarak sütun 1, 2, 23, ve 24 dama tahtası kuyu analiz eder. Kontrol popülasyonunun kötü ayrılık kaynağını belirlemek için en az 0.5 Z-asal değerleri gösterir plakaları inceleyin. Hitler b olabilirE bir dizi yöntem kullanılarak seçilebilir. Pilot ekranlar için bu araç kontrol nüfusun ortalama ve standart sapma hesaplamak ve> / = 3 standart sapma aracın kontrollerin ortalama değerleri üreten kuyu dayalı hit almak için yaygındır.
7. Isabet toplama takiben yılında tekrar seçilen hit plakaları 2 setleri yinelenen. Plakaların Bir set tetrasiklin ve diğer tetrasiklin varlığında kararlı Kir hücre hattı içeren yokluğunda Kir kararlı bir hücre içerir. Iki tekrar test plakaları en azından bir pozitif ve yeniden test uninduced plakalar içinde önemli bir etkinlik göstermek için başarısız olarak kabul edilebilir ki ziyaret sayısı doğrulandı. Tespit edildi kaç "gizli" kontrol örneklerinde belirlemek için doğrulanmış bulunanlar listesini inceleyin. Pilot ekran kontrolleri tespit edilmemesi ya da tarama isabet toplama parametrelerinde ek optimizasyon ihtiyacını gösterir.

Sonuçlar

Bir tetrasiklin-indüklenebilir ifade sisteminin kullanımı endojen ve faiz Kir kanalıyla Tl ⁺ akı ayırmak için uygun bir iç kontrol sağlar. Şekil 1, deney farklı türde kullanılan hücre kaplama haritaları bazı örnekler. Uninduced ya da tetrasiklin ile indüklenen hücre içeren kuyu konumları farklı renk ile gösterilmiştir. Şekil 2A analiz gelişimi ve Bileşik elemesi için optimum Tl ⁺ konsantrasyonu belirlemek için kullanılan kaynak plaka h...

Tartışmalar

Veri işlem: Bir kez veri analizi, ortak bir denemede, F ₀ başında başlangıç ​​değerinin her bir kuyunun floresan tepki, F, normalize içerir toplanır. Bu genellikle "statik oran" olarak adlandırılır ve "F / F ^_0" sembolize _edilir. F ₀ İndikatör boya hakim olduğu durumlarda statik oranı operasyonu büyük ölçüde, aydınlatma, sinyal toplama disuniformities gibi birçok faktörler düzeltecektir ve hücre sayı...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
pcDNA5/TO	Invitrogen	V1033-20	Tetrasiklin-indüklenebilir ifade vektörü
T-Rex-HEK293 hücrelerine	Invitrogen	R71007	Tetrasiklin-indüklenebilir hücre hattı
Lipofektamin LTX / Artı Reaktif	Invitrogen	15338100	Transfeksiyon reaktifi
FBS	ATLANTA Biyolojik	S11550	Hücre kültürü ortamı
DMEM	Invitrogen	11965	Hücre kültürü ortamı
Higromisin B	Invitrogen	10687-010	Hücre kültürü ortamı
Blasticidin S	Invitrogen	R210-01	Hücre kültürü ortamı
Penisilin / Streptomisin	Invitrogen	15140	Hücre kültürü ortamı
Ücretsiz HBSS-divalent	Mediatech	21022CV	Hücre yıkama
Tripsin-% 0.25 '	Mediatech	25053CI	Hücre ayrışma
Tetrasiklin-HCI	Sigma	T9823	İndüksiyon reaktifi
Diyalizlenmiş FBS	ATLANTA Biyolojik	S12650	Kaplama medya
FluoZin-2	Invitrogen	F24189	Floresan boya
Pluronic F-127	Invitrogen	P-3000MP	Boya yükleme
HBSS	Invitrogen	14175	Tahlil tampon
HEPES	Invitrogen	15630	Tahlil tampon
NaHCO 3	Sigma	S6297	Tl + uyarıcı tampon
MgSO4	Sigma	M2643	Tl + uyarıcı tampon
CaSO 4 • 2H 2 O	Sigma	C3771	Tl + uyarıcı tampon
D-Glikoz	Sigma	G7528	Tl + uyarıcı tampon
Talyum sülfat	Aldrich	204625	Tl + uyarıcı tampon
HEPES	Sigma	H4034	Tl + uyarıcı tampon
DMSO	Sigma	D4540	Çözücü
Sekiz kanallı elektronik pipet	BIOHIT	E300	384 Hücre kaplama -kuyucuğu
BD PureCoat amin kaplı 384 oyuklu plakalar	BD Biosciences	356719	Assay mikroplaklar
Echo 384-Eh polipropilen mikroplak (384PP) nitelikli	Labcyte	P-05525	Bileşik kaynağı mikroplaklar
384-iyi polipropilen mikroplaklar	Greiner Bio-One	781280
Multidrop Kombi reaktif dağıtıcı	Thermo Scientific	5840300
ELx405 mikroplak yıkayıcı	Biotek	ELx405HT	Otomatik hücre yıkama
Sıvı işleyici Echo	Labcyte	Labcyte Echo 550
Bravo otomatik sıvı taşıma platformu	Agilent Technologies	Standart model
Hamamatsu FDSS 6000	Hamamatsu		Kinetik görüntüleme plaka okuyucu