RNA-seq Trombin-tedavi içinde Transcriptomes Analizi ve Kontrol İnsan Pulmoner mikrovasküler endotel hücrelerinde

Dilyara Cheranova; Margaret Gibson; Suman Chaudhary; Li Qin Zhang; Daniel P. Heruth; Dmitry N. Grigoryev; Shui Qing Ye

doi:10.3791/4393

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Method Article

RNA-seq Trombin-tedavi içinde Transcriptomes Analizi ve Kontrol İnsan Pulmoner mikrovasküler endotel hücrelerinde

DOI:

10.3791/4393

⸱

February 13th, 2013

Dilyara Cheranova¹, Margaret Gibson¹, Suman Chaudhary¹, Li Qin Zhang¹, Daniel P. Heruth¹, Dmitry N. Grigoryev¹, Shui Qing Ye¹

¹Children's Mercy Hospital and Clinics, School of Medicine, University of Missouri-Kansas City

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Özet

Bu protokol ile veya trombin tedavi olmadan insan pulmoner mikrovasküler endotel hücrelerinde profili transcriptomes RNA-seq, güçlü bir nesil DNA dizileme teknolojisi, uygulamak için tam ve ayrıntılı prosedür sunar. Bu protokol, farklı reaktifler veya hastalık durumlarında etkilenen çeşitli hücreleri veya dokulara genellenebilir olduğunu.

Özet

MRNA seviyelerinin ölçümü yoluyla hücrelerinde gen ekspresyonu karakterizasyonu hücrenin transkripsiyonel makine harici sinyaller (örneğin uyuşturucu tedavisi), veya nasıl hücreler sağlıklı bir devlet ve bir hastalıklı durum arasındaki farklılıklar nasıl etkilendiğini belirlemede yararlı bir araçtır. Nesil DNA dizileme teknolojinin gelişi ve sürekli arıtma ile, RNA-sıralama (RNA-seq), transkript bütün türlerin kataloğa tüm ifade genlerin transkripsiyonel yapısını belirlemek ve ölçmek için transcriptome analiz giderek daha popüler bir yöntem haline gelmiştir belirli bir hücre, doku veya organizma ^1,2 transkript toplam grubu değişen ifade seviyeleri. RNA-seq kademeli olarak tam bir profil transcriptome avantajlara sahiptir çünkü, transcriptome analiz için tercih edilen bir yöntem olarak DNA mikroarrayleri yerine bir tür dijital veri (herhangi bir transkript kopya sayısı) sağlayan ve bilinen herhangi bir genomik istif güvenmek içince ^3.

Burada, biz veya trombin tedavi olmadan insan pulmoner mikrovasküler endotel hücrelerinde profili transcriptomes RNA-seq uygulamak için tam ve ayrıntılı bir protokol mevcut. Bu protokol başlıklı bizim son yayınlanan araştırmaya dayanmaktadır başarılı insan pulmoner mikrovasküler endotel hücrelerinin ilk tam transcriptome analizi icra ettiği ⁴ "RNA-seq Trombin ile Tedavi İnsan pulmoner mikrovasküler endotel hücrelerinde Genlerin ve Bunların İzoformlar, Romanı transcriptome ortaya çıkarır" trombin RNA-seq kullanarak tedavi. Bu inflamatuvar koşulları, kanser, diyabet ve koroner kalp hastalığı patogenezinde trombin aracılı endotel disfonksiyonu moleküler mekanizmaları içgörüler kazanmak için daha sonraki denemeler için görülmemiş kaynaklar vermiştir ve bu hastalıklar için tedavi hedefleri için potansiyel yeni müşteriler sağlar.

Bu protokolün açıklayıcı metindört bölüme ayrılmıştır. Birinci bölüm trombin ve RNA izolasyonu, kalite ve miktar ile analiz insan akciğer mikrovasküler endotel hücrelerinin tedavisi açıklanmaktadır. İkinci bölümde kütüphane oluşturma ve sıralama açıklar. Üçüncü kısım veri analizi açıklanmıştır. Dördüncü bölüm, bir RT-PCR testi doğrulama açıklanmaktadır. Birkaç kilit adımlar Temsilcisi sonuçları görüntülenir. Önemli adımlar başarı artırmak için Yararlı ipuçları veya önlem Tartışma bölümünde verilmiştir. Bu protokol trombin ile tedavi insan pulmoner mikrovasküler endotel hücrelerinde kullanmasına rağmen, memeli ve non-memeli hücrelerinde hem de farklı uyaranlara veya inhibitörleri, ya da sağlıklı bir devlet arasındaki hücre veya dokularda transcriptomes karşılaştırmak ile tedavi dokularda profili transcriptomes jeneralize olabilir ve bir hastalık durumu.

Protokol

Bu protokol özetleyen bir akış şeması Şekil 1 'de gösterilir.

1. Trombin, RNA İzolasyonu, RNA Kalitesi Değerlendirme ve Ölçülmesi ile Hücre Tedavisi

% 5 FBS, büyüme faktörleri ve antibiyotik ile EGM-2 orta boy 6-kuyucuğu yılında% 90-100 izdiham Kültür İnsan Akciğer Mikrovasküler Endotel Hücreleri (HMVEC-LBL) (Lonza, cat # CC-3202).
Açlık medya (0% FBS) öncesinde trombin ile tedaviye 30 dakika ortam değiştirin.
0.05 U / ml trombin ile hücrelerin tedavi ya da ° C ve% 5 _CO2 37, 6 saat süreyle, bir kontrol olarak tedavi bırakın.
Üreticinin talimatlarına uygun olarak Ambion mir Vana kiti kullanılarak tedavi edilen ve kontrol hücrelerinden toplam RNA izole edin.
Experion Otomatik Elektroforez İstasyonu (ilgili standart protokole göre bir Experion StdSense Ökaryotik RNA çip ile RNA kalitesini değerlendirmek= "_blank"> Www.bio-rad.com).
Bir standart spektrofotometrik yöntem kullanılarak RNA ölçülmesine imkan verirler.

2. Kütüphane İnşaat ve Dizileme

Başlangıç maddesi olarak örnek için yüksek kalitede toplam RNA'nın 1 mg kullanımı.
Kütüphane oluşturmak için, Illumina (protokol # 15008136 Rev A) 'dan standart prosedürü izleyin. Bu protokolde, poli iki tur (A) içeren mRNA seçimleri rRNA dizi minimize etmek rRNA kaldırmak için yapılır.
Experion Otomatik Elektroforez İstasyonu (ilgili standart protokole göre bir Experion DNA 1K çip kullanan kütüphanelerin kalitesini değerlendiriniz www.bio-rad.com ).
QPCR kullanarak kütüphane sayısal: önce bir standart eğri ve bağlanan bağdaştırıcıları için spesifik primerler olarak dizisi edilmiş bir kütüphane kullanın. Bilinmeyen kütüphaneleri (yani 1:100, 1:500 ve 1:1,000) dilüsyonlarının bir dizi kullanın. QPCR ACCO çalıştırınSyberGreen MM protokol rding ve her kütüphanenin orijinal stok miktarını hesaplamak.
Küme bir akış hücresi hazır olana kadar -20 ° C'de 10 nM ve saklamak için kütüphane stok sulandırınız.
Ne zaman küme bir akış hücresi hazır, bir su banyosunda CBOT reaktif plaka eritin. CBOT küme oluşturma sürecini hızlandırmak için kullanılan bir Illumina araçtır.
CBOT enstrüman yıkayın.
Kütüphaneleri denatüre:, tüpün yönünde 13 ul TE 1x ve 6 ul 10 uM ve kütüphane, Kombine 1 ul 1 N NaOH (Illumina tarafından sağlanan) ekleyin. Vorteks, aşağı dönüş 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir ve buz üzerinde denatüre kütüphaneleri yerleştirin.
Kütüphaneleri inceltilir 12:00 arasında bir nihai konsantrasyon için 996 ul HT1 ve 4 ul denatüre kütüphane birleştirilmesi ile önceden soğutulmuş bir hibridizasyon tampon ile denatüre kütüphaneleri (HT1, Illumina tarafından sağlanmaktadır) seyreltilir. Buz üzerinde denatüre ve seyreltilmiş kütüphaneler yerleştirin.
, CBOT levha tüplerin her sıra InvertTüm reaktifler çözülmüş olmasının sağlanması. Plaka aşağı Spin, / delinmeye folyo mühürler kaldırmak ve CBOT üzerine yerleştirin.
Bir şerit tüp seyreltilmiş, denatüre kütüphanelerin kısım 120 ul, 1-8 etiketli. Bir kontrol başak-gibi her tüpe 1,2 ul seyreltilmiş, denatüre phix kontrol kitaplığı (Illumina dan itibaren) ekleyin. Vortex ve tüpler aşağı spin ve doğru yönde CBOT (sağ tüp # 1) yükleyin.
CBOT üzerine bir akış hücresi ve manifoldu yükleyin.
Akışını kontrol ve kümelenme çalışma başlar tamamlayın.
Çalışma tamamlandıktan sonra, tüm kulvarları arasında reaktif teslim edin. Herhangi bir anormallik not edin. Ya 4 ° C'de hemen dizi çalışma başlatmak veya sağlanan tüp içinde akış hücresi depolamak
Sıralama-by-sentez (SBS, Illumina) reaktifler çözülme.
Dilinim karışımı dokunduktan sonra diğer reaktifler dokunmamaya dikkat ederek, reaktif tepsileri uygun noktalar reaktifleri yerleştirin.
Bir hayır kullanman-sıralama akış hücresi (yani önceden sıralandı biri), asal reaktif çizgiler iki kez.
İyice% 70 EtOH ve lens kağıt ardından% 70 EtOH ve Kimwipes ile sıralama akış hücresi, temizleyin. Herhangi çizgiler akış hücresi inceleyin. Gerekirse yeniden temizleyin.
Sequencer üzerine akış hücresi yükleyin ve manifoldlar ve akış hücresi arasındaki mühür sıkı olduğundan emin olmak için kontrol akışı gerçekleştirin.
Sıralama çalışma başlatın.
Onlar çalıştırması sırasında kullanılabilir hale kalite ölçütleri (küme yoğunluğu, örneğin filtre geçen kümeleri, S30, yoğunluk) değerlendirin.
Çalışma süresince yoğunluğunu izleyin.
101 döngüleri tamamlandıktan sonra, ikinci okumak tamamlamak için dönüş kimya gerçekleştirin: Eşleştirilmiş sonuna reaktifler ve ikinci okuma Ortaklığımız Buffer (ICB, SBS reaktiflerin bir bileşeni, Illumina) çözülme ve reaktifler yükleyin.
^2. yoğunluğu, S30 bir okuma değerlendirirken, sıralama çalışma devamçalışma ilerledikçe nd diğer kalite ölçütleri.

3. Veri Analizi

Her numune için tek fastq dosyasının oluşturulmasını sağlamak için 0 fastq-küme sayısı ayarı. Fastq dosyaları tabanı çağrı dosyaları (. Bcl) dosyalarını dönüştürmek için casava (Illumina, şu anda 1.8.2) en son sürümünü kullanın . Aşağı analiz için fastq dosyaları açın.
RNA-seq ultra high-throughput kısa okuma hizalama (Papyon, 0.12.7) ⁶ ve SAMtools (0.1 kullanarak memeli ölçekli genom okur hizalar Tophat (1.4.1) ^5, en son sürümlerini kullanarak eşleştirilmiş sonuna hizalama gerçekleştirin. 17) ^7. SAMtools SAM biçiminde sonrası işleme hizalanmalar için çeşitli araçlar uygular. Referans insan transcriptome iGenomes (indirilebilir www.illumina.com ). Tophat çalıştıran, biz fr-unstranded (varsayılan) olarak kütüphane türü seçeneği dahil olmak üzere tüm varsayılan parametre ayarları kullanılır.
Bize^8. yazılım paketi programı CuffDiff, kol düğmesi parçası (1.3.0) 'a ing insan referans transcriptome esas olarak önceki farklı olarak ifade edilen gen transkript dışarıda bırakmak için, kontrol hücreleri ile trombin ile tedavi edilen hücreler karşılaştırın. Bu karşılaştırma bilinen transkript diferansiyel ifadesi algılar. Tablo şeklinde sonuç görselleştirmek için Microsoft Excel kullanın. Kol Düğmeleri program çalışırken, biz tüm varsayılan parametre ayarları kullanılır. FPKM <0.05 ve p> olanlar gen transkript 0.05 filtrelenir.
Roman izoformları algılamak için, bir referans transcriptome olmadan Kol Düğmeleri çalıştırın. Cuffcompare kullanılarak referans genomuna örnek transkript dosyaları karşılaştırın ve bir analiz için referans genomu ve bir ikinci analiz için referans genom olarak birleştirilmiş kontrol transkript dosyaları olarak birleştirilmiş trombin transkript dosyaları kullanılarak Cuffdiff ile diferansiyel ifade test edin. Tablo biçiminde sonuç görselleştirmek için Microsoft Excel kullanın. Yine, ThosFPKM <0.05 ve p> E gen transkript 0.05 filtrelenir. Bu adımdan sonra, araştırmacılar UCSC Genom Tarayıcı web sitesi (için yeni rapor transkript bir listesini yüklemeyi tercih edebilirler http://genome.ucsc.edu/ bir elle muayene ederek geçerliliğini doğrulamak için).
Yaratıcılık Pathway Analizi (IPA, değişik şekillerde ifade genlerin listeleri gönderin www.ingenuity.com trombin tedavi etkilenen genlerin ve yolların karakterizasyonu için). Bu adımda, müfettişler kuşak (kullanmayı tercih edebilir http://compbio.mit.edu/cummeRbund/ görselleştirmek, yönetmenize yardımcı olmak için), Kol Düğmeleri RNA-seq çıkış irdeleme görevini yardım ve kolaylaştırmak için tasarlanmış bir R paketi, ve bir analiz Cuffdiff tarafından üretilen verinin her entegre.

4. Kantitatif Gerçek-zamanlı-Po tarafından RNA-seq Sonuçlar Validasyonulymerase Zincir Reaksiyonu (qRT-PCR)

Kontrol ve trombin-işlenmiş HMVEC-LBL hücreleri, RNA kalite değerlendirmesi ve 1.6 Adımlar 1,4 açıklanan RNA miktarının toplam RNA izolasyonu gerçekleştirin.
Üreticinin talimatlarına (Invitrogen, 18080-051) takip Üst Simge III Üretim-Strand Sentez Sistemi RT Kitleri ile her bir örnek 1 mg total RNA, gelen tamamlayıcı DNA oluşturun.
CUGBP, Elav-likefamilymember1 (CELF1, Hs00198069_m1), Fanconianemia, complementationgroupD2 (FANDCD2, Hs00276992_m1), TNFreceptor tespiti için Taqman Assay-on-Demand tasarlanmış oligonükleotidler kullanılarak Uygulamalı Biyosistem VIIa 7 Real-Time PCR Sistemi qRT-PCR analizi gerçekleştirin ilişkili faktör 1 (TRAF1, Hs01090170_m1) ve β-aktin (ACTB, Hs99999903_m1). Her numune toplam RNA 5 ng eşdeğer bir şablon vardı. DDCt yöntemiyle kantitatif ölçün ve β-aktin normalleştirmeniz. Her bir tahlil çoğaltır, en az üç biyolojik karşısında gerçekleştirildi.