Akut Graft-Versus-Host Hastalığı Biyomarkörler onaylanması için Yüksek Verimli Sıralı ELISA

Özet

Birden fazla aday biyobelirteçlerin Yüksek throughput doğrulama donma / çözülme çevrimleri en aza indirmek ve değerli plazma numunesi kullanmak için sıralı ELISA ile yapılabilir. Burada, sıralı altı farklı valide plazma biyobelirteçleri için ELISA'lar gerçekleştirmek için nasıl göstermek ^1-3 Graft-versus-host hastalığı (GVHH) ⁴ Aynı plazma örneği üzerinde.

Özet

Tarafsız keşif proteomik stratejiler klinik ortamda tanısal ve prognostik test artırabilir ve kılavuz terapötik girişimlere yardımcı olabilecek yeni biyomarkerler sayıda tanımlamak için bir potansiyele sahiptir. Aday proteinleri çok sayıda tespit edildiğinde, bu tür akut başlangıçlı itibariyle sonlu hacim, olay odaklı ve yeri doldurulamaz olan hasta plazma numuneleri, bir zamanında ve verimli bir şekilde aday biyobelirteçlerin doğrulamak zor olabilir graft-versus- host hastalığı (GVHH), allojeneik hematopoietik kök hücre transplantasyonu (HKHT) bir potansiyel olarak yaşamı tehdit eden bir komplikasyondur.

En aza indirmek için ardışık bir şekilde IL-2Rα ^{5, 6} TNFR1, HGF ^7, IL-8 ^8, elafin ^{2, 3} ve REG3α (aynı zamanda PAP1 olarak da bilinir): Burada altı doğrulanmış GVHD proteinler için ticari olarak mevcut ELISA'lar gerçekleştirme işlemini tarif donma-çözülme döngüleri, Plazma zaman ve plazma kullanımı çözülmüş. Optimum sıralı ELISA performansı kolaylaştırmak için küçük ayarlamalar ile üretici ELISA kitleri ve protokollerini kullanarak Laboratuvarımızda kurulmuş olarak örnek seyreltme faktörü ile belirlenir, bu işlem için biz sırayla ELISA'lar gerçekleştirin. Çıkan plazma biyolojik konsantrasyonları sonra derlenen ve bir hasta kohort içinde önemli bulgular için analiz edilebilir. Bu biyobelirteçlerin sadece araştırma amaçlı anda olsa da, klinik bakım onların içine eklenmesi halen klinik çalışmalarda araştırılmaktadır.

Bu teknik (ler), diğer bir reaktif ile karıştırılmak üzere gerek yoktur örnekleri verilen aynı numune üzerinde birden fazla protein / ilgi sitokinler için ELISA'da gerçekleştirmek için uygulanabilir. ELISA kitleri önceden kaplanmış plakalar, 96-iyi yarı oyuklu plakalar ya da 384-kuyucuklu levhalar ihtiva etmediği takdirde daha ileri örnekleri / reaktiflerin kullanımını en aza indirmek için kullanılabilir.

Giriş

Akut graft-versus-host hastalığı (GVHD), allojeneik hematopoietik kök hücre transplantasyonu (HKHT) sonrasında non-relaps mortalite (UYM) önde gelen nedeni, üç organ sistemi disfonksiyonu ile ölçülür: deri, karaciğer ve gastrointestinal (Gİ) yolu ^4. Akut GVHH genellikle iki ila sekiz hafta nakli sonra oluşur ancak daha sonra ortaya çıkabilir ve genellikle rejimin toksisite, enfeksiyon veya ilaç yan etkileri gibi diğer post-HKHT komplikasyonlar klinik olarak ayirt olduğunu. Sıralı ELISA kullanılarak proteomik stratejileri ve high-throughput doğrulama kullanımı sayesinde, kimin konsantrasyonları GVHH klinik belirtilerin başlangıcında yükselir 6 proteinler belirledik. 4 biyomarker paneli birleştirilir IL-2Rα, TNFR1, HGF ve IL-8, klinik semptomların başlangıcında GVHD teşhis edebilir ve bağımsız GVHH şiddeti ¹ post-HKHT sağkalım tahmin edebilirsiniz. Elafin, sk GVHH için bir biyomarker, bu tür ilaç döküntüleri gibi diğer nedenler GVHH döküntü ve döküntü ayırt edebilir ve nakli sağkalım ^2. tahmin edebilirsiniz. Biz son zamanlarda alt gastrointestinal GVHH bir biyomarker olarak REG3α belirledik, hedef organ en UYM ile ilişkilidir. Plazma REG3α konsantrasyonu güvenilir post-HKHT ishal nedeni olarak GVHD tespit ve teşhis barsak biyopsilerde GVHH histolojik şiddeti ilişkili olabilir. GI GVHH başlangıcında REG3α konsantrasyonları da GVHH tedavisi ve UYM ³ yanıt tahmin edebilirsiniz. Klinik bakım içine bu valide GVHH biyobelirteçlerin birleşme anda klinik çalışmalarda araştırılmaktadır.

Bu deneyler yeri doldurulamaz ve sınırlı büyüklüktedir GVHH başlama zamanında 2000 ve 2010 yılları arasında HKHT alan hastalardan toplanan küçük plazma alikotları yapıldı. Bu örneklerin değerli doğası gereği, biz bir araya geldi geliştirdikaşırı donma-çözülme döngüleri, çözünme zamanı ve plazma kullanımını ortadan kaldırmak için etkili, tekrarlanabilir bir şekilde birden fazla plazma protein konsantrasyonu ölçüm hod. Bu teknik (ler), diğer bir reaktif ile karıştırılmak üzere gerek yoktur örnekleri verilen aynı numune üzerinde birden fazla protein / ilgi sitokinler için ELISA'da gerçekleştirmek için uygulanabilir. ELISA kitleri önceden kaplanmış plakalar, 96-iyi yarı oyuklu plakalar ya da 384-kuyucuklu levhalar ihtiva etmediği takdirde daha ileri örnekleri / reaktiflerin kullanımını en aza indirmek için kullanılabilir. Bu yazıda GVHH biyolojik ölçüm teknolojik yönleri üzerinde duruluyor.

Protokol

1. Deney Gün 0: IL-2Rα, REG3α ve HGF için Yakalama Antikor ile Numune Hazırlama ve ELISA Testi Levha Kaplama

1. Analiz edilecek Plazma kısım örnekler çözülmüş ve plazma üst alt ve lipidler de pıhtıları ayırmak için 10 dakika 12.000 rpm'de bükülmüş, çekilecektir. Seyreltilmemiş plazma 150 ul önceden haritalarına göre manuel pipetleme ile (kaynak plaka) bir 96-gözlü V-alt plaka üzerine her bir numuneden kaplanmış olacaktır. Alikotları parafilm sarılmış ve tüm süreç boyunca 4 ° C'de nemli odasında muhafaza edilecektir; artık daha 72 saat.
2. IL-2Rα ve HGF yakalama antikorlar sulandırılır ve üretici teknik özellikleri ve 50 ul başına seyreltilmiş sonra sızdırmaz ve 4 gecede inkübe edilir ilgili 96-de yüksek bağlayıcı yarım kuyucuğu her iyi ° C içine kaplama olacak olacak Alternatif olarak, çok sayıda plaka 37 ° C sıcaklıkta kurutuldu ve ° C daha sonra kullanılmak üzere, bağlı 4 saklanabilirprotein istikrarı ing.
3. REG3α yakalama antikor sonra mühürlenir ve 4 de bir gece inkübe edilir bir 384-kuyucuklu Nunc Maxi Sorp-plakanın her ° C 'de kaplanmış olacaktır üretici kaplama tamponu ve 25 ul kullanılarak üreticinin protokolüne uygun olarak seyreltilebilir olacaktır

2. Deney 1. Gün: IL-2Rα ELISA (Şekil 1)

1. IL-2Rα test plakasına, yıkanmış TBS içinde Blotto ile bloke ve standart kurulur ve 8 noktalı bir standart eğri üretici protokolüne göre hazırlanır.
2. Bloke etme adımı aşağıdaki plaka yıkandıktan sonra, plazma sulandırılmamış 50 ul kaynak plaka plaka ELISA testi için suret halinde kaplama olup, her bir standart 50 ul kopya halinde kaplıdır. Plaka 300 rpm'de ayarlanmış bir plaka döndürücü üzerine kapatılmış ve oda sıcaklığında 2 saat süreyle inkübe edilmektedir.
3. Plazma IL-2Rα ELISA testi plaka geri istenmeye ve un geri yerleştirilirplazma kaynağı plakası seyreltilir. ELISA imalatçı protokolü (yarı oyuklu plakalar için düzeltilmiş hacim ile) ve 450-570 nm dalga boyuna sahip bir plaka okuyucu kümesi kullanılarak okunacak her çukurun optik yoğunluk göre tamamlandı ve veriler kaydedilir ve analiz edilir.

3. Deney 1. Gün: REG3α ELISA (Şekil 1)

1. Seyreltilmemiş 10 ul plazma bir ayrı v-alt kaynak plakasına transfer edilir. Imalatçı tarafından sağlanan seyreltme tamponu 90 ul bir 1:10 seyreltme kaynak plaka oluşturmak için her bir oyuğa ilave edilir.
2. REG3α ELISA üretici protokolüne göre yapılır (hacimli 384-kuyucuğu için düzeltilmiş) ve her kuyu optik yoğunluğu 450-620 nm ayarlanmış bir plaka okuyucu kullanarak okunacak ve veriler kaydedilir ve analiz edilecektir.

4. Deney 1. Gün: Elafin ve Capture Antikor ile TNFR1 Testi Levha Kaplama

1. Elafin ve TNFR1 yakalama antikorlar sulandırılmış ve dil olacaküretici şartname ve 50 ul başına uted sonra mühürlenir ve Elafin için oda sıcaklığında bir gece inkübe edilir sırasıyla 96-de yüksek bağlayıcı yarı oyuklu plakalar her oyuğuna kaplama, ve 4 ° C sıcaklıkta TNFR1 için olacaktır.

5. Deney Gün 1-2: HGF ELISA (Şekil 1)

1. IL-2Rα ELISA tamamlanması ve deney temin sonra tekrar edilmesi gerekmez, seyreltilmemiş ve 60 ul plazma yeni bir kaynak plaka aktarılır ve daha sonra 1 x PBS içinde% 1 BSA ve 60 ul bir hale getirmek için her bir oyuğa ilave edilir 01:02 seyreltilmiş plazma kaynağı plakası.
2. HGF test plakasına, yıkanmış TBS içinde Blotto ile bloke ve standart kurulur ve 8 noktalı bir standart eğri üretici protokolüne göre hazırlanır.
3. Bloke etme adımı aşağıdaki plaka yıkandıktan sonra, 1:2 seyreltilmiş plazma 50 ul ELISA testi plaka üzerinde kopya halinde kaplama olup, her bir standart 50 ul kopya halinde kaplıdır. Plakası kapatılmış ve300 rpm'de ayarlanmış bir plaka Döndürücü üzerinde gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edildi.
4. 1:2 seyreltilmiş plazma HGF ELISA testi plaka geri istenmeye ve 1:2 seyreltilmiş plazma kaynağı plaka geri yerleştirilir. ELISA imalatçı protokolü (yarı oyuklu plakalar için düzeltilmiş hacim ile) ve 450-570 nm dalga boyuna sahip bir plaka okuyucu kümesi kullanılarak okunacak her çukurun optik yoğunluk göre tamamlandı ve veriler kaydedilir ve analiz edilir.

6. Deney 2. Gün: Elafin ELISA

1. Seyreltilmemiş 10 ul plazma yeni bir kaynak plaka transfer edilir ve daha sonra 1 x PBS içinde% 1 BSA, 190 ul plazma dluted 1:20 200 ul olmak için her bir oyuğa ilave edilir.
2. Elafin ELISA olarak 450-570 nm ayarlanmış bir plaka okuyucu kullanarak okunacaktır üreticisi protokolü (hacimleri ile yarı-kuyucuğu için düzeltilmiş) ve her kuyu optik yoğunluğuna göre yapılır ve veriler kaydedilir ve analiz.

7. Deneme Day 2: ELISA TNFR1

1. PBS içinde% 1 BSA ve 25 ul 1:25 seyreltilmiş 125 ul plazma elde etmek için 1:20 kaynak plaka (şimdi 01:20 plazma ihtiva eden 100 ul) eklenir.
2. TNFR1 ELISA üretici protokole göre tamamlanmış (yarım-kuyucuğu için ayarlanabilir hacimli) ve her kuyu optik yoğunluğu 450-570 nm ayarlanmış bir plaka okuyucu kullanarak okunacak ve verilerin kaydedilmesini ve analiz.

8. Deney 2. Gün: IL-8 ELISA

1. 1:02 seyreltilmiş ve 60 ul plazma yeni bir kaynak plaka aktarılır ve daha sonra IL-8 seyreltici, 180 ul plazma bir 1:06 seyreltilmiş kaynak plakası olmak için her bir oyuğa ilave edilir.
2. IL-8 ELISA üretici protokole göre tamamlanmış (yarım-kuyucuğu için ayarlanabilir hacimli) ve her kuyu optik yoğunluğu 450-570 nm ayarlanmış bir plaka okuyucu kullanarak okunacak ve verilerin kaydedilmesini ve analiz.

Tüm ELISA'lar, unuse tamamlandıktan sonrad stok plazma çözülmüş alikotları içine değiştirilir ve ileride kullanmak için dondurulmuş olacaktır.

Sonuçlar

Biyomarker iş akışı ve zaman çizelgesi, sırasıyla Tablo 1 ve Tablo 2'de ayrıntılı olarak verilmektedir. Bir kere tamamlandı, 6 farklı protein konsantrasyonu hemen plazma 150 ul toplam plazma kullanılarak aynı numune üzerinde ölçülebilir edilmiştir. Test başına nüsha örnekleri Kaplama CV% 10'un altında optimum olmak üzere, iç kalite güvence sağlar. Çok plakalı, yüksek standartları tutarlı optik yoğunlukları üzerinde sıralı ELISA gerçekleştirerek tercih ve ölçümlerin gelişmiş arası plaka güvenilirlik için izin iseniz; standart eğri ODS ELISA performansı tutarsızlık (Şekil 2) için değerlendirmek bakmak plakaları arasındaki mukayese edilebilir. Tetrametilbenzidin kolorimetrik alt tabaka ve yüksek konsantrasyon kullanılarak ODS Development kez laboratuarımızda her bir biyolojik için gözlenen Tablo 3 de listelenmiştir.

tp_upload/4247/4247fig1.jpg "alt =" Şekil 1 "/>
Şekil 1. IL-2Rα, REG3α ve HGF ELISA'lar için iş akışı. Plazma örnekleri, IL-2Rα ELISA plakaları üzerinde kaplanmış edildikten sonra, diğer ELISA'lar için seyreltme kaynak plakaları yapmak için yapıştırılır. HGF ELISA için, plazma IL-8 1:06 seyreltme plaka hazırlamak için yapıştırılır. büyük bir rakam için tıklayınız .

Şekil 2. İlk REG3α GI GVHH biyomarker raporu ³ test 1084 hastaya karşılık REG3α konsantrasyonlarını ölçmek 7 farklı ELISA plakaları standart eğri için optik Yoğunlukları. Plakalar arasındaki Tutarlı ODS plakaları arasında tutarlı protein konsantrasyonu ölçümleri sağlamak. Protein konsantrasyonlarıplazma numuneleri standart eğri optik yoğunlukları numunenin optik yoğunlukları karşılaştırılarak hesaplanmıştır.

Deney Gün 0	1. Örnekler hazırlayın
	2. IL-2Rα, HGF ve REG3α yakalama Ab
Deney 1. Gün	1. IL-2RαELISA
	2. REG3αELISA
	3. HGF ELISA (örnek sayesinde kaplama)
	4. Elafin ve TNFR yakalama Ab
Deney 2. Gün	1. HGF ELISA tamamlama
	2. Elafin ELISA
	3. TNFR1 ELISA
	4. IL-8 ELISA
	5. Kullanılmayan dondurulabilirplazma

Tablo 1. GVHH Biyomarker İş Akışına Genel Bakış

Gün 0		Numune hazırlama ve geceleme yakalama vücut inkübasyon
ELISA		IL-2Rα	REG3α	HGF	Elafin	TNFR1	IL-8
Süresi (saat)	0.0	Bloke etme
	1.0	Kaplama, Örnekleri
	3.0	Algılama Ab; plazma numuneleri Reclaim	Engelleme; Prepare Örnekleri (1:10 seyreltme)
	4.0		Kaplama Örnekleri (1:10)
	5.0	Streptavidin-HRP	Algılama Ab
	5.5	TMB	Streptavidin-HRP
	6	Plaka Okuma	TMB	Engelleme; Prepare örnekleri (1:2 seyreltme)
	6.5		Plaka Okuma
	7			Kaplama Örnekleri (1:2)	Ab (gecelik inkübasyon) Yakalama	Ab (gecelik inkübasyon) Yakalama
2. Gün
Süresi (saat)	0.0			Plazma, Algılama Ab Reclaim	Engelleme; Prepare örnekleri (1:20)
	1.0				Örnek kaplama (1:2)	Engelleme; 01:20 örneklerin ilave seyreltme 1:25 seyreltme
	2.0			HRP		Örnek kaplama (1:25)
	2.5			TMB
	3.0			Plaka Okuma	Algılama Ab
	3.5						Örnekleri (1:6 seyreltme) hazırlayın
	4.0					Algılama Ab	Örnek kaplama (1:6)
	5.0				HRP
	5.5				TMB
	6				Plaka Okuma	HRP	Algılama Ab
						TMB
	7					Plaka Okuma	TMB
	7.5						Plaka okuma
Tamamlanmasından sonra,		Alikotları içine kaynak plazma değiştirin ve daha sonra kullanmak için dondurma

Tablo 2. ELISA'lar gerçekleştirmek için zaman çizelgesi.

	Plazma Seyreltme faktörü	Yüksek Standart Konsantrasyon	Yüzey Geliştirme Süresi (dk)	Yüksek OD	Eğri
IL-2Rα	01:01	2,000 pg / ml	5	1	Doğrusal
HGF	01:02	4.000 pg / ml	22	2.1	4-parametreli
IL-8	01:06	200 pg / ml	12	2.7	4-parametreli
REG3α	01:10	100 ng / ml	12	1.7	4-parametreli
Elafin	01:20	2,000 pg / ml	20	1.9	4-parametreli
TNFR1	01:25	800 pg / ml	8	2.7	Doğrusal

6 GVHH Biyobelirteçler için Tablo 3. ELISA Detayları.

Tartışmalar

Burada sunulan sıralı ELISA yöntemi örneğin fare ^9,10 elde nadir hastalıklar veya plazma örnekleri ile insan denekler örnekleri de yeri doldurulamaz edinme ve / veya zor olabilir plazma küçük hacimlerde birden fazla plazma proteinlerinin ölçümü sağlar. Sıralı ELISA'lar genellikle gerektiren ELISA'lar ile artan plazma seyreltme faktörü amacıyla yapılan plazma seyreltilmiş ≥ genellikle istenirse bu yapılabilir, ancak iadesi olmaya gerek yok 01:10. Vardır Ardışık ELISA gerçekleştirmek için yetenek plazma diğer reaktifler ile karıştırıldığında ya da farklı olan seyreltme tampon plazma için gerekli olan ELISA kitleri / protokoller ile sınırlıdır, bu yeniden kullanımı bir örnek dolayı bir uyumsuz kaygılar ablility engellemektedir tampon / reaktif Belirli bir testin performansını etkileyecektir. Dikkatli planlama ile, 10 ya da daha fazla aynı ELISA'lar plazma örneği üzerinde gerçekleştirilebilir.

ent "> Bireysel laboratuarlarda denek gelen örneklerde ilgi protein beklenen plazma konsantrasyonlarına dayalı yorumlanabilir sonuçlar elde etmek için plazma dilüsyonları ayarlamanız gerekebilir. laboratuar ekipmanları farklılıklar inkübasyon ve kolorimetrik geliştirme optimize etmek için ihtiyaç neden olabilir kez, yıkar sayısı ve / veya yıkama herhangi bir ELISA optimize etmek amacıyla kez ıslatın.

High-throughput kapasitesi ve doğruluğu artırmak için ve maliyet-etkin bir şekilde analizler yaparak, 384 iyi plakaları üzerinde analiz ve istifleme ünitesi ile otomatik plaka yıkayıcı yeteneğine sahip bir robot sıvı taşıma platform kullanımı tavsiye edilir. Bu cihaz birden fazla kullanıcı tarafından yapılan analizlerin doğruluğunu ve hassasiyetini artırmak, ve inter-ve intra-analiz varyasyonu azaltmak için analiz tutarlılığı sağlamaya yardımcı olabilir.

) 1 çoğu: Biz iki nedenden dolayı mevcut multipleks platformlar üzerinde sıralı ELISAroman proteinler için antikor çiftleri kolayca boncuk veya diğer malzemelerin üzerine konjuge yanı sıra, zaman alıcı ve pahalı olamaz; 2) Bireysel ELISA deneyleri çapraz reaktivite ¹¹ yokluğu sekonder multipleks mikroarray veya boncuklar, daha kesindir. Güvenilir bir yöntem çoğaltılmış, boncuk esaslı mikrodizileri gerçekleştirmek için kurulmuştur, bu ardışık ELISA işlemi yerine mümkün olabilir, fakat boncuklar ve / eşlenik antikorların yeteneğini ya da olması istenen proteinlerin sayısı ile sınırlıdır edilebilir analiz.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
İnsan IL-2 Duoset R alfa	R & D Systems	DY223
İnsan HGF Duoset	R & D Systems	DY294
İnsan IL-8 OptEIA TAKIMI II	Becton Dickinson	550999
Ab-Match MONTAJ İnsan PAP1 (REG3α) Kit	MBL Uluslararası	5323
Ab-Match UNIVERSAL Takımı	MBL Uluslararası	5310
İnsan sTNFRI/TNFRSF1A Duoset	R & D Systems	DY225
İnsan Trappin-2/Elafin Duoset	Ar-Ge Sykaynaklanıyor	DY1747
96-polistiren konik alt plakalar	Thermo Scientific	249570	Plazma kaynağı plakaları için kullanılır
Costar yarım sıra yüksek bağlayıcı 96 oyuklu plakalar	Corning	3690	IL-2Rα, HGF, TNFR1 ve elafin ELISA'lar için
Nunc 384-iyi MaxiSorp plakaları	Nunc	464718	REG3α Elisa için
HyClone Fosfat, 1x Tamponlu Salin	Thermo Scientific	SH30256.02
Bovine Serum Albumin, Fraksiyon V, Tedavi Isı Şoku	Fisher Scientific	BP1600-100
TBS içinde Engelleyicisi Blotto	Thermo Scientific	37530	IL-2Rα HGF ve TNFR1 ELISA'lar için engelleme ajan
DulbeccoTuzlu Fosfat-Buffered	Gibco	21600-069	IL-2Rα, HGF, Elafin ve TNFR1 ELISA'lar için tampon yıkayın
TMB Peroksit Susbtrate	Kirkegaard ve Perry Laboratuvarları	50-76-00
Tween 20	Acros Organics	233362500	IL-2Rα, HGF, Elafin ve TNFR1 ELISA'lar için tampon yıkayın
Sülfürik Asit	Sigma-Aldrich	84720	(2N Seyreltilmiş) stop çözüm