Kütle Sitometri: Bir CyTOF Kütle Sitometre Daily Tuning ve Koşu Hücre Örnekleri için protokol

Michael D. Leipold; Holden T. Maecker

doi:10.3791/4398

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

Özet
Özet
Protokol
Sonuçlar
Tartışmalar
Açıklamalar
Teşekkürler
Malzemeler
Referanslar
Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bir CyTOF kitle sitometresinin performans günlük ayarlama ve optimizasyon için gerekli adımlar açıklanmaktadır. Optimum numune hazırlama ve akış hızı Comments on tartışılır

Özet

Son yıllarda, tek hücrelerin hızlı analiz genellikle akış sitometrisi ve floresan-etiketli antikorlar kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Ancak, fluorofor emisyon spektral örtüşme sorunu eşzamanlı probların sayısını sınırladı. Buna karşılık, daha çok floroforlar göre bir ICP-MS. ¹ bir sıvı tek hücreli giriş sistemi DVS Sciences çiftler tarafından yeni CyTOF kütle sitometresinde yüksek oranda zenginleştirilmiş metal şelatlama izotopları ihtiva eden polimerler, antikorlar ya da başka özel problar ile birleştirilir. ^2-5 Çünkü metal saflık ve kitle sitometresinin kütle çözünürlüğü, komşu izotoplar hiçbir "spektral örtüşme" olduğunu ve bu nedenle tazminat matrisler gerek. Buna ek olarak, lantanit metallerinin kullanımına bağlı olarak, otoflöresans herhangi bir eşdeğer bu nedenle hiçbir biyolojik arka plan ve. Atomik kütle 103-203, teorik olarak en fazla 100 etiket eşzamanlı ayırtedilebilecektir kapsayan kitlesel bir pencere bulunmaktadır. Şu anda, 35'ten fazla kanalı örneklerin immünolojik profili görülmemiş diseksiyonu izin DVS Bilimler edinilebilir şelatlama reaktifler kullanılarak kullanılabilir. ^6-7

Kitle sitometri için Dezavantajları prob başına ayrı bir metal izotop (ileri veya yan dağılım hiçbir eşdeğeri) ve yıkıcı bir tekniktir (kurtarma sıralama ihtimalinin) olması için sıkı gereksinimi vardır. Kütle sitometresinin akım konfigürasyonu, aynı zamanda tek bir hücre iletim hızı ~% 25, ve böylece hücrelerin daha yüksek giriş numarası gerektiren sahiptir.

Kitle sitometresinin Optimal günlük performans birkaç adım gerektirir. Optimizasyon temel hedefi M sinyal yoğunluğu azaltmak ve M +16 de istenilen sinyal ile müdahale edeceğini oksitler (M +16) oluşumunu azaltırken istenen metal izotopları (M) ölçülen sinyal yoğunluğunun maksimize etmektir. İlk adım, makinenin çok sıcak, istikrarlı Ben ısınmak içinCP plazma kurulmuştur. İkincisi, güncel ve makyaj gaz akış hızı ayarlarına günlük olarak optimize edilmelidir. Numune toplama sırasında yüksek hücre olay hızı detektörü verim ve işlem hızı 1000 hücre / dakika ile sınırlıdır. Bununla birlikte, daha düşük bir hücre olay oranı (300-500 hücre / saniye), örnek kalitesine bağlı olarak, genellikle hücre olaylar arasında ve böylece daha iyi bir çözünürlüğe çiftler çifti ve kalıntı fazla bozulmadan singlet en üst düzeye izin vermek için arzu edilir. Son olarak, günün sonunda makinenin uygun temizleme serbest metale bağlı olarak arka plan sinyali en aza indirir.

Protokol

CyTOF için tüm hücre örneklerinin sabitlenir ve permeabilize gerekir. Bu, iridyum içeren DNA enterkalatörün daha fazla giriş sağlar, ve aynı zamanda kütle sitometresi içine enjekte hemen önce MilliQ su ve yıkama adımları sırasında yeniden süspansiyon hücre parçalama önler.

1. Start-up Kütle Sitometre arasında

CyTOF yazılım programını açın. Enstrüman Ayarları'nı seçin. Kart Kafesini sekmesinde, sağ alt köşeye gidin ve düğmesine "ON" Isıtıcı tıklayın. 200 ° C'ye ulaşması sprey haznesi manto için yeterli zaman tanımak için ısıtıcı üzerinde istenilen zaman önce en az 15 dakika çevirin
MilliQ su ile dolu taze bir şırınga ile şırınga pompası beyaz Norm-JECT 3 ml şırınga değiştirin.
Nebulizatör Temizleme. Küçük sıvı giriş portu ve büyük gaz giriş noktası hem de 5 ile% citranox 2-3 kez çekmek için şırınga ve tüp kullanarak nebulizatör Backflush. MilliQ su t su tutmanın tekrarlayınrezidüel citranox kaldır o.
CyTOF ön panelindeki ışıklar Şekil 1'deki gibi yandığını teyit için kontrol edin.

figure-protocol-1192
Almadan önce Şekil 1. CyTOF paneli ışıkları.

Argon gazı tank valfini açın. Bu açmak için ön "ARGON" ışığı neden olmalıdır.
Gaz girişi makyaj nebulizatör takın. Sökün gaz boru sistemi bağlayıcı makyaj ve siyah kauçuk o-ring ve beyaz konik plastik parça kaldırın. Nebulizer gaz giriş noktası kök üzerinde daha geniş bir "knuckle" unutmayın. Gaz giriş noktası konektörü yerleştirin. Gaz bağlantı ucuna siyah o-ring yerleştirin ve liman kök geniş kısmı geçmiş o-ring zorlamak. Make-up gaz boru üzerine beyaz konik plastik işaret dar ucu ile üst parça ve vida yerleştirin.
Sıvı giriş hortumuna nebulizatör takın. Dikkatle nebulizer sonunda deliğe küçük boru yerleştirin. Bir mikropipet üzerinde durur hissediyorum benzer iki durak olacaktır. Eğer ışık direnci karşılayacak kadar Birincisi, basın; küçük hortumun ucu cam düz bölüm sonunda olmalıdır. İkincisi, uydurma içine daha fazla camın düz bölüm sonuna zorlamak için sert basın ve mühür rakoru sıkın. Isıtma manto beyaz boşluğa nebulizer sokun.
Enstrüman Setup penceresinin RFG Kontrolörü sekmesinde, "Başlat Plazma" tuşuna basın. Nebulizatör önceden takılmış olduğundan, "OK" tuşuna basın. Yazılım, chiller açın gaz akışını başlatmak ve bir plazma tutuşturmak olacaktır. Dedektör gerilimi kadar rampa olacak. Bittiğinde "Plazma başlangıç süreci başarıyla tamamladı" söyleyerek bir pop-up penceresi olacak; basın "Tamam". Yeni ışıkları (Şekil 2 ön panelde olmalıdır >).

figure-protocol-2857
Şekil 2. Plazma ateşlenir ve start-up başarıyla tamamlandı CyTOF paneli ışıkları sonra.

Şırınga pompası açma. Sağ üst köşesinde, şırınga pompası başlatmak ve borular yoluyla sıvı akan ve nebulizatör dıarıya başlamak için yeşil "play" tuşuna basın. Varsayılan şırınga ayarları 3 mL su içindir. Bu su bittiğinde örnek örnek döngü akan edilmesi için için, şırınga pompası belirli aralıklarla değiştirilmesi gerekir. Ekranın üst kısmında, sıvı şırınga pompası dışarı akıyordu ne kadar gösteren bir sayaç var. Şırınga pompası bu sayaç şırınga sonunda isabet "3000" ya da piston ulaştığı zaman durur. Şırınga doldurma zaman, "dur" yerine sayacını sıfırlamak için mavi "pause" düğmesine vurmalıdır.

Kitle Sitometre e "> 2. Günlük Kalibrasyon

Kitle sitometresinin kalibrasyon önce sıcak, kararlı plazma elde etmek için yaklaşık 20 dakika gerekir. Yüksek değerin% 3 altında sinyal; ayar adımların amacı "Gd155" (La139 + O16 oksit) tutarak Tm169 veya Tb159, istenen sinyali maksimize etmektir. Veri Toplama Ayarları penceresini açmak için Acquisition Ayarlar düğmesini tıklatın. Analitler sekmesinde, izotop seçim panelini açmak için periyodik tabloyu tıklatın. Kılavuzunda listelenen DVS Bilimleri ayarlama çözüm izotoplar seçin, ardından "Kaydet" düğmesini tıklatın.
Okuma penceresi Başına Kütle (es) açmak için düğmeye Okuma Başına İzotoplar tıklayın. Yeni bir numara girerken ve "enter" tuşuna basarak "Bakliyat Count" ve rescale y ekseni seçin.
Ayar solüsyonu ile yeşil 1 ml Norm-jesi şırınga doldurun. "LOAD" için örnek bağlantı noktası düğmesini çevirin, tuning çözüm 450 ul enjekte, sonra "eklemesine" düğmesini çevirin. Veri Acquisit ve Kütle Kalibrasyonu sekmesindeki iyon Ayarlar penceresinde, kitleler tarafından akan hangi izlemek için "Çalıştır" tuşuna basın. Sağ tarafta yüksek kütle ise, pencerenin sol tarafında, düşük değerli bir kütledir. Not: önceden argon gazı içinde ksenon izotopları (Şekil 3) bağlı TOF 9400-9800 bölgede sinyalleri olacaktır. Akort çözüm izotoplar Bu ekranda çizgiler (Şekil 4) gibi görünmeye başlayacaktır kadar bekleyin.

figure-protocol-5177
Yıkama solüsyonu ve su durulama sonra çeşitli izotopları için arka plan düzeyini gösteren Şekil 3. Kütle kalibrasyon sekme penceresi,. TOF 9400-9800 çevresindeki bölgeye argon gazı xenon izotoplar karşılık gelir ve her zaman mevcut olmalıdır. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

4 "src =" / files/ftp_upload/4398/4398fig4.jpg "/>
Şekil 4. Kütle kalibrasyon sekme penceresi, DVS ayarlama çözüm çeşitli izotopları dikey çizgiler gösteren. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

Penceresi Okuma Başına Kütle (es) geri dönün ve sol üst köşede yeşil "Oynat" düğmesine basın. Adım 2.1 'de seçilen her izotop farklı bir renkli çizgi ile temsil edilir. Varsayılan x-ekseni sn, "Zaman" dır. Onlar sabit oluncaya kadar farklı izotopların düzeyleri izleyin.
Akım ayarlama. Veri Toplama Ayarları penceresinin Parametre sekmesinde, açılan menüden "Current" seçeneğini seçin. = 0, bitiş = 10, adım değeri = 0.5, yerleşme zamanı = 200 başlayalım ve "Kaydet" tuşuna basın. Okuma pencere ve hit oyun Başına Kütle (es) geri tıklayınız. X-ekseni şimdi "Güncel" dir. Not nerede izotopları zirve (Şekil 5), ve r sinyalleri ecord. Enstrüman Setup penceresinin DAC Kanallar Kurulumu sekmesi altında, "Mevcut" aşağı ilerleyin ve bu yeni bir değer girin. Basın "Gerçek akım değeri ayarlama", sonra "Kaydet".

figure-protocol-6968
Şekil 5. Akım ayar profili.

Makyaj gaz Tuning. Açılır menüsüne gidin "Make-up gaz." = 0.95, adım değeri = 0.05, yerleşme zamanı = 200 = 0.55, son başlayalım. Kaydetmek basın. Okuma pencere ve hit oyun Başına Kütle (es) dönün. X-ekseni şimdi "Make-up gaz" akış oranıdır. Kayıt burada izotopları tepe sinyaller. Sonuna "Gd155" sinyali (Şekil 6) hızlı artış dikkat edin. DAC Kanallar Kurulum sekmesine dönmek için "Make-up gaz" aşağı ilerleyin ve bu yeni bir değer girin. Basın "Gerçek akım değeri ayarlama", sonra "Kaydet".

ŞEKIL 6 "src =" / files/ftp_upload/4398/4398fig6.jpg "/>
Şekil 6. Make-up gaz ayar profili.

Kaydedilmesi oranı izotop vs oksit istenen. Ayarlama çözüm ikinci bir 450 ul enjeksiyonu olun. Parametre sekmesinde, açılan menüden "Time" öğesini, süre = 200 yerleşmeden, = 0, bitiş = 10, adım değeri = 1 başlayalım. "Tasarruf" a basın. Penceresinde Okuma Başına Kütlesindeki "play" (es) Hit. Hatları (Şekil 7) stabilize sonra, Tm169 veya Tb159 (daha yüksek bir değer) için üst sol kutulara değeri okumak için imleci kullanımı ve ayrıca "Gd155" değeri (daha yüksek bir değer arasında <% 3). Bu değerler aynı zamanda ileride bir ayar dosyasına kaydedilebilir.

figure-protocol-8477
Şekil 7. Akım ve Make-up gaz optimize sonra ayar çözümü sinyal intensitesi ölçümü.

Sam temizlenmesiple döngü. DVS Yıkama Çözeltisi 500 ul ardından, örnek döngü MilliQ 3 mL su enjekte edilir. Kütle Kalibrasyonu sekmesindeki "run" düğmesine basarak temizleme ilerleme izleyin. Çizgiler yoğunluğunu (Şekil 4) arka plan düzeyleri (Şekil 3) aşağı kadar MilliQ su ve monitör 3 ml uygulayın, sonra azalmaya başlayana kadar yıkayın.

3. Koşu Örnekleri

Toplama penceresini açın. Varsayılan ayarlar:-The-Fly Analizi = Do = Çift, Çift Sayım Kalibrasyon = Veri Analiz Sinyal. Gürültü Azaltma seçilir. İstenirse, bu herhangi bir değiştirilebilir. Dosya adını girin. Tüm dosyaları E :/ / diskinize GEREKIR.
Edinimi Gecikmelerin ayarlanması. Örnek döngü ve nebulizatör arasındaki boru uzunluğu nedeniyle yaklaşık 30 sn hücre olayları kaydederken bir gecikme olacaktır. Bu nedenle, toplam "Toplama gecikmesi" toplam ve "Dedektör styetenek gecikmesi ", en az 30 saniye olmalıdır. Detektör kararlılık gecikme en az 20 saniye olmalıdır.
Veri toplama süresinin ayarlanması. "Toplama zaman" size örnek çalıştırmak istediğiniz saniye sayısıdır. Tüm 450 mikrolitre numune döngü Dolum 600 sn tamamlamak için gerektirir. Bu 50-100 sn numune taşınmasını en aza indirmek için çalışma süresi sonuna eklenecek önerilmektedir.
Örnek yeniden süspanse. Makine içinde tuzların birikmesi en aza indirmek için, MilliQ su içinde son bir yeniden süspansiyon, ardından hücre boyama sonunda, MilliQ su içinde en azından iki yıkamadan yapılması önerilmektedir. MilliQ su hacmi pelet Eğer ile başladığı hücre ile tüm boyama işlemi sonrası iyileşme hücre sayısına bağlı olarak değişecektir hücre süspansiyonu kullanılır. Iyi bir başlangıç yeri 10 ⁶ (başlangıç) hücre / ml 'dir. Tabanda sonra, agrega kaldırmak için bir hücre süzgecinden filtre.
Başlangıç örnek çalıştırın. Geçerli örnek için yeni bir dosya adı girin. , "LOAD" örnek enjekte, Toplama penceresinde o vurdu "Çalıştır" "INJECT" geri dönmek için örnek döngü valfi açın.
Hücre olayları kaydediliyor. Hücreler her dikey izotop / işaretleyici kanalı (Şekil 8) işaretleri yatay koleksiyonları gibi anlık penceresinde temsil edilecek. Kitle sitometresinin 1.000 hücre / sn kayıt olurken, hücre olaylar arasında daha iyi çözünürlük, genellikle 300-500 hücre / sn elde edilir. Bu ~ 1 hücre / ekran tazeleme bir ortalama karşılık gelir. Hücre olay sayacını tırmanmaya başlamadan önce yaklaşık 30 saniye kadar sürebilir. Bu "On-the-fly" veri işleme nedeniyle, herhangi bir hücre olay bilgileri kaybolur.

figure-protocol-11379
Şekil 8. Örnek sırasında Kazanç penceresi üç ayrı hücre olaylar ile ilişkili öğelere karşılık gelen noktalar yatay satırları gösteren, çalışıyor.ww.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig8large.jpg "target =" _blank "> büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın.

Hücre olayların Kalitesi. Her bir izotop kanal, aynı zamanda, hücre olay oranında çizgiler Herhangi bir arka plan dikkat edin. Kitle sitometresinin bir arka plan üzerinde sinyal belirli bir artış olarak "hücre olay", yani serbest metal veya ilişkisiz antikor "hücre olayı" sayısı değiştirebilir arka plan sinyali tanır. Ayrıca, çok yüksek bir konsantrasyonda hücrelere çalışan çifti olay daha fazla sayıda neden olabilir. Arkaplan ek yıkar veya daha hücre seyreltme ile azalmış olabilir. Çiftlerin artan çalışma zamanı pahasına, büyük hücreli seyreltme ile minimize edilebilir.
Örnek veri toplama tamamlanması. Toplama zamanı ulaşıldığında, veri toplama sona erecektir. Ile bir pop-up penceresi önce biraz gecikme olacak "Tamam" düğmesi belirir ve yine bu "On-the-fly" veri işleme kaynaklanmaktadır. Örnek satın alma aynı zamanda Premat durdurulabilirurely "Stop" düğmesine basarak. Bu durumda, zaten kayıtlı tüm hücre olaylar çıktı dosyalarına sayılır ve işlenecektir.
Her numune arasındaki MilliQ su en az 500 ul Enjeksiyon ayrıca numune taşınmasını en aza indirir.

4. Kullanım sonrası Temizleme Makinesi

Çözüm yıkayın. Son örneği çalıştırın ve su ile yıkanmalıdır örnek döngü örnek döngüye yıkama solüsyonu 450 ul enjekte edildikten sonra. Adım 2.8 olarak Veri Toplama Ayarlar penceresinde (Şekil 9) Kütle Kalibrasyonu sekmesindeki serbest metal serbest izleyin. Serbest metal sinyali azalmaya başladığında, MilliQ 3 mL su ile yıkayın ve arka plan düzeyi elde edilinceye kadar izlenmesi.

figure-protocol-13399
DVS Yıkama solüsyonu ile post-run temizlik sırasında Şekil 9. Kütle kalibrasyon sekme penceresi,. TOF bölgede 9800-11000 yılında dikey çizgiler makineden temizlendi antikor-etiket izotopları vardır. TOF 11500 çevresindeki dikey çizgiler iki Ir enterkalatörün izotopu karşılık gelir. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .