Farelerde Tekrarlayan Herpetik Stromal Keratit, İnsan HSK Eğitim İçin Bir Model

Özet

Herpetik kornea hastalığı çalışmaların çoğu birincil enfeksiyon modeli kullanın. Ancak, HSV-1 ile birincil infeksiyon genellikle insan hastalığına yol açmaz. Burada daha yakından insan hastalığı taklit herpetik kornea hastalığı, tekrarlayan modeli açıklamak.

Özet

Herpetik göz hastalığı, adlandırdığı herpetik stromal keratit (HSK), korneanın bir potansiyel olarak kör edici enfeksiyonu olduğunu tedavisi için 300.000 'den fazla klinik ziyaretleri her yıl sonuçları. Klinik hastalığı olanlarda 1 ila 2 oranında enfekte kornea görme kaybı yaşayacaksınız. Bu olguların büyük çoğunluğu herpes latent enfeksiyonun reaktivasyonu sonucu akut hastalık nedeniyle değil ben virüsü yazın ve simpleks. İlginç bir şekilde, akut enfeksiyon, genellikle bu hastalık incelemek için kullanılan bir modeldir. Ancak, HSK tekrarlayan modeli klinik hastalık sırasında ortaya ne daha yansıtıcı olacağını hissettim. HSK için tekrarlayan hayvan modellerinde tavşan ve fareler hem istihdam var. Tavşanların avantajı, ikinci gecikme reaktivasyon, bilinen herhangi bir uyarıcı yokluğunun ortaya çıkmasıdır. O tavşan modelinde immün yok çünkü birçok immünolojik faktörler tekrarlayan HSK oynadığı rol keşfetmek için zor olduğunu söylediFarenin sahip olduğu fizyolojik ve genetik kaynaklar. Reaktivasyonu UV-B ışığa maruz kalma ile tetiklenen çünkü biz orada pek çok kaynak mevcuttur olmanın avantajına sahiptir ve aynı zamanda reaktivasyonu ne zaman ortaya çıkacağını biliyoruz çünkü tekrarlayan HSK için fare modeli kullanmayı seçti. Bugüne kadar, bu model bu hastalık için önemli olan çeşitli immünolojik faktörlerin belirlenmesi amacıyla kullananlar laboratuarlar sağladı. Bu da bize tedavi ve aşı etkinliği hem sınamak için izin verdi.

Protokol

Hayvan Bakımı Not: anti-enflamatuar ve böylece örnek kılacak şekilde Analjezikler Bu modelde kullanılan değildir.

1. Virüs hazırlanması

1. 3-4 gün için enfeksiyon, 0.01 çokluğu bir başlangıç ​​dilüsyonu (T-150 şişesi içinde, yaklaşık 5 x 10 ⁵ plak oluşturan birim) kullanılarak Vero hücreleri (% 80 confluent) üzerinde, HSV-1 büyümek bütün hücre kadar yuvarlanır-up ve kolay bir şişeye isabet dışarı çıkarılması edilir.
2. 4 steril santrifüj tüplerine ve Sorvall Legend RT santrifüj ortamı çıkarın ° C ve 15 dakika için 3.500 rpm. Ortam toplam 5 ml her biri 50 ml tüp supernatant (1.3) tekrar süspansiyon büyük pelet çıkarıldıktan sonra. İki 30 sn patlamaları 1 dakika sonikasyon.
3. 4, bir Beckman ° C J2-21 santrifüjü, 1 saat boyunca, süpernatan ve 9000 rpm'de 50 ml steril Oak Ridge, tüpler ve santrifüj içine koymak çıkarın. Bu küçük bir viral pelet üretmektir. Süpernatantı atın.
4. 1.2 zekâ gelen sonikasyon birleştirinh 1.3 pelet ve 45 saniye için tekrar sonikasyon. 4, 5 dakika için 1500 rpm'de Sorvall RT Legend, Santrifüj ° C. Süpernatant kaydedin. Bu, -70 bölünüp depolanan virüs stoku ° C. teşkil
5. Vero hücreleri üzerinde titresi virüs. Üzerinden 10 ^-8 seyreltme (her 10 kat seyreltme olmak üzere) 2 ayrı seyreltme kümelerinden 2x Ben genelde plakalı 10 ^0. Virüs titrasyonu, 12-kuyu steril plakalar üzerinde gerçekleştirilir.

2. Fare Enfeksiyon

1. Anestetik cocktail/20 g fare vücut ağırlığı için 0.1 ml ile her bir fare enjekte edilir (Ketamin, 60 mg / kg + Xylazine 5 mg / HBSS içinde seyreltilmiş kg). Bunu uygun dozlarda kullanılan ve bu ilacın etkileri çok kısa ömürlü vardır anestezinin en güvenli araçlardan biridir çünkü bu kokteyli kullanılır.
2. Fareler anestezi olduğunda kornea delikli olmadığından emin olmak için bir diseksiyon mikroskobu kullanarak bir 30 gauge iğne ile sağ gözün kornea çizmeyin.
3. Her fare receBirincil enfeksiyonu esnasında hasara karşı korneanın korunması için, toplanmış insan serumu (1:800 arasında en az% 50 viral nötralizasyon için etkili bir doz ile anti-HSV tepkime Sigma, Temecula, California) 1 ml arasında bir intraperitoneal IVED.
4. Kulak klipleri ile veya kulak yumruk sayısı fareler.
5. Tüm fareler sayılı edildikten sonra, bir 20 ul pipet kullanılarak, 10 ⁶ PFU (5 ul) ile her bir göz enfekte. Biz sadece bir göz ve genellikle sağ göz bulaştırmak. Biz de onlar anestezi iken nemli tutmak için diğer gözlerine HBSS 5 ul yerleştirin. 5 ul prosedürler az 10 dakika içinde gerçekleştirilir ve hayvanlara göre anestetik ile dozlanan çünkü gözlerin hidrasyon korumak için yeterlidir. Enfeksiyon Vero medya 1 ml sulu bir steril pamuk aplikatör ile farelerde 3 gün sonrası enfeksiyon sürüntü ile doğrulanır. Sonra, 100 ul 48 oyuklu plakalar içinde yetiştirilen Vero hücrelerine ilave edilir. Bu plakalar sitopatik etkilerini günlük izliyor (CPE).

3. Gecikme gelen Mice reaktivasyonu

1. Fare primer enfeksiyonu takiben en az 5 hafta anestezi uygulanmıştır. Biz bir yıl aşağıdaki birincil enfeksiyona fareler kadar yeniden ve yanıt olarak anlamlı farklılıklar gözlenmiştir bulunmadığına dikkat edilmelidir.
2. Bir kez anestezi sadece tek bir göz UV-B ışık maruz kaldığı bu gibi 302 nm bir dalga boyunda bir tepe UV-B yayar TM20 Chromato-Vu transilluminator, yerleştirilir. Her bir fare 250 UV-B ışık mJ cm ² maruz kalmaktadır.
3. Aktifleştirdiğinizde ilk 1-7 sonrası UV-B ışınlaması gün sonra 0. günde Vero medya 1 ml yerleştirilir (kendiliğinden shedders kontrol etmek için UV-B maruz kalmadan önce) ve bir steril pamuklu aplikatör ile gözler swabbing ile tespit edilir. 2.5 de tarif edildiği gibi bez malzeme) değerlendirilir. Bulaşıcı virüsün sahip olan çubuklar için, virüs miktarı 12 oyuklu plakalar kullanılarak, standart bir plak deneyi ile tittered edilir.

ove_title "> 4. Klinik Değerlendirme

1. Fare bir binoküler mikroskop kullanarak maskeli bir gözlemci tarafından klinik göz hastalığı için değerlendirilir.
2. Korneal matlık 0 net stromada belirten 0 4 bir ölçekte, puan, 1 hafif stromal opasite gösteren, 2 ayırt iris özellikleri ile orta opaklık gösterir, 3 gösteren öğrenci marjları ve 4 hariç tanımlanan iris ayrıntı kaybı ile yoğun opaklık gösterir posterior manzaralı toplam opaklık.
3. Neovaskülarizasyonunda 4 eşit parçaya bölünür kornea bölünmesi ve bu kadranın her birinde vaskülarizasyonu ölçüde belirleyerek 1 ila 8 arasında bir ölçekte derecelendirilmiştir.
4. Blefarit şöyle ölçülür: 0, hiçbir lezyonlar; 1, minimal kapak şişme; 2, orta derecede şişkinlik ve huysuz çapaklanma, 3, şiddetli şişlik, orta perioküler saç dökülmesi ve cilt lezyonları ve 4, gözler kabuklu kapalı şiddetli şişlik, Şiddetli perioküler saç dökülmesi ve cilt lezyonları.
5. Ensefalit inclu Kanıtded, geri karıştırdı saç ve belirgin nörolojik anormallikler hunched. Onlar ensefalit önemli belirtileri görüntülediğinizde Fare ötenazi vardır.

5. Temsilcisi Sonuçlar

Yukarıda tarif edilen tekrarlayan model birinci Shimeld, et al tarafından yayınlanmıştır. ^1-3. Onlar test ve laboratuvar yıl ^4-15 boyunca birçok el yazmaları yayımlamak için bu modelin değiştirilmiş bir sürümü kullanıyor. Modeli rolü tanımlamak için kullanılmış olduğunu yineleyen HSV-1 hastalığı ¹⁰ sitokin interferon-γ çalış. Şekil 3'te gösterildiği gibi, daha IFNγ kötü gösterilir kornea hastalığı eksik fareler vahşi-tip fareler ¹⁴ mi. Aynı zamanda birçok farklı aşı ^6,10,11 oluşturur ve tedavi değeri tanımlamak için başarıyla kullanılmıştır. Bir olguda test aşı profilaktik iyi çalıştı ama ⁶ terapötik açıdan etkili olduğu ispat etmedi unutmayın. Bununla birlikte,Bir çoğaltma-beceriksiz viral aşı test edildiğinde, bu profilaktik olarak sadece etkili değil, ama terapötik zamanda ^10,11 çok etkili oldu, referans 10 Şekil 5'e bakınız. Daha yakın bir zamanda cinsiyet farklılıkları tekrarlayan HSK geçiren farelerde tespit edilebilmesine edildi olmadığını belirlemek için bu modeli kullanmışlardır. Şekil 1 görüldüğü gibi, erkek C57BL / 6 fareler dişi C57BL / 6 fareler mutlaka önemli ölçüde daha az korneal opasite gösterilecek. Aynı şekilde, korneal neovaskülarizasyon değerlendirildiğinde, erkek farelerin dişi farelerde (Şekil 2) yaptım daha korneada daha az yeni damar büyüme göstermiştir. Şu anda bu fenotipin farelerin diğer suşları benzer analizler yaparak belirli gerginlik olup olmadığı test edilir. Ayrıca, fark testosteron eksikliği ya da östrojen varlığı yüzünden olup olmadığını belirler.

Şekil 1. UV-B ile indüklenen reaktivasyon aşağıdaki erkek ve dişi C57BL / 6 fare suşu içinde kornea hastalığı. Latent enfekte farelerde UV-B radyasyon ve fareler 35 gün boyunca korneal opasite için izlenmiştir ile etkinleştirmek için oluşturuldu. Aşağıdaki gibi bu çalışmalar için kullanılan fareler numaraları vardı: erkek, n = 15; kadın, n = 15. Sonuçlar ortalama ± SEM göstermektedir. * Anlamlı olarak daha fazla virüs kaynaklı hastalık 14-35 gün (P = 0,001 ila 0,01) için dişi C57BL / 6 fareleri içinde yapıldı.

Şekil 2. UV-B ile indüklenen reaktivasyon aşağıdaki erkek ve dişi C57BL / 6 fare suşu içinde kornea hastalığı. Latent enfekte farelerde UV-B radyasyon ve fareler 35 gün boyunca korneal neovaskülarizasyon için izlenmiştir ile etkinleştirmek için oluşturuldu. Erkeklerde, n: bu çalışmalar için kullanılan farelerin sayısı aşağıdaki gibidir= 15; kadın, n = 15. Sonuçlar ortalama ± SEM göstermektedir. * Anlamlı olarak daha fazla virüs kaynaklı hastalık 14-28 gün (P = 0,001 ila 0,01) için dişi C57BL / 6 fareleri içinde yapıldı.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Herpetik stromal keratit tekrarlayan modeli (HSK) burada açıklanan araştırmacı insan hastalık sırasında gözlenen edildiği şey ile daha tutarlı bir model insan HSK çalışma sağlar. Böylece, model güçlü hastalığı primer hastalık sırasında uyarılan tarafından zaten bir bağışıklık sistemi bağlamında oluşur vardır. Bu fareler zaten HSV-1 için bir immün yanıt olduğu için, bu bağışıklık yanıtını yeniden faktörler başlangıçta oluşturulan bu olanlardan büyük olasılıkla fa...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Sigma	D5796
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S11150
Human Serum	Sigma	S7023
L-Glutamine	Cellgro	25-005-C1
Pen/ Strep	Sigma	P4333
Fungizone	Invitrogen	15290018
Centrifuge	Sorvall	Legend RT
Centrifuge	Beckman	52-21
Transilluminatior	UVP	95-0452-02
Sonicatior	Branson	Sonifier 450
Oak Ridge Tubes	Nalgene	Z 720410
Flasks- 7150	Corning	430823
Plates- 12 well	Corning	CLS 3513
Plates- 48 well	Corning	CLS 3548
Sterile Conical Tubes- 30 ml	Corning	CLS 430828
Sterile Cotton-tipped Applicators	Fisher	23-400-125
30G Needles	Becton-Dickinson	305106
25G Needles	BD	305122
10 ml Syringe	BD	309602
10 ml Syringe	BD	309604