Uzun süreli, yüksek çözünürlüklü Konfokal Time Lapse Görüntüleme<em&gt; Arabidopsis Kotiledon</emÇimlenme sırasında&gt; Epidermis

Özet

Biz stoma farklılaşma belgeleyen, gelişme birkaç gün içinde epidermis konfokal görüntüleme için bitki kotiledon hareketsiz odası slaytlar ve medya kullanarak bir protokol açıklar. Fluorofor etiketli proteinlerin hücre bölünmesi ve hücre tipi farklılaşması esnasında olası rollerini anlamayı arttırıyor, ifade ve hücre içi lokalizasyonu dinamik izlenebilir.

Özet

Gelişimsel bir sıra boyunca hücresel davranışı in vivo dinamiği Görüntüleme doku desenlendirme mekaniğini anlamak için güçlü bir teknik olabilir. Hayvan gelişimi sırasında, anahtar hücre çoğalması ve desenlendirme olaylar çok hızlı bir şekilde ortaya çıkar. Örneğin, Caenorhabditis elegans larva vücut planı için gerekli tüm hücre bölünmeleri yedi mitotik çevrimleri ^1, döllenmeden sonra altı saat içinde tamamlanır; Drosophila embriyo on altı veya daha fazla mitoz az 24 saat ² görülür. Buna karşılık, bitkisel gelişimi sırasında hücre bölünmesi, genellikle günde bir ^3,4,5 düzeni üzerinde, yavaştır. Bu eşsiz bir meydan okuma ve hücre bölünmesi ve bitki organogenez sırasında farklılaşma olayları dinamik davranışları belgelemek için uzun vadeli canlı görüntüleme için bir ihtiyaç yüklemektedir. Arabidopsis Epidermis araştıran sinyalizasyon, hücre kaderinin ve bitkilerin gelişim için mükemmel bir model sistemi. Kotiledon, bu doku oluşur hava ve eşit dağıtılmış stoma serpiştirilmiş suya dayanıklı kaplama hücreleri, vanalar açılır ve gaz değişimi ve su kaybı kontrol yakındır. Bu stoma Uygun aralık kendi işlevi için önemlidir ve onların gelişimi asimetrik bölünme ve organize epidermis (Şekil 1) üretmek için hücre farklılaşması bir dizi adımı izler.

Bu protokol, gelişme birkaç gün boyunca hücreleri ve epidermis içinde proteinlerin gözlem izin verir. Bu zaman çerçevesi kök hücre bölünmeleri ve stoma ve epidermal kaldırım hücreleri de dahil olmak üzere epidermal hücrelerin farklılaşma hassas belgelere sağlar. Floresan proteinleri hücre bölünmesini ve farklılaşmasını işlemleri sırasında dinamik değerlendirmek için ilgi çekici proteinler oluşturacak şekilde eklenebilir. Bu teknik, th stomatal-soy hücrelerinin proliferasyonu aşaması sırasında, bize yeni bir protein, POLAR ⁶ lokalizasyonu anlamak olanak tanırasimetrik bölünme olayları ve bölünmesi meydana kısa bir süre önce hücre korteksin karakteristik bir alana hamle önceki hücrelerde ifade edilir e Arabidopsis kotiledon epidermis. Görüntüleri kayıt ve akıcı görüntü kolaylıkla zamanla değişebilir gibi dinamik protein lokalizasyonu ve hücre tipleri görselleştirmek için kamuya açık yazılımı kullanılarak üretilebilir.

Protokol

1. Tohum Sterilizasyon

1. % 33 ev tipi çamaşır suyu,% 0.1 Triton X-100: Tohum sterilizasyon çözeltisi hazırlayın.
2. İstenen flüoresan raportör yapı (lar) ve genotip (ler) 1.7 ml tüp içinde ve sterilizasyon çözeltinin 1 mL'si uygulamak taşıma il tohumlar. 15 dakika nutator inkübe edin.
3. Steril bir başlık olarak, geride tohum bırakarak, tüpten sterilizasyon çözüm kaldırmak için bir pipet kullanın. 1 ml steril su ile durulayın. Dört kez tekrarlayın.
4. İki veya daha fazla gün boyunca 4 ° C'de inkübe edin.

2. Oda Slide Ortam hazırlanması

1. Çözünene kadar Bacto bir 200 ml şişeye, su içinde Agar (saf olmayan agaroz), ve mikrodalga% 0.5 çözelti 20 ml karıştırılır. Çözüm kaynar dikkatli olun.
2. Yaklaşık 60 ° C ile çözelti soğutulur
3. Bir pipet ile agar solüsyonu 1 ml toplayın ve yavaşça odasına slayt (Lab-Tek II Chambered # 1.5 Almanca coverglass Sistemi) iç cam kapak için geçerlidir. Çözüm which çok sıcak ya da yapıştırıcı veya çatlak cam eritmek olabilir çok hızlı uygulanır.
4. Hemen agar çözeltisi bir ikinci ml eklenir. Agar ortamı artık tamamen slayt bölmesinin alt kapsamalıdır. Bu minimal ortam nem korumak ve gaz difüzyon vererek dört ila beş gün için saklanan besin içeren bir bitki kotiledon, in gelişimini desteklemek için yeterlidir.
5. Odası ile benchtop Cool slayt kaplıdır. Şişeyi sıkıca kapalı ise, çözümü kaydedilir ve gelecekteki kullanım için ısıtılmış olabilir.

3. Tohum Diseksiyon

1. 4 ° C depolama steril tohum borusunu sökün.
2. Diseksiyon mikroskop sahnede bir kağıt mendil koyun ve su ile nemlendirin. Pürüzsüz bir yüzey oluşturmak için doku ayarlayın. Doku diseksiyon için tohum stabilize etmek için kullanılır.
3. Tüpten dokuya Pipet 20-30 tohum, görüş diseksiyon kapsamı tarlasında yerleştirmek için dikkatli olmak.
4. Keskin forseps (Roboz, # 5 biyoloji ucu) kullanma, Dikkatle fide içeriden çiğit çıkarın. Dış ve iç iki integuments kaldırılması gerekir.
5. Zaman görüntüleme kotiledon, bu hipokotil ve radikula kaldırmak için faydalıdır. Kotiledonlar Bu protokol kapsamında birkaç gün geliştirmek için yeterli besinleri içerir. Sağlam olursa, hipokotil görünümünün zaman atlamalı alan kotiledon dışarı taşıyarak, dramatik düzeltin ve uzatacaktır. Hipokotil ücretsiz kotiledon dilim için bir neşter kullanın.
6. Bir mikrotüp veya benzeri, suya disseke kotiledon tutun.
7. Kotiledon istenen sayıda ulaşılana kadar 3.4-3.6 tekrarlayın. 15-20 başarılı diseksiyonlar montaj yapılması tavsiye edilir.

4. Odası Slayt Montaj Kotiledonlar

1. Bir küçük (18 mm ²⁾ kapak kayma, agar besiyerinde kesti ve odasına slayt cam tabanından tüm katmanın yukarı kaldırın kullanma.
2. Pipet tutarak suyun minimum kotiledon dissekekaldırdı agar tabakasının altında odasına slayt içine tüp.
3. Yavaşça kotiledon üzerine agar indirin. Fazla su varsa, kotiledon rahatsız etmemek için dikkatli olmak, bir doku ile uzak ıslatın. Montaj tamamlandığında numuneler artık kolayca hareket etmelidir.
4. Odasına slayt ve mikroskop sahne için hareket slayt kapağı yerleştirin.

5. Time Lapse Görüntüleme

1. Görüntü istenen fluorofor (ler) için ters konfokal mikroskop ayarlayın. Kullanılan LSM700 parametreleri: GFP, 440-530 nm'de filtre band pass ile 488 nm ve toplama uyarma; RFP, 570-610 nm'de filtre band pass ile 555 nm ve toplama uyarma için.
2. Hasar monte örnekleri inceleyin. Sağlam bir yerleri programlayın, düzgün mikroskop yazılım içine kotiledon monte. Zen 2009 yılında: 20x objektif ile kotiledon odaklanın ve oda slayt merkezine amacı taşımak. Toplama Modu altında, 0.5 Zoom değiştirebilir ve Çerçeve Boyutu <48x48 piksel / em>. Pozisyonlar altında Pozisyonlar onay ve Tarama genel görüntü ... düğmesini seçin, sonra 30-35 Yatay ve Dikey kiremit sayısını artırmak. Tarama tamamlandığında, gözlemlemek için her kotiledon az Boyutlar sekmesinde yer ve crosshair'i altında Pozisyonlar düğmesini tıklatın.
3. Tüm samples.In Zen 2009 kotiledon epidermisin kapsayan z serisi ayarlayın: Z-Stack onay kutusunu tıklatın. Görev Listesi altında her bir pozisyon seçin ve düğmesini Taşı tıklayın. Kotiledon epidermisin üst düzlemi odaklanın ve Z-Stack altında Set İlk düğmesini tıklatın. Epidermis yararlı görünür olduğu en düşük konuma Odak ve Set Son düğmesini tıklatın. Ayarlamak için en iyi z-kesit kalınlığı gösteren, Optimal yanındaki düğmesini tıklatın. Bu ayarları tüm örnekleri kapsayacak onaylamak için her kotiledon kontrol edin; z parametreleri indiv için ayarlanamazZen, 2009 yılında idual pozisyonları.
4. İstediğiniz çözünürlüğü ve uzunluk zaman serileri ayarlayın. Üç gün için 15-30 dakika aralıklarla epidermal hücre bölünme protein dinamik için etkilidir. Bu aralık gerektiğinde değiştirilebilir. Zen 2009 yılında: Zaman Serisi onay kutusunu tıklatın. Zaman Serisi altında, metin alanına kaymak veya yazarak kullanarak istenen görüntü sayısı için döngüleri ayarlayın. 30 Aralık ayarlayın ve min seçmek için açılan menüyü kullanın.
5. Xyzt çok pozisyonlu tarama başlayın. Konumların sayısını tarama özellikleri ile sınırlı olması gerektiğine dikkat ediniz; toplam tarama süresi, istenen aralığından daha büyük olduğu takdirde, zaman noktası doğru olmayacaktır. Görüntüleme GFP ve TTT 59 bir 30 dakikalık aralıklarla z-dilim sistemimiz kullanırken aynı anda altıya pozisyonların maksimum mümkündür. Zen 2009 yılında: Değişim Çerçeve Boyutu istenen çözünürlük ve Başlat Deney tıklatın.

6. Video Düzenleme

1. Konfokal veri dosyası itibaren, maksimum yoğunluğu TIFF gibi kayıpsız bir format içinde görüntü dosyaları gibi her zaman / konum birleşimi ve ihracat z-projeksiyon yapmak. Dosya adları, bir film onları birleştirmek için yazılım için pozisyon başına bir dizi (örneğin, POLAR-GFP_0001_pos1, vb, POLAR-GFP_pos1_0001, POLAR-GFP_pos1_0002 değil) olmalıdır. Zen 2009 yılında: Kullanımı: Kopyala ardından ayrı dosyalar Maksimum Yoğunluk Projeksiyonu içine pozisyonları bölmek İşleme sekmesi altında Altküme. (: - Serisi İhracat, Tam çözünürlüklü görüntü penceresinde Dosya) Nihayet, TIFF gibi ihracat.
2. BUnwarpJ makro ⁹ (: Kayıt: bUnwarpJ Plugins) çalıştırarak ardışık görüntüleri hizalamak için FIJI ^7,8 kullanın. Mono Kayıt Modu değiştirin. Tüm Gelişmiş Seçenekler varsayılan değerleri kullanabilirsiniz. Uzun zaman atlamalı dizileri için, indirmek ve kurmak makro "Afin + Tutarlı Elastik 2D Görüntü Kaydı," görüntülerin otomatik olarak bir dizi bUnwarpJ geçerli olacak ve açık yDosya kullanarak bizim veriler: İthalat: kullanmak için Görüntü Sırası. MOPS görülecek ekstraksiyon ve çalışma işaretini kaldırın.
3. Hizalanmış görüntüler dizisini açın ve istediğiniz video formatı (AVI iyi bir seçimdir) kaydetmek FIJI / ImageJ veya Quicktime Pro kullanın.

Sonuçlar

Bu yöntem ile elde bilgilendirici zaman noktalarında bir dizi Şekil 3 'de gösterilmiştir. Hücre zarları RFP (pm-rb) ve GFP 30 dk zaman ölçeğinde (POLAR :: POLAR-GFP) onun yerli promotör altında POLAR protein ⁶ birleşmesini ile etiketlenir, biz protein yerelleştirme değişiklikleri ile birlikte hücre bölünmeleri bakın kendilerinden önceki. Asimetrik hücre stoma soyu şeklinde bölünmeler kök hücre benzeri daha asimetrik bölünme geçmesi yeteneği ko...

Tartışmalar

Bu hızlandırılmış konfokal teknik fluoresan etiketli protein ekspresyonu Kutup ve başka dinamik olarak değişen bir protein halinde kendi işlevini uygun bir anlaşılması için önemli olan Arabidopsis kotiledon epidermis, bireysel hücrelerin içinde lokalizasyon uzunlamasına çalışmalar izin verir. Önceden, sürekli zaman atlamalı görüntüleme Arabidopsis kök mantar enfeksiyonu ¹¹ ve meristem büyüme ^5,12 incelemek için kullanılan, ancak kotiledon epidermisin...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı	Şirket	Katalog Numarası	Yorumlar
Bacto Agar	BD	214010
Tek odacıklı slayt	Nunc (Thermo Scientific)	155360	Ya da iki odacıklı (155.379)
Lazer tarama konfokal mikroskop	Zeiss	LSM700	Zen 2009 yazılımı
20x objektif lens	Zeiss	420650-9901	NA 0.8, Plan-APOCHROMAT
Mikroskop Diseksiyon	Benz (Ulusal)	431TBL	Alttan yanar
# 5 forseps, biyoloji ucu	Roboz Cerrahi Alet	SC-4978	Çok ince ipuçlarıkritik