Erişkin Fare yılında Motor Ünite tarafından üretilen bir Lomber Motonöron ve Kuvvet Eşzamanlı intrasellüler Kaydı<em&gt; In vivo</em

Marin Manuel; C.J. Heckman

doi:10.3791/4312

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

Erratum Notice
Özet
Özet
Protokol
Sonuçlar
Tartışmalar
Açıklamalar
Teşekkürler
Malzemeler
Referanslar
Erratum
Yeniden Basımlar ve İzinler

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Özet

Bu yeni yöntem, tek bir yetişkin fare motonöron ve kas lifleri tarafından üretilen kuvvet ölçümü aynı anda hücre içi kaydını verir. Normal ve genetik olarak değiştirilmiş hayvanların motor birimlerin elektrik ve mekanik özelliklerinin kombine soruşturma nöromüsküler sistemin çalışması için bir atılımdır.

Özet

Bu (1) kolaylıkla tespit hedeflerin (kas lifleri) sahip olan ve bu nedenle bir çok iyi bilinen bir fonksiyonu olan eşsiz özelliklerini ile merkezi sinir sisteminin bir nöron, çünkü belkemiği motor nöron uzun sinir fonksiyonu çalışmak için iyi bir model sistem olmuştur (kas kasılması kontrol etmek için), (2) pek çok spinal ve azalan ağların yakınsak hedef ", nihai ortak bir yoldan" dolayısıyla adı olan, ve (3) bu mümkün keskin hücre içi elektrotlar ile nüfuz yapan büyük bir soma sahip olan . Dahası, in vivo çalışma zaman, aynı anda motor nöronlar ve kas hedefler geliştirilmiştir güç elektrik faaliyeti kaydetmek mümkündür. In vivo olarak motonöronlar hücre içi kayıt yapılması bu nedenle aynı zamanda, çalışma için mümkün olan benzersiz bir konumda deneye koymak, "motor ünitesi" (motonöron, kendi akson ismi verilen bütün bölümlerinde veo ¹ innerve kas lifleri): motonöron bası girişleri, motor nöron ve elektrofizyolojik özellikleri ve motonöronlar fizyolojik fonksiyonu bu özelliklerin etkisi, onun motor ünitesi tarafından üretilen kuvvet yani. Hazırlık felç olamaz ve böylece hücre içi kayıt için mekanik stabilite azalır Ancak, bu yaklaşım çok zordur. Bu nedenle, bu tür deneyler sadece kedilerde ve sıçanlarda elde edilmiştir. Normal ve genetiği değiştirilmiş farelerde benzer deneyler yapmak mümkün olsaydı Ancak, spinal motor sistemlerinin çalışma müthiş bir sıçrama yapabilir.

Teknik nedenlerden dolayı, farelerde spinal şebekelerin çalışma çoğunlukla motonöronlar ve spinal ağlar olgunlaşmamış vitro hazırlıkları, neonatal sınırlı olmuştur, motonöronlar hedefleri ayrılmış ve dilimleri, mo okudu zaman vardırtoneurons girişleri çoğu ayrılmıştır. Yakın zamana kadar, sadece birkaç grup bize erişkin farelerde in vivo ^5,6 motonöronlar çok kararlı kayıtları elde etmek için izin veren yeni bir hazırlık yayınlanan ekibimize dahil, in vivo ^2-4 motonöronlar intrasellüler kayıtları gerçekleştirmek için başarmıştı. Bununla birlikte, bu kayıtların örn. bu motonöronlar kuvveti çıkış kayıt için ihtimali olmadan, felç hayvanlarda elde edilmiştir. Burada biz motonöronlar ve elektrofizyolojik özellikleri ve bunların motor ünitesi tarafından geliştirilen kuvvet eş zamanlı kayıtları elde etmek mümkün edildiği bu orijinal hazırlığı bir uzantısı sunmak. Bize kuvvet profiline göre motonöronlar farklı türleri belirlemek ve böylece onların işlevini açığa olanak sağladığından, önemli bir başarıdır. Genetik modeller spinal segmental devresi ^7-9 rahatsız, veya insan disea reproducting ile birleştiğindese ^10,11, bu tekniğin spinal motor sisteminin çalışması için gerekli bir araç olmasını bekliyoruz.

Protokol

1. Adım

Pre-anestezik ilaçlar: anestezi indüksiyonundan önce 10-15 dk sırasıyla salivasyon ve ödem, önlemek için atropin (0.20 mg / kg) ve methylprenidsolone (0.05 mg) alt-kutanöz enjekte.

2. Adım İki

Anestezinin indüksiyonu: sodyum pentobarbital (70 mg / kg) ya da ketamin / ksilazin (10 mg / kg, sırasıyla 100 mg / kg ile) intra-peritoneal oluşan bir karışım enjekte edilir. Fare hiçbir ayak tutam refleksi elde edilebilir kadar küçük gidelim. Anestezi çok açık görünüyorsa, dozun 1/4 ile takviyesi.

3. Üçüncü Adım

* Not: Bu ameliyatı bir terminal işlemdir.

Anestezi cerrahi bir düzlem ulaşıldığında, bir yüzükoyun pozisyonda yükseltilmiş sıcak bir battaniye üzerinde fare aktarın.

100 ml / dakikalık bir akış saf O ₂ sunan bir maske ile fare burun örtün.
, bir saç kesme makinesi kullanılarak, kuyruk tabanına ense gelen dorsal bölgedeki tıraş.
Ayrıca sağ bacak Tıraş.
Sırtüstü pozisyonda fare çevirin ama yerde oksijen maskesi bırakmak ilgileneceğim.

4. Dördüncü Adım

Bacaklarda çevresinde dolanmıştı ve çalışma yüzeyinin dört köşesine bağlanmış sütürler ile yerde fare sabitleyin.

5. Adım Beş

Fare çekirdek sıcaklığı izlemek için bir sıcaklık probu yerleştirin. 36 ° C ve 38 ° C arasında çekirdek sıcaklığı korumak için ısıtma battaniye / lamba gücünü ayarlayın

6. Trakeotomi ve Yapay Havalandırma

Künt makas kullanarak, trakea üzerinde bir kesim yapmak ve her iki tarafta uzakta deri çekin.
Künt forseps kullanarak, trakea kapsayan iki ince kasları (sternohyoid) açığa gibi tükürük bezi böylece parçalıyorlar.
Künt forseps kullanarak, iki musc ayırmaktrakea ortaya çıkarmak için onların medial ayrılması boyunca les.
Bir Dumont 7 forseps kullanarak, trakea altında 4.0 ipek sütür iki uzunluğu kaydırın.
Iki kıkırdak halkaları arasında trakea bir çapraz kesim olun ama bölüm trakea tamamen özen.
Trakea aşağı trakeal tüp takın, sonra üzerine sütür bağlayarak yerleştirme boşluğunun her iki taraftan sabitleyin. Endotrakeal tüp, bir fare vantilatör (SAR-830/AP, CWE Inc) ve bir capnograph (μcapstar, CWE Inc) ile bağlanır. Ventilatör saf O ₂ bir kaynak, bir uyum çantası aracılığıyla bağlanır. Farenin yapay havalandırma mücadele değildir ve end-tidal pCO ₂ 4 ile% 5 arasında istikrarlı şekilde ventilatör (solunum hızı 100-150 bpm, end-tidal hacmi 170-310 ul) parametrelerini ayarlayın.

7. İntravenöz Hatlarının Yerleşimi

Künt diseksiyon teknikleri kullanarak, juguler maruzBoyun bir tarafında damar. Bu seviyede, juguler ven iki büyük sandıklar, anterior ve posterior yüz damarlar böler.
Iki kez, bir bu sandıklar her biri için belirlenen aşağıdaki adımları uygulayın:
1. Dumont 4 veya 5 forseps kullanarak, çevresindeki katılgandoku gelen ven dikkatle ayırın.
2. Dumont 7 forseps kullanarak, ven altında 6,0 ipek dikişlerle iki uzunluğu kaydırın. venin uzunluğu boyunca mümkün olduğunca onları ayırmak.
3. Ven (kalbe yakın taraf) proksimal tarafında küçük damar klipsi yerleştirin ve ven distal tarafına bağla.
4. Çok ince iris makası kullanarak, tamamen bölümüne ven büyük özen değil alarak, damar küçük bir transvers kesi yapmak.
5. Kadar gemi klibe, açılış önceden doldurulmuş 1FR kateter (premicath, VYGON) takın.
6. Bir Dumont 4 forseps birlikte ven ve kateter şekilde tutarak, damar klibi kaldırmak, daha sonra kateter birkaç mor itinvene e milimetre.
7. Ekleme bölgesinin her iki tarafında hem dikiş ile bağlayarak kateter elde edin.
Kateterlerin biri anestezikler gerektiğinde (genellikle her 10-30 dk.) Ek doz enjekte etmek için şırınga veya bir şırınga pompası bağlandığında IV doz ya 6 mg / sodyum pentobarbital veya 1250 +40 mg / kg / ketamin / xylazine ¹² dk kg. Diğer kateter _NaHCO3 (% 1) ve plasmion (% 14) ihtiva eden bir% 4 glikoz çözeltisi yavaş yavaş damardan infüzyon (50 ul / saat) bir şırınga pompasına bağlanır.

8. İğne ve Sütür ile Boyun Cilt kapatın ve Yüzüstü Pozisyon Fare dön

9. Hind-bacak kas ve Sinirler diseksiyonu

Makas kullanarak, Aşil tendonu için uyluğun üst bir kesi yapmak. Kan damarlarının zarar vermemeye dikkat ederek, altta yatan kasları gelen cilt ayırın. Gerektiği gibi Dağlamak.
uyluk aşağı çalışan beyaz bir çizgi olarak görünür biseps femoris, ön kenar tanımlayın. Makas kullanarak, dikkatli diz hattı boyunca kalça kemiğinin tüm yol açabilir. Kasları ayırın. Siyatik sinir artık biceps femoris altında görülebilir.
Dikkatle Biceps Femoris teşrih. Kanamayı önlemek için gerektiği gibi / ligatür Dağlamak. Biceps Femoris tamamen kaldırılmış ya da sadece siyatik sinir ve triseps kaslarından hazırlanan doku açığa recline olabilir.
Sural sinir üzerinden teşrih.
8/0 ipek iplik kullanarak, Ortak peroneal sinirin distalinde bağlayıp düğüm distalinde kesti. Mümkün olduğunca kalça olduğunca yakın, sinir tüm yol kadar teşrih.
Ortak peroneal ve sural sinirler arasındaki Tibial sinir tanımlayın. Tibial sinir farklı dalları arasında (bundan Tibial sinir olarak anılacaktır) derin gitmek dallarından Triseps surae innerve dalları tanımlamak.
8/0 ipek kullanmadalları Triseps surae innerve korurken iplik, Tibial sinir bütün dalları birbirine bağla. Düğüm için distale Tibial sinir kesin ve mümkün olduğu kadar sinir kadar teşrih.
Bir sonraki adıma geçmeden ise kurutma önlemek için tuzlu batırılmış bir gazlı bez ile tüm bacak örtün.

10. Laminektomi

Makas kullanarak, omurga boyunca bir kesi yapmak. Altta yatan kasları gelen cilt ayırın.
Subkutan kasları ayırmak için vertebra her iki tarafında iki insizyon yapın. Sonra her iki tarafta omurga tarafında takın Her bir kas tendon kesti.
Künt forseps ve ince bir küret kullanarak, açıkça her omur tanımlamak için spinöz süreçleri etrafında omurunun arka tarafındaki kas kalanını çıkarın.
Vertebra T13 ve L1 tanımlayın. T13 kaburga ekli olması son vertebra olduğunu. Vertebral kolon wkötü Cunningham Omurilik vertebral kelepçeleri (Co Stoelting) kullanılarak immobilize edilebilir. T13 ve L1 her tarafında spinal kelepçeler yerleştirin. Omurilik sıkıştırmak için değil dikkatli olun, ama boylamasına eksenine gerginlik biraz koydu. Omurga de forseps ile hafifçe bastırarak güvenli olup olmadığını kontrol edin.
Ince rongeurs kullanarak, böylelikle omurilik açığa T13 ve L1 sonra üzerinde lamina spinal süreçleri kaldırmak.
Kuruma önlemek için tuzlu batırılmış pamuk veya spongel küçük bit ile maruz omurilik örtün.
Omuriliği saran sırt üstünde bir ölçüye plastik banyo, yerleştirin. 4/0 ipek iplik kullanılarak yerinde banyo sabitleyin. Banyo Kwik-Cast mastik (TEFE) ile mühürleme suretiyle su geçirmez olduğundan emin olun.
Kwik-Cast kuruduktan sonra, omurilik kapsayan pamuk çıkarın ve mineral yağı ile banyo doldurmak.
Dumont 5 forseps ve çok ince iris makası kullanarak, yavaşça dura arkadaşı çekinr omuriliği saran, ve her iki yönde de, mümkün olduğu kadar açın. Omuriliğin her iki tarafında dura katlayın.
Bu vertebral kelepçe tarafından askıya tutmak gibi fare yüzden yalan olduğu ortaya platformu alçaltın.
Hayvanın geri bölge desteklemek için sakral bölgenin bir spinöz sıkıştırmak için başka bir vertebral kelepçe kullanır.
Üçüncü bir kelepçe sağ bacak ve ayak bileğinizi immobilize etmek için kullanılır, diz 90 ° fleksiyonda.

11. Aşil Tendon Diseksiyon

Ekstremite diz ve ayak bileği 90 ° bükülmüş olan bacak alanı kapsayan gazlı bez çıkarın ve çevre dokulara serbest Aşil tendonu teşrih. Olduğu kadar aynı zamanda bunları çevreleyen dokudan mümkün Triseps surae olarak teşrih.
Kalkaneus yakın Plantaris kas tendon kesin, ardından tamamen tendon kaldırmak için tekrar kesti.
Bir dişli iğne kullanarak, inci ile 6/0 ipek iplik takmake Aşil tendon ve tendon etrafında bir üçlü düğüm yapmak.
Düğüm yakın kuvvet dönüştürücü yerleştirin, tendon distal bölümünü kesmek ve ipek iplik kullanarak kuvvet dönüştürücü takın.
Triseps surae kas fasya altında paslanmaz çelik tel iki uzunlukları yerleştirin. Bu teller EMG kayıt için bir hücre dışı AC yükselticiye bağlanmıştır.
Iki bipolar kanca elektrotlar üzerinde Common peroneal sinir ve Tibial sinir yerleştirin.
Anot yakındaki bir kas dokunmadan, bir kanca elektrot katot üzerinde Triseps surae sinir yerleştirin.
Bir izolasyon ünitesi tüm uyarıcı elektrotlar bağlayın.
Kord sırtında potansiyelleri kaydetmek için bir ekstraselüler AC amplifikatöre bağlı omuriliğin dorsal yüzeyi üzerinde bir top elektrot yerleştirin. Bir arka kas ile temas halinde bir Ag / AgCİ referans elektrotuna yerleştirin.

12. Adım Oniki

Triseps surae sinir teşvikMaksimum seğirme genlik görülünceye kadar düşük frekans (<1 Hz) artan bir yoğunluk 50 μsec kare darbe kullanarak. Yavaş yavaş kasılan genlik ulaşana kadar seğirme yanıtı genliği izlerken kas germek için kuvvet dönüştürücü hareket ettirin.

13. Motonöronlar intrasellüler Kayıtlar

Bu noktadan itibaren, standart elektrofizyolojik teknikler, hücre içi bir elektrot hazırlamak omurilikteki bir nöron nüfuz ve motonöron olarak tanımlamak için kullanılır.

Bir pipet çektirmesi (P-97 Mikropipet Çektirme, Sutter Instruments) kullanılarak bir ~ 1 mikron ucu bir cam mikropipet çekin. KCl bir 3M çözeltisi (elektrot MΩ 10-20 direnci) ile elektrot doldurun.
Bir micropositioner kullanarak, omurilik içine bir hücre içi amplifikatör (Axoclamp 2B, Axon Instruments) bağlı mikropipet, sürücü. E uyarılması tarafından ortaya çıkarılan yerel alan potansiyelleri Monitörach sinir Triseps surae ve motor havuzu bulmak için.
Mikroelektrot direncini izlerken varsayılan motonöronlar dikkatle yaklaşmak. Bir zar karşı iterken, direnci artırır. Penetrasyon bazen hücre içi amplifikatör "buzz" fonksiyonu kullanılarak kolaylaştırılabilir.

14. Ötenazi Prosedürü

Deneyin sonunda, hayvanlar pentobarbital bir doz dekapitasyon ardından (210 mg / kg IV) ile ötenazi edilir.