Genomik DNA 5-hydroxymethylcytosine seçici Yakalama

Özet

Açıklanan kolay ve yoğunluk bağımsız zenginleştirme için bir biyotin bağlayıcının aktarmak tıkırtı kimya ve ardından, 5-HMC için bir azit-glikoz aktarmak için β-glukoziltransferaz (β-GT) ile iki aşamalı bir etiketleme bir işlemdir. Bu etkili ve spesifik bir etiketleme yöntemi nesil dizileme ile son derece düşük arka plan ve yüksek verimlilik epigenomic haritalama ile 5-HMC zenginleşmesine olanak sağlar.

Özet

5-metilsitozin (5-mC) insan genomik DNA'daki toplam sitozinler arasında ~% 2-8 oluşturan ve gen ekspresyonu, genom bütünlüğünün korunması, ebeveyn baskılama, X kromozomu inaktivasyonu, düzenlenmesi de dahil olmak üzere biyolojik fonksiyonları, geniş bir yelpazede etkiler gelişme, yaşlanma ve kanser ^1. Son zamanlarda, bir okside 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-HMC), varlığında embriyonik sap (ES) hücreleri ve nöronal hücreler ^2-4, özellikle de memeli hücrelerinde tespit edilmiştir. 5-HMC TET aile demir (II) / α-ketoglutarat-bağımlı dioxygenases ^{2, 3} ile 5-mC katalizli oksitlenmesi ile elde edilir. 5-HMC embriyonik kök (MES) hücre normal hemopoeziste ve maligniteler ve zigot gelişimi ^{2, 5-10} bakımı dahil olmak üzere önerilmiştir. Iyi 5-HMC fonksiyonunu anlamak için, güvenilir ve kolay sıralama sistemi esastır. Geleneksel bisülfit dizileme 5-mC ¹¹ 5-HMC ayırt edemez 12 glikoz parçası ekler bir bakteriyofaj enzim yararlanarak, etiketlemek ve 5-HMC yakalamak için oldukça etkili ve seçici kimyasal bir yaklaşım geliştirdik.

Burada 5-HMC seçici kimyasal etiketleme için basit bir iki aşamalı bir prosedür açıklanmaktadır. Birinci adımda etiketleme, genomik DNA 5-HMC 5-HMC için 6-azit-glikoz aktaran bir şekilde, β-GT, T4 bakteriyofaj bir glukoziltransferaz ile bir 6-azit-glikoz katalize ile etiketlenir Modifiye kofaktör, UDP-6-N3-GLC (6-N3UDPG). İkinci adımda, biyotinilasyon, bir disülfid biyotin linker klik kimyası ile azid grubu eklenir. Iki adım genomik bölgelerde 5-HMC bolluğu bakılmaksızın etiketlenmesi ve son derece düşük arka plan vererek tamamlamak için lider, son derece spesifik ve etkili. 5-HMC takibi biyotinilasyon, 5-HMC içeren DNA parçaları daha sonra seçici yakalanırbir yoğunluk-bağımsız bir şekilde streptavidin boncuklar kullanarak. Sonuçta ortaya çıkan 5-HMC-zenginleştirilmiş DNA fragmanları, yeni nesil dizi analizi de dahil olmak üzere aşağı akım analizleri için kullanılabilir.

Bizim seçici etiketleme ve yakalama protokol çeşitli / değişken 5-HMC bolluğu ile genomik DNA herhangi bir kaynak için geçerli yüksek hassasiyet, bahşeder. Bu protokolün amacı ve mansabındaki uygulaması (yani., Yeni nesil dizileme genomunda 5-HMC dağıtım haritaya) olsa da, tek-molekül, bir gerçek zamanlı SMRT (DNA) dizi ile uyumlu 5-HMC tek-baz çözünürlük sıralama sunma yeteneğine.

Protokol

1. Genomik DNA Parçalanma

İstediğiniz bir boyut aralığına sonication kullanarak Fragment genomik DNA genom dizileme platformu için uygundur. (Genellikle ~ 300 bp ile sonikasyon.)% 1 agaroz jel (Şekil 1) üzerinde dağınık genomik DNA'nın boyutu dağılımı kontrol edin.

2. DNA Preparation

Genomik DNA 5-HMC bolluğu dayalı başlayarak DNA miktarları belirleyin. 5-HMC düzeyleri farklı doku tiplerinin anlamlı farklılık olduğu, başlangıç ​​DNA miktarları numunelerin 5-HMC seviyeleri bağlıdır. Örnekler için Tablo 1'e bakınız.

3. β-GT katalizörlü reaksiyonu (Glikoz Transferi Reaksiyon)

1. 1 saat için bir 37 ° C su banyosu içinde Tablo 2 ve inkübe de gösterildiği gibi, karışım pipetleme ile karıştırın.
2. Inkübasyondan sonra, DNA 10 mg başına kullanarak, QIAquick Nükleotid Kaldırma Kiti ile reaksiyonu temizlemeksütun. Kolon başına 30 ul su Zehir ve birleştirir.

4. Biyotinilasyon Reaksiyon (Tıklayınız Kimya)

1. 150 uM'lik bir son konsantrasyon (yani, 30 ul DNA solüsyonu başına çözelti çalışma 5 ul) ile yıkandı, DNA çözeltisi (adım 3) içinde DBCO-SS-PEG3-Biotin konjugat çalışma çözeltisi (1 mM) ilave edilir.
2. 2 saat boyunca 37 ° C su banyosunda pipetleme ve inkübe Mix by.
3. QIAquick Nükleotid Kaldırma Kiti ile reaksiyonu temizleyin. İdeal toplam elüsyon hacmi 100 ul olduğunu.
4. Mikrolitre ölçekli spektrofotometre (örn., Nanodrop) kullanılarak kurtarıldı DNA miktarını ölçmek.

5. 5-HMC-içeren DNA Yakalama

1. Üreticinin talimatlarına göre 1X B & W tampon 1 ml Dynabeads MyOne Streptavidin C1 50 ul 3 kere yıkayın. Manyetik bir stand ile boncuk ayırın.
2. Kurtarılan biotinlenmiş D 2X & B tamponu eşit hacimde ekleYıkanmış boncuklar NA (100 ul).
3. Bir rotator üzerine nazik rotasyonu ile oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
4. Manyetik bir stand ile boncuk ayırın ve 1X B & W tampon 1 ml boncuk 3 kere yıkayın.
5. Bir döndürücü üzerine nazik dönme ile, oda sıcaklığında 2 saat süreyle taze hazırlanmış, 50 mM DTT 100 ul olarak boncuklar ile inkübe ederek DNA Zehir.
6. Manyetik bir stand ile boncuk ayırın. DTT kaldırmak için üretim talimat doğrultusunda bir Mikro Bio-Spin 6 Sütun üzerine solvent ve yük aspire. Hedef DNA artık çözelti içindedir.
7. EB tamponu 10 ul Qiagen MinElute PCR Arıtma Kit ve elute DNA tarafından önceki adımdaki Elüsyonlanan DNA arındırın. Konsantrasyonunun 20 ng / ul daha yüksek ise Qubit, florimetre veya Nanodrop kullanılarak DNA ölçülmesine imkan verirler. DNA aşağı genom sekanslama kütüphane hazırlanması için hazır hale gelir.

6. Temsilcisi Sonuçlar

Kalite o takdirdef genomik DNA yüksek, β-GT ve biyotinilasyon tepkilerden sonra tipik kurtarma verimleri ~% 60-70 vardır. Ancak, yakalama verim numunelerin 5-HMC seviyelerine bağlı olarak farklı doku tipleri ile önemli ölçüde değişmektedir. Tipik olarak, beyin genomik DNA için yakalama verimliliği ~ 4-9% ve bazı aşırı durumlarda, verimliliği% 12'ye kadar çıkabilir. ES hücreleri için, ortalama yakalama verim sinir hücreleri için ~% 0.5 'e aksine, ~% 2-4 olup. Görülen düşük verim şimdiye kadar kanser hücrelerinden genomik DNA için idi. Tüm zenginleştirilmiş DNA standardının yeni nesil kütüphane hazırlık protokolleri için hazırdır. Buna ek olarak, yakalanan DNA ayrıca, ilgili primerlerin mevcut olduğunda giriş DNA ile karşılaştırıldığında bazı parçalar zenginleştirme tespit etmek için gerçek-zamanlı PCR için şablon olarak kullanılır.

Şekil 1. Içinde sonike insan genomik DNA için BamHI% 1 agaroz jel. 1X TE tamponu, 120 ul, insan iPS hücreleri, izole edilen genomik DNA için 10 ug bir sonikasyon cihazı (Covaris) kullanılarak sonike edildi. Sonikasyon sonrasında sonicated DNA'nın 2 ul sonicated DNA parçalarının boyutları karşılaştırmak için DNA işaretleyici 100 bp ile% 1 agaroz jel üzerine yüklendi.

Bileşen	Hacim	Nihai Konsantrasyon
Su	_ Ul
10 X β-GT Reaksiyon Tamponu	2 ul	1 X
Dakikada 10 mikrogram genomik DNA	_ Ul	Up 500 ul ng /
UDP-6-N GLC 3-(3 mM)	0.67 ul	100 uM
β-GT (40 uM)	1 ul	2 mcM
Toplam hacmi	20 ul

doku genomik DNA (yüksek 5-HMC içeriği>% 0,1) için: i)

Bileşen	Hacim	Nihai Konsantrasyon
Su	_ Ul
10 X β-GT Reaksiyon Tamponu	10 ul	1 X
En fazla 20 mikrogram genomik DNA	_ Ul	Up 500 ul ng /
UDP-6-N3-GLC (3 mM)	1.33 ul	100 uM
β-GT (40 uM)	2 ul	2 mcM
Toplam hacmi	40 ul

ii) kök hücre genomik DNA (ortanca 5-HMC içeriği ~% 0.05) için

Bileşen	Hacim	Nihai Konsantrasyon
Su	_ Ul
10 X β-GT Reaksiyon Tamponu	10 ul	1 X
Up 50 mikrogram genomik DNA	_ Ul	Up 500 ul ng /
UDP-6-N3-GLC (3 mM)	3.33 ul	100 uM
β-GT (40 uM)	5 ul	2 mcM
Toplam hacmi	100 ul

iii) kanser hücresinin genomik DNA (düşük 5-HMC içeriği ~ 0.01% için)

Tablo 1. Giriş DNA ve seçici kimyasal etiketleme yöntemi ile çeşitli 5-HMC seviyeleri ile numuneleri kullanılarak etiketleme reaksiyon miktarı örnekleri.

Örnek	5-HMC düzeyi	Başlangıç ​​DNA (mikrogram)	Işaretlendikten sonra Kurtarma (boncuk giriş) (mikrogram)	Kurtarma verim	Pull-down DNA (ng)	Pull-down verim
Yetişkin fare beyincik	0.4%	10	7.5	% 75	236	3.1%
Postnatal gün 7 fare beyincik	% 0.1 '	11	9	% 82	140	1.6%
Fare ES hücre E14	0.05%	60	42	70%	350	0.8%

Tablo 2. Fare beyin dokuları ve ES hücreleri Temsilcisi sonuçları.

Tartışmalar

Hydroxymethylcytosine 5-(5-HMC) belirli memeli hücre türleri içinde önemli miktarda yeni tanımlanmış bir epigenetik modifikasyon mevcuttur. Burada sunulan yöntem, 5-HMC arasında genom dağılımı belirlemek içindir. Biz 5-HMC bir hidroksil grubu üzerine bir azid grubu ihtiva eden bir mühendislik glikoz yarımı aktarmak için β-glukoziltransferaz T4 bakteriyofaj kullanır. Azid grubu kimyasal memeli genomları 5-HMC içeren DNA parçalarının tespiti, afinite zenginleştirme ve sıralama için biotin ile ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isim	Şirket	# Katalog	Yorumlamak
			Reaktifler
5M Sodyum klorür (NaCl)	Promega	V4221
0.5 M pH 8.0 Ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA)	Promega	V4231
1M Trizma tabanı (Tris) pH7.5	Invitrogen	15567-027)
HEPES 1M pH7.4	Invitrogen	15630
Magnezyum klorür (MgCl2) 1M	Ambion	AM9530g
Dimetil sülfoksit (DMSO)	Sigma	D8418
Tween 20	Fisher BioReagents	BP337-100
DBCO-SS-PEG3-Biotin konjugat	Kimya Araçlar'ı tıklayın	A112P3
1,4-ditiyotretol, son derece saf (DTT) Superpure	Invitrogen	15508-013
QIAquick Nükleotid Kazıma Seti	Qiagen	28304
Mikro Bio-Spin 6 Sütun	Bio-Rad	732-6222
Dynabeads MyOne	Invitrogen	650-01
Streptavidin C1
Qiagen MinElute PCR Arıtma Kiti	Qiagen	28004
Ultrapure Agaroz	Invitrogen	16500500
UDP-6-N 3-glikoz	Aktif Motif	55013
			Enzim
β-glukoziltransferaz (β-GT)	New England Biolab	M0357
			Ekipman
Sonikasyon cihazı	Covaris
Masaüstü santrifüj
Su banyosu	Fisher Scientific
Jel çalışan cihazlar	Bio-Rad
NanoDrop1000	Thermo Scientific
Labquake Tüp Çalkalayıcı	Barnstead
Labquake Tüp Çalkalayıcı	Thermolyne
Manyetik Ayırma Standı	Promega	Z5342
Qubit 2.0 Fluorometre	Invitrogen
			Reaktif kurulum 10 X β-GT Reaksiyon Tamponu (500 mM HEPES pH 7.9, 250 mM MgCl2) 2 X bağlayarak ve (10 mM Tris, pH 7.5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl,% 0.02 Tween 20) (B) tampon yıkama .