Genom çapında Gen Delesyonlar içinde<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Yüksek Verimli PCR ile

Özet

Verimli bir genom tek gen mutasyonu yöntemi kullanılarak oluşturulmuştur Streptococcus sanguinis Bir model organizma olarak. Bu yöntem yüksek verimlilik rekombinant PCR ve dönüşümler yoluyla elde etti.

Özet

Transposon mutagenez ve tek gen delesyonu bakteriler ^1,2 genom gen nakavt uygulanan iki yöntem vardır. Transposon mutagenesis, daha az zaman alan daha az maliyetli ve tamamlanmış genom bilgi gerekli değildir olmasına rağmen, bu yöntem iki zayıf vardır: azalma ile rekabet mutantlar karşı seçer ve bu karışık mutant kütüphanesi içinde bir farklı mutantların (1) olasılığı; ve (2) kısmi gen inaktivasyonu olasılığını sayede genlerin tamamen transposonun yerleştirilmesinin ardından kendi işlevini kaybetmek yok. Tek gen silme analizi transpozon mutasyon ile ilgili dezavantajları telafi edebilir. Genom tek gen delesyonu verimini artırmak için, bir model organizma olarak Streptococcus sanguinis kullanarak genom tek gen delesyonu için yüksek-throughput tekniği kurmaya çalışacaktır. Her gen delesyonu S. inşa sanguinis genom 1 ihtiva şekilde tasarlanmıştırHedefli gen, APHA-3 geni kodlayan, kanamisin e dirençli protein ve hedeflenen gen 1-kb akış aşağı-yukarı kb. Primerler F1/R1, F2/R2, ve F3/R3 üç set, sırasıyla tasarlanmış ve her bir silme, bu üç parçalarını inşa PCR büyütmesi için-96-kuyucuklu bir plaka biçiminde sentezlenir. Primerler, R1 ve F3 kendi 5 'ucunda APHA-3 gen bölgeleri için tamamlayıcı olan 25-bp sekanslar içerir. APHA-3 geninin büyük ölçekli bir PCR amplifikasyon tüm tek gen silme yapıları oluşturmak için bir kez gerçekleştirilir. APHA-3 geninin promotörü başlangıçta kanamisin kaseti potansiyel kutup etkisini en aza indirmek için dahil edilir. Gen silme yapıları oluşturmak için yüksek verimli, PCR saflaştırma 96 çukurlu bir levha formatında gerçekleştirilir. Her gen delesyonu için doğrusal bir rekombinant PCR amplikon yüksek sadakat DNA polimeraz kullanılarak dört PCR reaksiyonları aracılığıyla yapılacaktır. Ilk exponS. ential büyüme fazı % 2.5 inaktive at serumu PCR-rekombinant yapıların dönüşümü için yeteneklerini artırmak için kullanılan Todd Hewitt broth kültürü sanguinis desteklenmiştir. S. Bu koşul altında,% 20'ye kadar sanguinis hücrelerin DNA ~ 50 ng kullanılarak dönüştürülebilir. Bu yaklaşıma göre, tek gen silinmesi ile 2.048 nihai mutant S. 2.270 genler elde edildi dört gen ORF hariç sanguinis S. başka ORF tamamen kaplayabilir sanguinis SK36 ve 218 potansiyel elzem genler. Gen delesyonu yapıları oluşturma konusunda teknik, yüksek verim ve herhangi bir dönüştürülebilir bakteri genomu tek gen delesyonlar kullanımı kolay olabilir.

Protokol

1. Primer Tasarım

1. Astarlar S. dayalı ev komut kullanılarak tasarlanmıştır sanguinis SK36 genom dizisi. Primerler, F1/R1, F2/R2, ve F3/R3 üç set hedef gen, APHA-3 kodlaması, kanamisin e dirençli gen (Km ^r) protein ³ ve 1 1-kb yukarısında sekans amplifikasyonu için tasarlanmış sırasıyla, hedef gen, bir-kb aşağı sekansı (Şekil 1). Bu primerler arasında, F1 ve R3 programları EMBOSS paketi (içinde ePrimer3 kullanılarak tasarlanmıştır http://emboss.sourceforge.net/apps/cvs/emboss/apps/index.html hedefin yukarı veya aşağı komşu bölgeleri yükseltmek için) Gen. Gene özgü primerler, R1 ve F3, 5 've 3' dizileri hedef genin bağlı olarak tasarlanmıştır. R1 ve F3 primerler APHA-3 tamamlayıcı olan kendi 5 'ucunda 25 bp'lik adaptör dizisi içerenGen. Her bir primerin erime sıcaklığına yakın olan bir ila 60 ° C 96-gözlü formata bütün PCR reaksiyonları için tavlama sıcaklık üniform bir kullanımını sağlamaktır. Olacak şekilde tasarlanmıştır
2. F1, R1, F3 ve R3, primerler bir gen sırasına göre 96 oyuklu levhalar içinde sentezlendi. Her bir plaka, aynı gen için primerlerin bir türünü içerir. Çok kanallı bir pipet kullanılarak PCR amplifikasyonu için 10 uM'lik bir son konsantrasyon 96-kuyu çalışma astar levha içinde primerler seyreltilir.

2. Yüksek throughput PCR Amplifikasyon ve Saflaştırılması

1. High-throughput yükseltmek için 1-kb yukarısında veya hedef S. mansap sanguinis genler, 1640 ul GKD ₂ O, 250 ul 10xHigh Fidelity PCR Tamponu, 10 mM dNTP karışımı 200 ul, 50 mM 100 ul _MgSO4, 100 ul ihtiva eden bir 15-ml konik bir tüp içinde buz üzerinde bir PCR kokteyl karışım birleştirmek 10 ul / ng S. sanguinis SK36 genomik DNA ve 10 ul Platin Taq DNA polymerase yüksek sadakat ve transferi çok kanallı pipet kullanarak 96-PCR plaka üzerinde her kuyuya karışımı 23 ul. Kanallı bir pipet kullanılarak PCR plaka için astar plakalar çalışan 10 uM her F1 ve R1, (ya da F3 ve R3 taban düzenekleri) 1 ul aktarın. PCR plate Mühür ve 1.5 dk 30 sn ve 68 ° C 30 sn 1 dk ve 94 ° C 30 döngü, 54 ° C için 94 ° C'de amplifikasyon gerçekleştirin.
2. % 1 agaroz jel 48 kuyu montaj kanallı pipet yükleme ile etidyum bromür içeren hazırlayın. 96-plaka üzerine 5xDNA yükleme tamponu 1 ul 4 ul PCR ürünü karıştırın ve 10-ul kanallı pipet kullanarak agaroz jel üzerinde örnekleri yükleyebilirsiniz. 30 dakika için 135 V elektroforez çalıştırın. UVP dokümantasyon ve analiz sistemi altında jel üzerinde bant inceleyin.
3. Üreticinin talimatlarına göre santrifüj kullanılarak PureLink 96 PCR saflaştırma kiti ile PCR ürünleri arındırın. DNA salınımlı için, b kuyuya 40 ul steril GKD ₂ O ekleyinplaka inding.
4. Rasgele Nanodrop spektrofotometre kullanılarak DNA konsantrasyonları incelemek için plaka üzerinde birçok saflaştırılmış amplikonlarının almak. Plaka üzerinde amplikonlarının konsantrasyon ayarlama için ~ ul / 10 ng.
5. Bir plazmid içeren Km ^r kaset PCR şablon olarak EcoR ben kullanılarak sindirilir. Sindirilen plazmid QIAquick PCR saflaştırma kiti ile arındırıldı ve doğrusal plazmid DNA son DNA konsantrasyonu 10 ng / ml 'den ayarlanır. SO 16.4 ul GKD ₂ O, 2.5 ul 10xHigh Fidelity PCR Tamponu, 10 mM dNTP karışımı 2 ul 50 mM Mg 1 ul içeren Km ^r kaset amplikon için 25 ul karışım birleştirin _4, 10 uM, F2, 1 ul 1 ul 10 uM R2, 1 ul doğrusal plazmid DNA ve 0.1 ul Platin Taq DNA polimeraz yüksek aslına uygunluk. ° C 1 dakika, 30 saniye ve 68 saniye için 30 için 1 dakika, ve 94 ° C'de 30 döngü, 55 ° C de 94 ° C 'de PCR amplifikasyon gerçekleştirin. % 1 agaroz jel elektroforezi ile PCR ürünü inceleyin. PooQIAquick PCR saflaştırma kiti ile 10 ayrı PCR saflaştırılmış gelen Km ^r kaset Amplikon la toplu. 10 ng / ul Amplikon konsantrasyonunu ayarlayın.
6. Son lineer rekombinant PCR amplikon elde etmek için, üç PCR amplikonlarının de PCR şablon olarak bir PCR plate her 1 ul (yaklaşık eşit molar miktarlarda) ile birleştirilir. Diğer bileşenler PCR SO 14.4 ul GKD ₂ O, 2.5 ul 10xHigh Fidelity PCR Tamponu, 10 mM dNTP karışımı 2 ul 50 mM Mg 1 ul da dahil olmak üzere eklenir _4, 10 uM F1 1 ul, 10 uM, R3 1 ul, 0.1 ul Platinum Taq DNA polimeraz yüksek sadakat. PCR amplifikasyon 4 dk için 3.5 dakika ve son olarak da 68 ° C 30 sn için ve 68 ° C, 30 saniye 55 ° C, 2 dakika, 94 ° C'de 30 döngü için 94 ° C sıcaklıkta gerçekleştirilir.
7. Agaroz jel üzerinde PCR amplikonlar inceleyin. Arındırmak ve yukarıda tarif edildiği gibi PCR amplikonlar ölçülmesine imkan verirler. -20 ° C'de rekombine PCR amplikonlarının dondurun

3. Competent Hücreler Hazırlık

1. Todd Hewitt et suyu hazır hale getirilir, oda sıcaklığına kadar soğutuldu ve 0.22 um filtre polistiren ⁴ kullanarak sterilize sonra kaynamaya kadar ısıtıldı ve 10 N NaOH kullanılarak 7.6 pH değeri ayarlanmış. TH + HS orta telafi etmek için 15 ml konik tüp içinde 11.7 ml Todd Hewitt suyuna 300 ul ısı inaktive at serumu (% 2.5 final konsantrasyon) ekleyin. Tablet TH + HS orta 2 ml ve tüpler 10 ml içine.
2. Stokta S. 5 ul inoküle sanguinis SK36 2 ml TH + HS ortama -80 ° C'de dondurulmuş ve 37 sıkıca kapatma ile gecede kültür inkübe 10 ml-TH + HS tüp pre-kuluçkaya eşliğinde ° C,.
3. Gece boyunca sonra, 10 ml TH + HS içine 50 ul kültür aktarmak ve 3 saat (0,07-0,08 OD ₆₆₀ tekabül eder), 37 ° C de inkübe tüp, hemen dönüşüm için kullanarak.

4. Hücre Dönüşüm ve Antibiyotik Seçimi

1. 70 ng S. 2 ul ekleyin sanguinis SK36 yetsistans uyarıcı peptid (CSP) ve 37 blok 96-iyi ve onları ön ısıtma üzerine Eppendorf tüplerine 2 ul doğrusal rekombinant PCR amplikon (~ 50 ng) ° C Her tüpe 3 sa-inkübatöre SK36 kültürün 330 ul aktarın. 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Kontrol olarak steril GKD ₂ O ile DNA değiştirin.
2. Buz bloğu yerleştirin ve 500 mg / ml kanamisin beyin kalp infüzyon (BHI) agar plaka üzerinde her dönüşümün 100 ul yayıldı. Mikroaerobik koşullar altında 2 d, 37 ° C de inkübe plakaları.

5. Mutant Onay ve Depolama

1. Her yedek mutant için, rastgele, 2 ayrı koloniler pick up 5 ml BHI 500 mg / ml kanamisin içeren haline koloni aşılamak ve 37 microaerobically gecede inokulum inkübe ° C -80% 30 gliserol, her kültür Cryopreserve ° C
2. Beklenen gen replasman içeren mutant, koloni her mutant kullanarak F1 için PCR ve R3 gerçekleştirmek olmadığını incelemek için96-kuyulu plakalı olarak PCR primerleri. Tek koloni ila yaklaşık 1 ul gece boyunca kültür 25 ul PCR amplifikasyon reaksiyonu içinde şablon DNA olarak kullanılmıştır. PCR ° C'de 3.5 dakika ve son olarak da 68 ° C'de 4 dakika için 30 saniye ve 68 için 30 saniye, 55 ° C'de 5 dakika, 94 ° C'de 35 döngü için 94 ° C sıcaklıkta gerçekleştirilir.
3. Tam çift bant mutantlar veya kirletici PCR amplikon tanımlamak için, etidyum bromid boyama ile> 12 cm uzunluğunda% 2'lik agaroz jel üzerinde 4 saat elektroforez ile PCR amplikon inceleyin. Bu agaroz jel elektroforez koşulu altında, ≥ 100 bp farkı ile herhangi amplikonlarının açıkça belirlenmiştir. Km ^r kaset amplifikasyon ve vahşi türdeki kaynaklanan bantları bir iç T1 astar vahşi tip geni PCR ile tespit edilebilir olup olmadığını belirlemek için kullanılır <100 bp, göre farklı beklenen zaman.
4. İlave Silme işlemini onaylamak için, amplikonlarının PureLink 96 PCR saflaştırma kiti ile saflaştırılmış ve hangi P1 astar kullanılarak dizilerekKm ^r kaseti bağlanır. Sekanslama tarafından onaylandıktan sadece doğru mutantlar tutun.

Sonuçlar

Sonra PCR primerleri, F1 ve R1 kullanılarak amplifikasyon, ve F3 ve R3'ün her biri S. yaklaşık 1 kb yukan ve aşağı sanguinis gen 96-gözlü formata, sırasıyla (Şekil 2A) halinde elde edildi. Bizim PCR koşulları ve kullanılarak tasarlanmış primerler altında, belirli bir ürün S. amplifiye edildi Her bir PCR reaksiyonu içinde sanguinis genomik DNA. Bu sonuç primerlerin S. hedeflerine çok özel olduğunu göstermiştir sanguinis....

Tartışmalar

İlk astar tasarımı sırasında komşu genler üzerinde dışsal antibiyotik gen ile bir hedef genin değiştirilmesi mümkün polar etkilerini en aza indirmek için, iki adım alınır. Silinen genlerin çoğu için, primerler R1 ve F3 önce stop kodonu ile 30 bp için başlangıç ​​kodonu takip eden 6 bp gelen kodlama bölgesindeki silmek için tasarlanmıştır. Son 30 baz çifti bitişik aşağı gen tarafından kullanılan potansiyel ribozomal bağlanma yeri korumak için korunur. Iki komşu genler arasında...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Astar F2	Entegre DNA Teknolojileri	TGACTAACTAGGAGGAATAAATG GCTAAAATGAGAATAT
Astar R2	Ibid	CATTATTCCCTCCAGGTACTAAAA CAATTCATCCAGT
Astar F2P	Ibid	GATAAACCCAGCGAACCATTTGA
Astar P1	Ibid	GCTTATATACCTTAGCAGGAGACA
Astar P2	Ibid	GTATGACATTGCCTTCTGCGTCC
Astar 5 'end_R1_seq	Ibid	GCCATTTATTCCTCCTAGTTAGTCA
Astar 5 'end_F3_seq	Ibid	GTTTTAGTACCTGGAGGGAATAATG
Astar 5 'end_R1p_seq	Ibid	CCTCAAATGGTTCGCTGGGTTTATC
CSP	Synprep	Dizi: NH2-DLRGVPNPWGWIFGR-COOH
DNA Polimeraz	Invitrogen	11304-102	Platinum Taq DNA Polimeraz High Fidelity
EcoRI	New England Biolabs Inc	R0101S	Restriksiyon enzimi
Agar	AB01185
Agaroz	Promega	V3125
BHI	BD Biosciences	237.500	Beyin Kalp İnfüzyon
At serumu	Fisher Scientific	SH3007403	At serumu
Km	Fisher Scientific	BP906-5	Kanamisin
TH broth	BD Biosciences	249.240	Todd Hewitt broth
PureLink 96	Invitrogen	K310096	PureLink 96 PCR saflaştırma kiti
QIAquick	Qiagen	28106	QIAquick PCR saflaştırma kiti
Filtre	Corning	431.117	0.22 mikron polistiren filtre
Anoxomat Sistemi	Mart Mikrobiyoloji bv	Anoxomat Mark II
Masa Üstü Santrifüj	Thermo Scientific	75004377	Sorvall Legend RT Plus mikroplaka rotor
Jel Dökümantasyon	UVP LLC	BioDoc-O 210
İnkübatör	Fisher Scientific	11-690-625D	Isotemp
Labnet kullanıcısının Jel XL	Labnet	E0160	Labnet kullanıcısının Jel XL
Mikrosantrifüj	Eppendorf	22621408	Mikrosantrifüj 5415 R
Çok Kanallı pipetler	Termo scientfic	4661040, 4661020	Finnpipette F1
Termal Cycler	Uygulamalı Biosystems Inc	N805-0200	GeneAmp PCR sistemi 9700