Zebra balığı Embriyonik İskelet Kası Lazer-yaralama

Özet

Burada sunulan yöntem, yüksek enerjili lazer darbeleri ve zamanla bu yaralanmalar ve kurtarma ileri analizi ile canlı zebrafish embriyo kesin hasar oluşur. Ayrıca genetik olarak tek etiketli veya iskelet kas hücre gruplarının sırasında ve lazer ışık kaynaklı hasar sonrası takip edilebilir göstermek.

Özet

Çeşitli deneysel yaklaşımlar murin müsküler distrofi modelleri de myotoxin enjeksiyonları (bupivakain, cardiotoxin veya notexin), kas nakilleri (denervasyon-devaskülarizasyonun bağlı rejenerasyon), yoğun egzersiz, kas yenilenme çalışma amacı ile kas yaralanma ikna etmek için fare kullanılır, ama oylandı mdx fare (bu yaklaşımların bir inceleme için ^1'e bakınız) gibi. Zebrafish, genetik yaklaşımlar müsküler distrofi fenotipleri (örneğin runzel ² ya da ³ sapje gibi) sergilerler ve distrofi ile ilişkili genlerin ekspresyonunu engellemek ⁴ morpholinos antisens oligonükleotid mutantları sayılabilir. Bunun yanı sıra, kimyasal yaklaşımlar ve böylece sonuçta müsküler distrofi ⁵ yol açar hypercontraction oluşur, bunların, aynı zamanda Galanthamine, bir asetilkolinesteraz inhibe edici kimyasal bileşik, örneğin mümkündür. Ancak, genetik ve farmakolojik yaklaşımlar gfiziksel yaralanmalar ölçüde daha kolay ve mekansal ¹ kontrol edilir ise enerally, bireyin içindeki tüm kasları etkileyebilir. Lokalize fiziksel yaralanma bir iç kontrol olarak kontralateral kas değerlendirmesini sağlar. Başka bir grup son zamanlarda çok lokal bireyin embriyonik zebrafish kas plazma zarı zarar iki foton lazer (822 nm) kullanımı rapor Nitekim, biz son zamanlarda, zebrafish embriyo ⁶ iskelet kas yenilenme incelemek için lazer aracılı hücre ablasyon kullanılır hücreleri ^7.

Burada, zebrafish embriyo iskelet kas hücre hasarı için Micropoint lazer (Andor Teknolojisi) kullanımı için bir yöntem sunulmuştur. Micropoint lazer 435 nm dalga boyunda hedeflenen hücre ablasyon için uygun bir yüksek enerjili lazer. Lazer mikroskop aynı zamanda f da kullanılabilir ki bu tür bir şekilde (bizim kurulum, Zeiss bir optik mikroskop) bir mikroskop ile bağlanırveya numune üzerine ve yaralama (aydınlık veya floresans) etkileri görselleştirmek için lazer ışık odaklama. Lazer darbeleri kontrol parametreleri dalga boyu, yoğunluk ve bakliyat numarasını içerir.

Şeffaflığını ve dış embriyonik gelişme nedeniyle, zebrafish embriyo lazer kaynaklı yaralanma ve hem de daha sonraki iyileşme incelemek için çok müsait olan. 1 ila 2 gün sonrası fertilizasyon, somitic iskelet kas hücreleri giderek kuyruk ^{8, 9} gövdesinden somitogenesis ilerlemesi nedeniyle posterior anterior olgunlaşması uğrarlar. Bu aşamalarda, embriyo kendiliğinden seğirme ve yüzme başlatabilir. Zebrafish yakın yetişkin zebrafish ^{10, 11} yaralanma sonrası rejenere edilebilir dokuların birçok türleri (vb vasküler, nöronal, kardiyak) gibi, doku rejenerasyon çalışması için önemli bir omurgalı model organizma olarak kabul edilmiştir.

Protokol

1. Tek Hücreler Etiketleme

Bir β-aktin promotörü kontrolü altında bir plasmid kodlama GFP ya da GFP füzyon proteini ile tek-hücreli embriyoların enjekte edilir. Gelişimi sırasında, GFP sonra bir mozaik bir şekilde ifade edilir. Burada kullanılan transgenik yapı Tg [β-aktin: α-aktinin-GFP] olup β-aktin promotörü kontrolü altında α-aktinin-GFP füzyon proteini yerleştirir.

2. Embriyo Katıştırma

1. Zebrafish embriyolar toplayın ve 28 hpf (evreleme ¹² göre) kadar normal koşullar altında korur.
2. Forseps (Dumont # 5) ile birlikte bir stereomikroskop altında Dechorionate embriyolar.
3. Bir vazelin halka ile bir mikroskop slayt hazırlayın.
4. Bir% 1 düşük erime noktalı agaroz / E3 orta ile% 10 tricaine çözelti hazırlayın: bir sıvı ve homojen bir çözelti elde etmek için agaroz 10 ml E3 çözelti içinde kaynamaya 100 mg, agaroz, tablet ve mağazadaha sonra kullanmak için -20 ° C 'de kullanılmayan agaroz çözelti. Acil kullanım için, haşlanmış çözüm soğumasını ve max muhafaza edelim. 39 ° C. % 10 tricaine bir nihai konsantrasyon elde etmek için tricaine stok solüsyonu eklenir. Tricaine ve agaroz Hem embriyonik hareketlerin önlenmesi için gereklidir.
5. Embriyo tarafında doğal döşeme ile,% 1 vazelin halka içinde düşük erime agaroz / 10% tricaine / E3 ortamda tek bir embriyo Embed; nazikçe yerine embriyo korumak için ve bir dışbükey önlemek için bir lamel ile kaplayın ışığı kıracak yüzey. İdeal hedeflenecektir embriyonik kas dokusu lamel temas etmelidir.

3. Embriyo Lazer-yaralama

1. Micropoint lazer ve mikroskop hazırlayın:
   1. Mikroskop ile birlikte kurmak ve lazer nasıl kullanılacağı hakkında ayrıntılı talimatlar için Micropoint lazer kılavuzuna bakın.
   2. Doğru SeçinBir 435 nm dalga boylu lazer ışını üretimi için boya.
   3. Zayıflama kaydırıcısını kullanarak lazer gücünü ayarlayın. Lazer gücü, tek bir darbe (bu test için numune lamel örneğin odaklama) ile cam yüzey kırmak için yeterince güçlü olmalıdır. Bu, hücre ablasyon için gerekli lazer güçtür.
2. Mikroskobun oküler yüklü retikül kullanarak ilgi bölgesi veya hücre odaklanın. 20x objektif (40x daha kesin hasar izin verir, ancak genellikle çalışma mesafesi bu lens için yeterli değildir) kullanın.

Not 1: lazer sadece odaklama düzlemi içindeki hücrelere zarar değil, aynı zamanda yukarıda hücreleri ve lazer ışını dahilinde altında değildir. Lazer, optimum kurmak ve z ekseni içinde bir maksimal odak için ayarlanmış olduğundan emin denemeden önce emin olun. Bunu bilmek için deney yapmadan önce lazer yaralanma derinliğini belirlemek için en iyi olan cepİşte aynen yaralı olacaktır.

3. Bir floresan etiketli hücre hedefleme eğer normal kullanım veya floresan için aydınlık: Deneme görüntülenmesi için gerekli ışığı ayarlayın.
4. Yaralanma istenilen derecesine bağlı olarak, hedef bölge, ya da birkaç puls için lazer bir ışık gönder.

4. Yaralama ve Kurtarma Analizi

1. Eğer istenirse, lazer yaralanma prosedür canlı (örn. Metamorph yazılım akışı elde etme seçenek kullanılarak). ⁶ kaydedilebilir
2. Hemen yaralama sonra, embriyo forseps ile agaroz gelen yavaşça kaldırılır ve kurtarma için yumurta suya geri konulmalıdır.

Not 2: Atletik aktivite (yüzme ve seğirmesi) iskelet kas kurtarma için özellikle önemlidir. Embriyo tricaine pozlama ve sert agaroz gömme nedeniyle hareket edemez bu yana, recomme değildirçok uzun süre slayt ve lamel arasındaki embriyo korumak için nded.

3. Belirtildiği gibi kurtarma sonra, embriyo ışık-, floresan veya konfokal mikroskopi ile bağlanmış ve istenildiği gibi analiz edilebilir.

Sonuçlar

Lazer-aracılı yaralanma immobilize 1 gün-yaşlı embriyolar üzerinde yapıldı. Şekil 1 'de gösterildiği gibi, bir kaç lazer atımlarının normal olarak somite sınırları arasında gerilir hasarlı, sarmal, Aktin-zengin miyofibril tarafından kolayca tanınabilir, küçük bir yara oluşturabilir. Lazer atımlarının sayısı arttıkça, ancak en fazla miyofibril yok edilir bir ağır hasar somite blok neden olur. Yine de, biz kelimenin tam anlamıyla büyük olanlardan daha hızlı iyil...

Tartışmalar

Lazer-aracılı yaralanma zebrafish embriyo kontrollü koşullarda rejenerasyon incelemek amacıyla hücreleri ablasyonu ile istenilen büyüklükte yaralar için güçlü bir yöntemdir. Özellikle, tam hücreler hedef olabilir (Şekil 2) ve yara alanı gibi zamanlama her ikisi de kontrol edilebilir. Daha sonra, yaralanma bölgesinde ve yenilenme işlemleri kolayca izlenir, kaydedilmiş (Şekil 3) ve (Şekil 1) analiz edilir. Lazer de x-ve y-ekseninde odaklanmıştır ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isıtma bloğu
Çifti # 5 forseps	Dumont
Cam slayt	Menzel		76 x 26 mm
Lameller	Roth		50 x 24 mm # 1
Vazelin
Stereomikroskopta	Leica		MZFLIII
Micropoint lazer	Andor Teknoloji
Flüoresans mikroskobu	Zeiss		Axioplan II
Metamorph yazılımı	Molecular Devices
			Reaktifler Düşük erime noktalı agaroz (# 50081,Lonza) Tricaine stok solüsyonu: 400 mg Tricaine (# A-5040, Sigma-Aldrich) / 100 ml dH 2 O pH 9.0 E3, orta (5 mM NaCl, 0.17 mM KCI, 0.33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4)